Extracto
Objetivo
El tratamiento del cáncer colorrectal (CRC) sigue siendo un reto clínico, como más de 15% de los pacientes son resistentes a 5-fluorouracilo (5-FU) regímenes quimioterapéuticos basados en, y las tasas de recurrencia del tumor puede ser tan alta como 50-60%. Las células madre del cáncer (CSC) son capaces de sobrevivir a las quimioterapias convencionales que permita la regeneración de los tumores originales. Por lo tanto, se investigó la eficacia de 5-FU y polifenoles de las plantas (curcumina) en el contexto de desajuste de reparación del ADN (MMR) estado y la actividad de CSC en cultivos de células en 3D de CRC.
Métodos
Alta densidad 3D culturas de CRC líneas celulares HCT116, HCT116 + CH3 (complementados con el cromosoma 3) y sus correspondientes clones isogénicas 5-FU-quimio-resistentes derivados (HCT116R, HCT116 + ch3R) fueron tratados con 5-FU, ya sea con o sin la curcumina en ensayos de tiempo- y dependientes de la dosis.
resultados
Pre-tratamiento con curcumina mejora de forma significativa el efecto de 5-FU en las células HCT116R y HCR116 + ch3R, en contraste con 5-FU solo como demuestra el aumento de la desintegración de colonospheres, aumento de la apoptosis y mediante la inhibición de su crecimiento. La curcumina y /o 5-FU afectada fuertemente células CRC MMR-deficientes en cultivos de alta densidad, sin embargo las células de CRC MMR-dominio eran más sensibles. Estos efectos de la curcumina en la mejora de la quimiosensibilidad al 5-FU fueron apoyadas además por su capacidad para suprimir eficazmente piscinas CSC como se evidencia por disminución del número de células positivas CSC marcadores, poniendo de relieve la idoneidad de este modelo de cultivo 3D para evaluar la expresión del marcador CSC en una cerca
entorno vivo
.
Conclusión
Nuestros resultados ilustran la quimioterapia basada en 5-FU novedosos y no reconocidos anteriormente efectos de la curcumina en la mejora de quimiosensibilización sobre el ADN MMR-deficiente y su quimio contrapartes resistentes al dirigirse al CSC subpoblación. (246 palabras resumen): perfil
Cita:. Shakibaei M, Buhrmann C, P Kraehe, Shayan P, C Lueders, Goel A (2014) curcumina Chemosensitizes 5-fluorouracilo resistentes a las células de cáncer de colon humano MMR-deficiente en Alta culturas densidad. PLoS ONE 9 (1): e85397. doi: 10.1371 /journal.pone.0085397
Editor: Gautam Sethi, Yong Loo Lin Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Singapur, Singapur
Recibido: 25 Octubre, 2013; Aceptado: 27 Noviembre 2013; Publicado: enero 3, 2014
Derechos de Autor © 2014 Shakibaei et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es el tercero más frecuente. cáncer que afecta a hombres y mujeres por igual en todo el mundo [1]. Las terapias actuales para el tratamiento del cáncer colorrectal comprenden principalmente quimioterapias a base de 5-fluorouracilo que se utilizan individualmente o en combinación con oxaliplatino (FOLFOX) o agentes anti-angiogénicos, y /o agentes de factor de crecimiento anti-epidérmicos [2]. Aunque las tasas de incidencia de cáncer de colon han disminuido en cierta medida, las terapias actuales están asociados con efectos secundarios significativos, alto costo y las tasas de recurrencia más del 50%, debido principalmente al desarrollo de la quimio-resistencia adquirida a los agentes quimioterapéuticos convencionales [3], [4]. Estas limitaciones ponen de relieve la necesidad imperiosa y urgente de identificar y desarrollar estrategias de tratamiento seguras novedoso y que puede ayudar a superar la quimio-resistencia y mejorar la respuesta de las células tumorales a los fármacos antitumorales.
La carcinogénesis se cree que es un proceso de múltiples pasos que resulta de una acumulación gradual de alteraciones genéticas en genes distintos (por ejemplo, genes asociados a metástasis, oncogenes, genes supresores de tumores) que conducen a la conversión progresiva de las células sanas a las células tumorales [5], [6]. Ahora se reconoce, además, que las alteraciones epigenéticas como la metilación aberrante del ADN, modificaciones de las histonas, remodelación de cromosomas y daños en el sistema de reparación de genes (MMR), también influyen notablemente la Convención de desarrollo, [5], [7]. El daño al sistema MMR causa inestabilidad genética, ya que es importante para la corrección de pruebas errores de síntesis de ADN durante la replicación, dando lugar a fenotipos de células alteradas, una mayor susceptibilidad a la transformación neoplásica y facilitar el desarrollo de las células quimio-resistentes [8], [9].
