Extracto
El cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) es agresivo, con un rápido crecimiento y metástasis óseas frecuentes; Sin embargo, su mecanismo molecular detallado sigue siendo poco conocida. Aquí, se presenta el papel crítico del factor de crecimiento temprana 4 (EGR4), un dedo de zinc factor de transcripción de unión a ADN, en la proliferación de células de SCLC. EGR4 sobreexpresión en células HEK293T confirió upregulation significativo de variantes de empalme específicas de la proteína relacionada con la hormona paratiroidea (
PTHrP
) de genes, lo que resulta en la mejora de la secreción de la proteína PTHrP, un mediador conocido de la metástasis ósea osteolítica. Más importante aún, el agotamiento de los
EGR4
expresión de siRNA crecimiento suprimió de forma significativa de las líneas celulares de SCLC, SBC-5, SBC-3 y NCI-H1048. Por otra parte, la introducción de
EGR4
en células NIH3T3 significativamente mejoradas crecimiento celular. Se identificaron cuatro
EGR4
genes diana,
SAMD5
,
RAB15
,
SYNPO
y
DLX5
, que fueron los más significativamente genes regulados negativamente sobre el agotamiento de los
EGR4
expresión en todas las células de SCLC examinados, y demostró la contratación directa de EGR4 a sus promotores de chip y el análisis de luciferasa. Notablemente, desmontables de la expresión de estos genes por siRNA notablemente suprimió el crecimiento de todas las células de SCLC. Tomados en conjunto, nuestros resultados sugieren que EGR4 probable que regula la metástasis ósea y la proliferación de las células de SCLC través de la regulación transcripcional de varios genes diana, y por lo tanto puede ser un objetivo prometedor para el desarrollo de medicamentos contra el cáncer para pacientes con SCLC.
Visto : Matsuo T, Dat LT, Komatsu M, Yoshimaru T, Daizumoto K, Sone S, et al. Respuesta (2014) Crecimiento Temprano 4 está implicada en la proliferación de células de cáncer de pulmón de células pequeñas a través de activación transcripcional de sus genes aguas abajo. PLoS ONE 9 (11): e113606. doi: 10.1371 /journal.pone.0113606
Editor: John D. Minna, Univesity de Texas Southwestern Medical Center en Dallas, Estados Unidos de América
Recibido: 4 Agosto, 2014; Aceptado: 27 Octubre 2014; Publicado: noviembre 20, 2014
Derechos de Autor © 2014 Matsuo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el futuro de investigación avanzada de la Universidad de Tokushima. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es uno de los cánceres más comunes, y su incidencia está aumentando en todo el mundo [1]. La alta mortalidad y mal pronóstico del cáncer de pulmón son el resultado de las dificultades en el diagnóstico precoz y su alto potencial metastásico. El cáncer de pulmón se clasifica en dos tipos principales, cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) y el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), que representan aproximadamente el 25% y el 75% de los casos, respectivamente. SCLC presenta con un comportamiento clínico agresivo que se caracterizan por un rápido crecimiento y metástasis frecuentes al cerebro, pulmón, hígado y médula [2]. En particular, la metástasis ósea puede causar complicaciones graves en el CPCP y puede conducir a dolor óseo, fracturas patológicas, hipercalcemia, compresión de la médula espinal y otros síndromes de compresión nerviosa [3], [4], y que a menudo se asocia con una alta morbilidad y de mal pronóstico. Los tratamientos actuales son generalmente paliativo. Por lo tanto, es muy importante para prevenir y tratar las metástasis óseas osteolíticas
metástasis de hueso ha sido generalmente clasificado como osteolítica, lo que lleva a la destrucción del hueso.; osteoblástica, lo que lleva a la formación de hueso nuevo; o mezclado basado en el mecanismo principal de la interferencia con la remodelación normal del hueso. La actividad equilibrada de osteolíticas y osteoblásticas factores se cree que regulan la metástasis ósea [4], [5]. Recientemente, se ha informado de varias moléculas para jugar un papel importante como factores osteoblásticas implicados en osteoformation [4] - [6]. Sin embargo, los mecanismos precisos responsables del crecimiento del tumor en los huesos permanecen sin explorar.