Durante la tumorigénesis y la difusión de tumores incluyendo cáncer de colon, células de cáncer requieren capacidad de auto-renovación, similar a la exhibida por las células madre. En la actualidad se acepta que la patogénesis del cáncer en la mayoría de los tumores, incluyendo CRC, es accionado por un subconjunto de células tumorales que exhiben vástago características de las células similares a las células madre fisiológicos, incluyendo la capacidad de auto-renovación y pluripotencia [10], [11] y que estas células madre de cáncer (CSC) tienen el potencial para invadir y formar metástasis a distancia [12], [13], [14]. En el colon, estos colon CSC aberrante diferenciar la generación de una mayor parte de las células tumorales con la fracción más grande compuesta de células más diferenciadas y una pequeña fracción de células madre, que, finalmente, sustituyan a las células madre de colon sanos y toda la cripta del colon es colonizado por madre de cáncer células y su progenie [10]. Un conjunto de marcadores específicos han sido identificados por CSC de colon, incluyendo CD133
+, CD 44
+, CD166
+ y ALDH1
+ [15], [16]. La recaída de tumores después de la quimioterapia aparentemente exitosa se cree que es en virtud de las CSC quimio-resistentes que evaden la muerte por fármacos quimioterapéuticos [17]. Por lo tanto, los nuevos agentes terapéuticos que pueden dirigirse con éxito células madre cancerosas, es muy probable que la estrategia terapéutica más prometedora en la reunión de este tremendo desafío clínico.
literatura emergente sugiere que muchos componentes de la dieta pueden regular directa o indirectamente respuestas inflamatorias en el intestino por la modulación de la función de barrera intestinal [18]. Por otra parte, varios compuestos dietéticos de origen natural se han mostrado como agentes terapéuticos contra el cáncer [19], [20], [21], [22]. De hecho están apareciendo pruebas de que la quimioterapia convencional en CRC beneficia significativamente a través de tratamientos combinatorios con algunos de estos polifenoles dietéticos de origen natural [5], [23], [24]. Uno de estos botánico, la curcumina (diferuloylmethane), una especia amarilla derivado de los rizomas de
Curcuma longa
, tiene una larga tradición como un agente anti-inflamatorio en el sistema ayurvédica india tradicional de la medicina. Además, varios estudios han demostrado que la curcumina actúa como un potente quimio y radiosensibilizador en múltiples cánceres humanos [25], [26] y pueden inhibir el crecimiento de células de sistema de MMR deficientes células de cáncer de colon [27], [28]. En un estudio anterior, hemos demostrado que la curcumina mejora la quimiosensibilidad de 5-FU en líneas celulares de cáncer colorrectal por la orientación NF-kB, Src y productos de los genes regulados NF-B-dependientes [5]. Además, se ha demostrado que dirigirse a las células de cáncer de colon con 5-FU y oxaliplatino (FOLFOX) en combinación con la curcumina atenuada EGF-R, IGF-1R y Akt vía de señalización y células positivas marcadamente reducida marcador de células madre de cáncer y causado desintegración de colonospheres [ ,,,0],23], [24].
recientemente hemos demostrado que el tratamiento combinado de la curcumina con 5-FU induce citotoxicidad más significativo de ADN MMR-deficiencia de cultivos en monocapa de CRC, en comparación con cada agente por separado [5]. Por consiguiente, el objetivo del presente estudio fue investigar si la curcumina sola o en combinación con 5-FU podría afectar a las células de cáncer de colon ADN MMR-deficientes que son intrínsecamente resistentes a 5-FU en la modulación de colonosphere formación y la actividad CSC en cultivos 3D.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y cultivo celular
células de cáncer de colon humano (HCT116; MMR-deficiente) se obtuvieron de la Colección Europea de cultivos celulares (Salisbury, Reino Unido). HCT116 + CH3, es una línea celular MMR-competente, el cual fue creado en nuestro laboratorio mediante la transfección estable del cromosoma 3 que soporta una copia de tipo salvaje del gen
hMLH1
, tal como se describe anteriormente [29]. También generó 5-FU derivados resistentes de estas líneas celulares, se hace referencia como HCT116R y HCT116 + ch3R respectivamente, que fueron creados por el tratamiento repetido de las líneas celulares parentales a concentraciones crecientes de 5-FU durante un período de 10 a 12 meses. Tanto las líneas celulares resistentes a los padres y de 5-FU se utilizaron para investigar la eficacia de la persona y se combinan 5-FU y tratamientos de curcumina. Las células se mantuvieron en matraces de cultivo de tejidos en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; 4,5 g de D-glucosa /L) suplementado con 10% de FBS y 1% de antibiótico /antimicótico en un incubador humidificado a 37 ° C en una atmósfera de 95% de aire y 5% de CO
2. El medio se cambió cada tres días, y las células se pasaron usando tripsina /
EDTA. Los anticuerpos
Los anticuerpos monoclonales para ALDH1 se adquirieron de Acris anticuerpos GmbH (Herold, Alemania). Los anticuerpos monoclonales para CD133 y CD44 se compraron de Abcam PLC (Cambridge, Reino Unido). Los anticuerpos de beta-actina (A5316) eran de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). [Polimerasa poli (ADP-ribosa)] El anticuerpo monoclonal anti-PARP (7D3-6) se adquirió de Becton Dickinson (Heidelberg, Alemania). fosfatasa alcalina de oveja anti-ratón ligado y de oveja anti-conejo anticuerpos secundarios para la inmunotransferencia se adquirieron de Millipore (Schwalbach, Alemania). Todos los anticuerpos se utilizaron a concentraciones y diluciones recomendadas por el fabricante.