transcriptómica integrales confieren una caracterización precisa de los cánceres individuales que deben ayudar a mejorar las estrategias clínicas para enfermedades neoplásicas, mediante el desarrollo de nuevos fármacos. Por lo tanto, "ómicas" enfoques tecnológicos son eficaces para la identificación de moléculas diana implicados en las vías cancerígenos y metastásicos, incluyendo metástasis ósea. Con este fin, los transcriptómica en todo el genoma humano de SCLC involucrados en la metástasis de órganos se analizó preferencial en ratones, y se encontraron varios genes potencialmente implicados en la metástasis ósea [7]. En este estudio, se centró en la respuesta de crecimiento temprano 4 (
EGR4
), el cual se regula positivamente de manera significativa en los tumores metastásicos del hueso en comparación con otros órganos (metástasis de pulmón, riñón e hígado) derivadas de células de SCLC humanos [7].
el
EGR4
gen pertenece a la familia de crecimiento inicial de respuesta de genes tempranos codifican cuatro factores de transcripción con dedo de zinc, de unión al ADN (
EGR1
a
EGR4
) [8]. Este gen (
pAT133
,
NGFI-C
) se identificó por primera vez como una proteína dedo de zinc-inducida inmediatamente por la estimulación mitogénica en linfocitos T y fibroblastos [9], [10]. Se ha informado de que
EGR4
-null ratones tienen la infertilidad masculina debido a la espermatogénesis detenido pero no se observa la infertilidad femenina [11], [12], lo que sugiere que EGR4 juega un papel crítico en algunos tipos de masculina idiopática humana esterilidad. Por otra parte, EGR4 se sabe que tiene un patrón de expresión-neural específico en ratas [13] y regular el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) mediada por cloruro de potasio específica de neuronas cotransportador 2 (KCC2) transcripción a través de la vía de señalización ERK1 /2 en inmaduro neuronas [14]. Sin embargo, el papel fisiopatológico de EGR4 en la carcinogénesis en SCLC, no se ha dilucidado. En este estudio, mostramos que EGR4 actúa como un activador transcripcional a través de la regulación de los genes específicos aguas abajo en la proliferación de células SCLC.
Materiales y Métodos
Las líneas celulares
El SCLC humana líneas celulares SBC-3 y SBC-5 fueron amablemente proporcionados por los Dres. M. Tanimoto y K. Kiura de la Universidad de Okayama [15]. La línea celular de NSCLC PC14PE6 fue proporcionado amablemente por el Dr. I. J. Fidler del M. D. Anderson Cancer Center [16]. La línea de células SCLC humano NCI-H1048 y humano CPNM líneas celulares A549 y NCI-H1048 se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, EE.UU.). se estableció la línea celular /bone2 ACC-LC319 humana como se describe anteriormente [17]. La línea celular osteoblástica MC3T3-E1 murino subclón 4 fue proporcionado amablemente por Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. (Tokio, Japón). La línea de células epiteliales de la vía aérea pequeña humana (SAEC) se adquirió de Lonza (Walkersville, MD, EE.UU.). Todas las células se cultivaron en condiciones apropiadas.
Plásmido construcciones
toda la secuencia codificante de humano
EGR4
(NM_001965) se amplificó por PCR utilizando KOD plus ADN polimerasa (Toyobo, Osaka, Japón). El producto de PCR se insertó en el
Eco RI y
Xho
sitios I del vector pCAGGSn3FH que contiene una etiqueta FLAG N-terminal. Para plásmidos informadores de luciferasa, fragmentos de ADN de la región 5 'de acompañamiento regiones de
PTHrP-V3
y
V4 gratis (NM_198964.1 y NM_198966.1, respectivamente),
SAMD5
(NM_001030060.2),
RAB15 gratis (NM_198686.2),
SYNPO gratis (NM_007286.5) y
DLX5 gratis (NM_005221.5), que incluyen el potencial de EGR sitios de unión como se predijo por el programa MatInspector (Genomatix, http://www.genomatix.de/matinspector.html), fueron amplificados por PCR y se insertó en los sitios de enzimas de restricción apropiados en el vector pGL3-enhancer (Promega, Madison, WI , ESTADOS UNIDOS). Los conjuntos de cebadores de PCR utilizados en este estudio se muestran en la Tabla S1. Las secuencias de ADN de todas las construcciones fueron confirmadas por secuenciación del ADN (ABI 3500XL secuenciador; Life Technologies, Foster City, CA, EE.UU.).
La extracción de RNA, transcripción inversa, PCR semi-cuantitativa y PCR en tiempo real
La extracción total de ARN, transcripción inversa, semi-cuantitativos de RT-PCR y experimentos de PCR en tiempo real se llevó a cabo como se describe anteriormente [18]. Los niveles de expresión en cada muestra se normalizaron a la
β-actina
contenido de ARNm. Las secuencias de cada conjunto de cebadores se enumeran en la Tabla S2.
Se realizó un análisis de transferencia de Western
Western blot como se describe anteriormente [18]. Después de SDS-PAGE, las membranas de inmunotransferencia con las proteínas se incubaron con anti-FLAG M2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU., F3165) o anti-β-actina (AC-15, Sigma-Aldrich, A-5441) anticuerpos monoclonales de ratón se diluyeron en 1:5000. Las membranas fueron incubadas con una peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado con anticuerpo secundario durante 1 h, y las bandas de proteína se visualizaron con un aumento de quimioluminiscencia (ECL) reactivos de detección (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE.UU.).
Medición de la secreción de PTHrP
células HEK293T (1,5 × 10
5 células /placa de 12 pocillos) fueron transfectadas con el inserto (no) plásmidos simulados utilizando Fugene 6 (Promega) pCAGGSn3FH-EGR4 o. A las 48 h después de la transfección, se recogió el medio de cultivo y se centrifugó a 4 ° C a 15000 rpm. La concentración de proteína PTHrP en el medio acondicionado se determinó mediante un inmunorradiométrico (IRMA) ensayo (SRL Inc., Tokio, Japón).
Efecto de medio condicionado derivado de las células HEK293T EGR4 sobreexpresa en
RANLK
,
IL-6
y
IL-8
expresión
células HEK293T (2,6 x 10
6 células /placa de 10 cm) se transfectaron transitoriamente con el a continuación, pCAGGSn3FH-EGR4 o vector simulacro durante 48 h, y el medio de cultivo fue reemplazado con DMEM más 0,1% de FBS durante 48 h adicionales. El medio de cultivo se recogió posteriormente, y el medio acondicionado se transfirió a murino células osteoblastos MC3T3-E1 que fueron pre-cultivadas con medio de diferenciación que contiene ácido ascórbico (100 g /ml) durante 5 días. Después de 48 h, los niveles de expresión de murino
RANKL
,
IL-6
, y
IL-8
fue analizado por PCR en tiempo real como se describió anteriormente.
inmunoprecipitación de cromatina (cHIP) ensayo de
células HEK293T (2,5 × 10
6 células /placa de 10 cm) fueron transfectadas con 8 g de la pCAGGSn3FH-EGR4 o vector simulacro durante 48 horas y luego se chip ensayos se realizaron utilizando el kit EZ-chip (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.) como se describe anteriormente [19]. El cebador de PCR establece para detectar los sitios de EGR de unión utilizados se enumeran en la Tabla S3.
Ensayo de la luciferasa
células HEK293T (2,5 × 10
plato de 4 células /48 pocillos) fueron co-transfectadas con cualquiera de 100 ng del promotor pGL3-enhancer vector como se describe anteriormente o el vector mock en combinación con 100 ng de la pCAGGSn3FH-EGR4 o vector mock (100 ng). pRL-TK se utilizó como control interno. Después de 48 h, se cosecharon y se analizaron para las células
Firefly
luciferasa y
Renilla
actividad de luciferasa usando el ensayo indicador de luciferasa dual (Promega) como se describe anteriormente [19]. Los datos se expresan como el aumento de veces sobre células transfectadas de manera simulada (ajustadas a 1.0) y representados como la media ± DE de dos experimentos independientes.
NIH3T3 proliferación de las células de ensayo
células NIH3T3 (0,5 × 10
5 células /placa de 6 pocillos) se transfectaron transitoriamente con 3 g de pCAGGSn3FH-EGR4 o vector mock utilizando Fugene 6 (Promega). Ensayos de proliferación celular se realizaron a las 48, 72 y 96 h después de la transfección, respectivamente, utilizando Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japón) como se describe anteriormente [18]. Estos experimentos se realizaron por triplicado. Western blot se realizó como se describió anteriormente.
efectos de silenciamiento génico por siRNA tratamiento
Hemos utilizado siRNA oligonucleótidos (Sigma-Aldrich Japan KK, Japón) para derribar
EGR4
,
DLX5, SYNPO SAMD5
y
RAB15
expresión en SBC-5, SBC-3, NCI-H1048 o PC14PE6. Las secuencias de direccionamiento cada gen se enumeran en la Tabla S4. Las células se sembraron en 12 pocillos platos (SBC-5 y PC14PE6; 1,5 × 10
4 células /pocillo, SBC-3; 2.5 × 10
4 células /pocillo, NCI-H1048; 5,0 x 10
4 células /pocillo). La transfección de 100 nM siRNA a las células PC14PE6 SBC-5 y se llevó a cabo usando el reactivo Lipofectamine 2000 (Life Technologies) como se describe anteriormente [20]. células SBC-3 y NCI-H1048 se transfectaron con 50 siRNAs nm utilizando reactivo de transfección Lipofectamine RNAi Max (Life Technologies) según las instrucciones del fabricante. A los 48, 96 o 120 h después de la transfección, la extracción de ARN total, en tiempo real ensayos de PCR y la proliferación celular se realizaron como se ha descrito anteriormente.
Identificación de genes aguas abajo por EGR4 microarrays de ADN
SBC- 5 células (1 x 10
6 células /35 mm plato para 24 h) fueron transfectadas con 10 nM de ARNsi dirigido contra EGR4 (EGR4-2) o EGFP (siEGFP; un control) usando reactivo Lipofectamine RNAi Max transfección (Life Technologies ). El ARN total se extrajo de cada muestra a las 48 y 72 h después de la transfección de ARNsi. Los análisis de microarrays de ADN y de datos se realizaron con el Agilent Plenario del Genoma Humano Microarray (4 × 44K, G4110F; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.) y el software GeneSpring (versión 11.5; Agilent Technologies) como se describe anteriormente [21]. Un corregido
P
valor se calculó con el análisis de Benjamini Hochberg falso descubrimiento (FDR), y
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado significativo. El grado y la dirección de la expresión diferencial entre puntos de tiempo (48 y 72 h) se determinaron mediante el cálculo de los valores de cambio veces. Los datos del análisis de microarrays de ADN han sido presentados a la NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) de bases de datos como series GSE40558.
RNAseq datos de análisis de los cánceres de pulmón
disponibles al público a los datos de expresión génica (valores normalizados de Illumina RNAseq v2, el nivel 3, y LUAD LUSC) de Atlas del Genoma del cáncer (TCGA; http://cancergenome.nih.gov/) fueron descargados de la matriz TCGA. La expresión diferencial (por valor de cambio veces) entre los tejidos de cáncer de pulmón y el adyacente normal se calculó de acuerdo con el valor de la expresión génica normalizada de cada muestra.
El análisis estadístico
Se realizó un análisis estadístico usando Estudiante de
t-test
.
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado significativo
Resultados
EGR4 regula directamente la actividad transcripcional del Análisis
gen PTHrP
. del perfil de expresión de genes en todo el genoma de la metástasis de órganos preferencial de la línea celular humana SCLC SBC-5 en ratones identificó crecimiento inicial de respuesta 4 (
EGR4
), que fue significativamente upregulated en tumores metastásicos del hueso (
p Hotel & lt; 0,001, la relación; 2,22) en comparación con otros órganos (metástasis de pulmón, riñón e hígado) [7]. En primer lugar, para aclarar el papel de EGR4 como un factor de transcripción implicado en la metástasis ósea, nos hemos centrado en la proteína relacionada con la hormona paratiroidea-(
PTHrP
) como un gen diana aguas abajo del candidato EGR4 porque el
PTHrP
gen es conocido por ser un potente activador de la resorción ósea osteoclástica [4] y codifica una proteína secretada de SBC-5 células [22], [23]. Por otra parte, se ha informado de que el tratamiento con un anticuerpo neutralizante anti-PTHrP inhibe la producción de SBC5 metástasis ósea de células en el modelo de ratón SCID [22], [23].
En el Centro Nacional de Información Biotecnológica ( NCBI base de datos),
PTHrP
gen se informó el poseer cuatro variantes de la transcripción, designado
PTHrP
variante 1 (PTHrP-V1, GenBank adhesión no. NM_198965.1), la variante 2 (PTHrP- V2, NM_002820.2), variante 3 (PTHrP-V3, NM_198964.1) y la variante 4 (PTHrP-V4, NM_198966.1). Los ADNc de longitud completa de
PTHrP-V1
,
V2
,
V3
y
V4
consistir en 1331, 1881, 1862 y 1312 nucleótidos que codificar 177, 175, 175 y 177 aminoácidos, respectivamente, y se componen de 5, 4, 3, y 4 exones, respectivamente. La variante V1 carece del exón 3, y la variante V2 carece del exón 3 y el exón posee 5b, que es 1.027 pb más largo en el extremo 3 'de exón 5a. El V3 y V4 variantes carecen comúnmente los exones 1 y 2 y poseen el exón 3, que se encuentra en el intrón 2 con una longitud de 281 pb. La variante V3 carece aún más el exón 6, y posee 5b exón y la variante V2. La variante V4 posee el exón 5 bis y el exón 6, lo que indica que el
PTHrP-V1 /V2
y
V3 /V4
variantes tienen diferentes regiones promotoras (Figura 1A). En tiempo real RT-PCR análisis posterior confirmó que el
PTHrP-V3
y
V4
variantes de empalme se upregulated predominantemente a nivel transcripcional en las células HEK293T EGR4 que sobreexpresa en comparación con las células transfectadas de manera simulada ( Figura 1B). En consecuencia, para obtener evidencia directa de la regulación al alza de
PTHrP-V3
y
V4 fotos: por EGR4, primero se realizaron búsquedas de supuestos motivos de unión a ADN de EGR con el programa MatInspector (descrito anteriormente), ya que tiene ha informado de que la familia de EGR, incluyendo la proteína EGR4, se une preferentemente a un motivo de consenso EGR (5'-GCGG /TGGGCG-3 ') [24] - [27]. Encontramos un potencial motivo de unión a ADN de EGR en el
PTHrP-V3
y
V4
región promotora (-515 a -499). Posteriormente, se analizó la actividad transcripcional de EGR4 mediante un ensayo indicador de luciferasa usando un plásmido de luciferasa pGL3 que contiene el motivo de unión EGR4 en el
PTHrP-V3 /V4
promotor. Un aumento significativo de la actividad de la luciferasa se observó con FLAG-EGR4 transfección en comparación con el vector control simulacro en las células HEK293T (Figura 1C). Para investigar más a fondo si EGR4 podría obligar a un potencial de
PTHrP-V3
y
V4
EGR motivo de unión, se realizó un chip de ensayo. El fragmento genómico que incluye el potencial motivo de unión de EGR (-515 a -499) de
PTHrP-V3
y
V4
fue unida específicamente por la proteína EGR4 en los productos inmunoprecipitados con un anticuerpo anti-FLAG, lo que sugiere que EGR4 unido directamente a la región promotora de la
PTHrP-V3
y
V4
variantes (Figura 1D). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la EGR4 puede regular al alza directamente el
PTHrP-V3
y
V4
variantes en las células de SCLC
A:. Estructuras genómicas de las cuatro variantes de empalme de
PTHrP
. Las cajas grises y blancas indican las regiones codificantes y no codificantes, respectivamente. Las flechas indican los conjuntos de cebadores utilizados para realizar RT-PCR para cada transcrito. Los números entre paréntesis indican la longitud de cada exón. B: Panel superior: análisis de transferencia Western de las células HEK293T que expresan Bandera de etiquetado exógeno EGR4 (FLAG-EGR4) o células transfectadas con el vector de simulacro. Panel inferior: en tiempo real RT-PCR análisis de
PTHrP
variantes de empalme (
V1 /V2
y
V3 /V4
) en las células HEK293T EGR4 que sobreexpresa. C: Ensayo de la luciferasa de la
PTHrP-V3
y
V4 gratis (
V3 /V4
) regiones promotoras (n = 2, *
P
& lt; 0,05). Este experimento se realizó utilizando una parte de los lisados de células que expresan exógeno FLAG-EGR4 o las transfectadas con el vector mock utilizado en B. D: chip de ensayo de la
PTHrP-V3 /V4
región promotora. Se utilizaron los ensayos de chip para determinar unión directa a la V4
promotor /
PTHrP-V3 EGR4. El producto de PCR fue -620 a -318 de la región aguas arriba del extremo 5 'del exón 3 de
PTHrP-V3 /V4
, que fue designada como la posición +1.
efectos paracrinos de PTHrP secretadas por las células que sobreexpresan EGR4
se ha informado de que la proteína secretada PTHrP a partir de células cancerosas regula la expresión de la
RANKL
,
IL-6
y
IL-8
genes, que han sido implicadas como factores que mejoran la formación de osteoclastos y la destrucción ósea en enfermedades malignas [28] - [30] en osteoblastos células. De acuerdo con estos datos y nuestros resultados, como se muestra en la Figura 1, la hipótesis de que la proteína PTHrP es secretada a partir de células EGR4 sobreexpresan. Nuestros resultados mostraron que la concentración de proteína PTHrP fue significativamente mayor en medio acondicionado a partir de células HEK293T EGR4-overexpressing (14,43 ± 1,04 pmol /L) en comparación con medio acondicionado a partir de células transfectadas de manera simulada (11,83 ± 0,15 pmol /L,
P
& lt; 0,05; Figura 2A)
A:. la secreción de la proteína a partir de células HEK293T PTHrP EGR4 sobreexpresa (n = 3, *
P Hotel & lt; 0,05). B: Esquema de medición de los efectos paracrinos de medio condicionado de células que sobreexpresan EGR4. C: En tiempo real PCR análisis de los efectos paracrinos en la expresión de la
RANKL, IL-6 y
IL-8
genes cuando el medio de las células HEK293T EGR4 con sobreexpresión se realizó cultivo con el ratón osteoblastos MC3T3-E1 (n = 2, *,
P Hotel & lt; 0,05, **,
P Hotel & lt; 0,01).
A continuación, evaluaron los efectos paracrinos de medio acondicionado a partir de células HEK293T EGR4 que sobreexpresa en las células osteoblastos. Como se muestra en la Figura 2B, transferimos medio condicionado de células HEK293T transfectadas con FLAG-EGR4 construir células osteoblastos murinos MC3T3-E1 y luego realizó PCR en tiempo real para examinar los efectos del medio acondicionado en el nivel de expresión del
RANKL
,
IL-6 Opiniones y
IL-8
genes. Los tres genes se upregulated significativamente en las células osteoblastos tratados con medio condicionado de células HEK293T que expresan ectópica FLAG-EGR4 comparación con las células falsamente transfectadas (Figura 2C). En conjunto, estos resultados sugieren que el aumento de la secreción de PTHrP a partir de células que sobreexpresan EGR4 puede aumentar la expresión de la
RANKL
,
IL-6 Opiniones y
IL-8 genes
en las células osteoblastos.
Efecto de
EGR4
sobre el crecimiento celular
primero examinamos
EGR4
expresión en células de SCLC por semi-cuantitativos de RT-PCR y encontrado que
EGR4
fue altamente expresado en células NCI-H1048 SBC-3, SBC-5 y pero no en la línea de células pequeñas vías respiratorias epiteliales SAEC (Figura 3A). A continuación, para evaluar si EGR4 es esencial para el crecimiento de SBC-5 células, se utilizó un enfoque de interferencia de ARN con dos oligonucleótidos de ARNsi diferentes. Análisis en tiempo real PCR mostró que
EGR4
siRNAs específicos de (siEGR4-1 y siEGR4-2) suprimió significativamente la expresión de EGR4 en comparación con siEGFP como control (Figura 3B). ensayo de MTT mostró que la introducción de siEGR4s (siEGR4-1 y siEGR4-2) suprimió significativamente el crecimiento de SBC-5 células (Figura 3C), que es de acuerdo con los resultados EGR4 desmontables. También confirmó significativos efectos inhibidores del crecimiento de
EGR4
caída en otras líneas celulares de SCLC SBC-3 y NCI-H1048 que sobreexpresa
EGR4 gratis (Figura S1). Para confirmar aún más el efecto promotor del crecimiento de
EGR4
, FLAG-EGR4 construir o simulacro de vector se transfectó transitoriamente en células NIH3T3, y el ensayo de MTT se realizó como se ha descrito anteriormente. Como se muestra en la figura 3D, las células transfectadas con FLAG-EGR4 crecieron significativamente más rápido que las transfectadas con el vector mock. Estos hallazgos sugieren que la sobreexpresión de
EGR4
podrían estar involucrados en el crecimiento de las células de SCLC
A:. La expresión de
EGR4 Hoteles en líneas celulares de SCLC y NSCLC se determinó semi -cuantitativo RT-PCR. B: Efectos de
EGR4
caída en la proliferación celular en las células SBC-5. PCR en tiempo real de los
EGR4 Hoteles en siEGFP- o siEGR4 (siEGR4-1, siEGR4-2) células tratadas a los 5 días después del tratamiento siRNA (n = 2, *
P Hotel & lt; 0,05).
ACTB
se utilizó como control cuantitativo de tiempo real RT-PCR. C: La proliferación celular se determinó mediante el ensayo de MTT a los 5 días después del tratamiento siRNA (n = 3, ***
P
& lt; 0,005). (SI-1; siEGR4-1, si-2; siEGR4-2). D: promotoras del crecimiento efecto de EGR4 exógeno en células NIH3T3 (*
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01,
NS
, no tiene importancia). El análisis de transferencia Western se realizó a las 96 h después de la transfección (panel izquierdo). MTT ensayo se realizó a las 48, 72 y 96 h después de la transfección con FLAG-EGR4 (negro) o vector maqueta (blanco) (panel derecho). Estos experimentos se realizaron por triplicado.
Identificación de
EGR4
genes diana
Para obtener más información sobre el papel biológico de
EGR4
el crecimiento celular, hemos intentado identificar genes aguas abajo regulados específicamente por EGR4 en las células de SCLC. siEGR4 o siEGFP (control de siRNA) se transfectaron en SBC-5 células en las que
EGR4
fue altamente expresado (Figura 3A), y las alteraciones en la expresión génica en dos puntos de tiempo fueron supervisadas por el análisis de microarrays de ADN. Para identificar los genes supuestamente regulados por EGR4, se seleccionaron los genes con los dos criterios siguientes: Nivel (i) la expresión se redujo en más del doble a las 48 y 72 h en las células transfectadas con siEGR4 comparación con las células transfectadas con el control siEGFP, y (ii) un putativo motivo de unión EGR se predijo a existir dentro de 500 pb del sitio de inicio de la transcripción por el programa MatInspector (descrito anteriormente). Se identificaron 13 genes que fueron regulados a la baja tras caída de expresión EGR4 (cuadro S5). En tiempo real el análisis de PCR confirmó que siete transcripciones se downregulated significativamente en ambos puntos temporales en las células EGR4-desmontables (Figura 4A). Posteriormente, también se evaluó la regulación al alza de estos genes partir de su expresión EGR4 exógeno en células HEK293T y finalmente seleccionaron cuatro genes candidatos objetivo EGR4, incluyendo homeobox distal-less 5 (
DLX5
), sinaptopodina (
SYNPO
), dominio alfa motivo estéril que contiene 5 (
SAMD5
), y RAB15, un miembro de la familia del oncogén RAS (
RAB15
), que fueron significativamente upregulated por
EGR4
sobreexpresión (Figura 4B). Se confirmó la regulación por disminución significativa de
DLX5
,
SYNPO
y
SAMD5
genes por
EGR4
caída en SBC-3 células (Figura S2).
A: PCR en tiempo real de los
EGR4 Opiniones y siete genes abajo (
DLX5, SYNPO, SAMD5
,
MREG, AHNAK, RAB15
, y
PTPN23
) en siEGFP- o siEGR4 tratados con SBC-5 células (n = 2, *,
P Hotel & lt; 0,05, **,
P Hotel & lt; 0,01, * **,
P Hotel & lt; 0,005). B: PCR en tiempo real de la
DLX5
,
SYNPO
,
SAMD5
, y
RAB15
genes en células HEK293T maqueta o EGR4 que sobreexpresa (n = 2, *,
P Hotel & lt; 0,05, ***,
P Hotel & lt; 0,005). Este experimento se realizó con ARN total de las células que expresan EGR4 exógeno marcado con FLAG (FLAG-EGR4) o las transfectadas con el vector mock utilizada en la figura 1B. C: Ensayo de la luciferasa de la
SAMD5
,
RAB15
,
SYNPO
y
DLX5
genes. (N = 2, *,
P Hotel & lt; 0,05, **,
P Hotel & lt; 0,01). Se utilizaron los ensayos de chip para determinar la unión directa de EGR4 a los promotores de la
SAMD5
,
RAB15
,
SYNPO
y
DLX5
genes: D .
para obtener pruebas directas para la transactivación de cuatro genes candidatos objetivo EGR4, que mide la actividad transcripcional de EGR4 mediante un ensayo indicador de luciferasa. BANDERA-EGR4-tranfected células tenían actividad luciferasa significativamente mayor que las células transfectadas de manera simulada (Figura 4C). A continuación, se investigó el reclutamiento de EGR4 a cada sitio de unión EGR4 por chip de ensayo. EGR4 se muestra para unirse al motivo de unión EGR-pronosticado dentro de las regiones promotoras de los genes diana (Figura 4D). Estos resultados sugieren que EGR4 transactivates directamente
SAMD5
,
RAB15
,
SYNPO
y
DLX5
. Posteriormente, se investigó el papel biológico de los cuatro genes diana EGR4 en la proliferación de las células de SCLC. Introducción de los siRNAs en células NCI-H1048 SBC-5, SBC-3 y resultó en una reducción significativa en la expresión de los genes diana acompañadas de una supresión significativa de la proliferación celular (Figura 5A-D, la figura S3), lo que sugiere que estos genes también es probable que desempeñar un papel crucial en la proliferación de células de SCLC través de la activación transcripcional EGR4.
Efectos de la
EGR4
genes abajo
SAMD5 gratis (a),
RAB15 gratis (B),
SYNPO gratis (C) y
DLX5 gratis (D) sobre la proliferación celular se determinó por siRNA desmontables en SBC-5 células. El panel izquierdo muestra el tiempo real los resultados de PCR para los genes diana en las células tratadas con siRNA (n = 2). El panel derecho muestra los resultados de los análisis de proliferación celular, medido por el ensayo de MTT (
SAMD5
y
RAB15
: n = 2,
DLX5
y
SYNPO
:. n = 3, *,
P Hotel & lt; 0,05, **,
P Hotel & lt; 0,01, ***,
P Hotel & lt; 0,005)
Discusión
en este estudio, nuestro objetivo fue identificar y caracterizar las moléculas o vías potencialmente implicados en la metástasis del cáncer, especialmente las metástasis óseas. A través de un análisis de transcriptómica de todo el genoma de la metástasis de órganos preferencial de las células de SCLC humanas en ratones, se encontró que los
EGR4
, un miembro de una familia de cuatro relacionada dedo de zinc-Cys
2-Su
2 tipo (
EGR1
a
EGR4
), es upregulated significativamente en los tumores metastásicos del hueso comparación con otros órganos, es decir, el pulmón, el riñón y el hígado [7]. EGR4 se identificó inicialmente como un factor de transcripción con dedo de zinc inducida inmediatamente por la estimulación mitogénica en linfocitos y fibroblastos [31] t. La orientación de genes estudios en ratones han demostrado que EGR4 regula varios genes críticos implicados en las primeras etapas de la meiosis y desempeña un papel indispensable en la fertilidad masculina murino [11], [12]. Además, se ha informado de que EGR4 une a las células nucleares de factores de T activadas (NFAT) o factor nuclear kappa B (NFKB) para mejorar la transcripción de genes aguas abajo que codifican citoquinas inflamatorias, tales como IL-2, TNF-α y ICAM-1 [32], [33]. Un informe anterior describe que el nivel de expresión de
PTHrP
, un potente activador de la resorción ósea osteoclástica, en la metástasis ósea tiende a ser más alta que en las metástasis a los riñones, hígados y pulmones usando un transcriptómica de todo el genoma de las células de SCLC humanos en ratones [7]. De acuerdo con ello, en este estudio, nos centramos en
PTHrP
, un potente activador de la resorción ósea osteoclástica, como un gen EGR4-aguas abajo para aclarar el papel fisiopatológico de EGR4 como un factor de transcripción en las metástasis óseas de SCLC.
PTHrP se sabe que es un mediador clave de las neoplasias malignas hipercalcemia humoral y osteolíticas metástasis de cáncer de pulmón [22], [23], [34]. Aproximadamente el 80% de los pacientes con tumores sólidos y la hipercalcemia han aumentado las concentraciones de PTHrP en su plasma [35]. Se ha informado de que la proteína PTHrP secretada a partir de células de cáncer regula la expresión de la
RANKL
,
IL-6
y
IL-8
genes, que han sido implicados como factores que mejoran la formación de osteoclastos y la destrucción ósea en enfermedades malignas [28] - [30] en osteoblastos células. Se encontró que EGR4 transactivates directamente variantes específicas (
V3
y
V4
) del
PTHrP
gen, con lo que posiblemente promover la secreción de la proteína de la PTHrP en las células que sobreexpresan EGR4 , lo que resulta en la posterior transactivación de la
RANKL
,
IL-6
y
IL-8
genes a través de la acción paracrina de la PTHrP. RANKL es conocido para unirse al receptor RANK en precursores de los osteoclastos e inducen la formación de osteoclastos. IL-6 y IL-8 también se ha informado que es importante para la osteoclastogénesis y la activación de los osteoclastos, respectivamente [30]. Por lo tanto, estos resultados sugieren que la inducción de PTHrP por EGR4 sobreexpresión puede ser responsable de la metástasis ósea de células de cáncer de pulmón SCLC.