Crecimiento Media, productos químicos, y citoquinas
El medio de crecimiento (F-12 de Ham /medio de Eagle modificado por Dulbecco (50:50) que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS), ácido ascórbico /ml 25 mg, 50 IU /ml de estreptomicina, 50 UI /ml de penicilina, 2,5 mg /ml de anfotericina B, aminoácidos esenciales y L-glutamina) se obtuvo de Seromed (Munich, Alemania). La tripsina /EDTA (CE 3.4.21.4) se adquirió de Biochrom (Berlín, Alemania). Epon se obtuvo de Plano (Marburg, Alemania). 5-FU se adquirió de Sigma (Munich, Alemania). La curcumina (BCM-95) fue un generoso regalo de Dolcas Biotech (Landing, Nueva Jersey, EE.UU.). La curcumina se preparó disolviendo en dimetilsulfóxido (DMSO) a una concentración de stock de 5,000 M y se almacenó a -20 ° C. Se prepararon diluciones seriales en medio de cultivo.
Un mM de 5-FU 100 se preparó en absoluto DMSO y se almacena a -20 ° C. La concentración de DMSO fue de menos de 1% de tratamiento de drogas. Para el tratamiento, 5-FU se diluyó en DMEM y se añade a cultivos para dar la concentración final deseada. Después de 70 a 80% de confluencia, las células fueron tratadas con 5-FU o la curcumina individualmente, o su combinación.
viabilidad celular Ensayo
La viabilidad celular se evaluó por el 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) método de captación como se describe anteriormente [30]. Brevemente, HCT116, las células HCT116 + CH3 y las líneas celulares de quimioterapia resistente a 5-FU se sembraron en una placa de 96 pocillos (1.000 por pocillo) y se expuso a diferentes concentraciones de individuo 5-FU o la curcumina por triplicado para los períodos de tiempo indicados para obtener el CI
50 valores (crecimiento celular del 50% las concentraciones inhibitorias). Además, en otro conjunto de experimentos, las células fueron pretratadas con 5 M curcumina durante 12 h y luego co-tratado con diferentes concentraciones de 5-FU (0, 0,1, 1, 2, 3, 4 M) durante 24 h para obtener el dosis óptima para el tratamiento de combinación. Las células se lavaron dos veces con PBS y posteriormente, se añadió solución de MTT (5 mg /ml) a cada pocillo y la placa se incubó durante 2 horas a 37 ° C. Se añadió el tampón de lisis (20% de SDS y 50% de formamida de dimetilo), y las células se incubaron durante la noche a 37 ° C. La absorbancia de la suspensión de células se midió a 570 nm (DO570) utilizando Revelación de 96 pocillos lector de placas MultiScanner (Bio-Rad Laboratories Inc. Munich, Alemania). Los datos obtenidos se calcularon y se representan como porcentaje de supervivencia en relación con los controles. Este experimento se repitió 3 veces de forma independiente, y el análisis estadístico se llevó a cabo para obtener los valores finales.
Formación e inhibición de Colonosphere Colonias
Para el ensayo de la formación de tumores colonosphere, 10 l gota, aproximadamente 2 millones células, sus respectivas líneas de células derivadas de quimioterapia resistente a 5-FU HCT116, HCT116 + CH3 y se sembraron en un filtro de celulosa en la parte superior de un puente de malla de acero [31]. medio de cultivo celular alcanzó la interfaz medio de filtro y las células se nutre por difusión. Este modelo permite que las células se agregan y forman un sedimento distinto, que fue examinado después de 1-10 días. El sus respectivas líneas de células de quimioterapia resistente a 5-FU HCT116, HCT116 + CH3 y fueron tratados con curcumina (20 mM), 5-FU (5 mM) o su combinación (curcumina 5 M y 5-FU 0,1 M) para 1, 3, 7 y 10 días, respectivamente. Las concentraciones aplicadas fueron calculados y representados como porcentaje de supervivencia con respecto a los controles no tratados. El IC
50 se definió como la concentración de fármaco requerida para inhibir HCT116, HCT116R o HCT116 + CH3 y HCT116 + ch3R por 50% respecto a los controles. IC
50 valores se estimó a partir de la curva dosis-respuesta. Los datos se derivan de al menos tres experimentos independientes. formación Colonosphere se evaluó por microscopía de luz, DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol, Sigma) y microscopía electrónica.
Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM)
microscopía electrónica se realizó como se descrito anteriormente [32]. Brevemente, los cultivos de células de alta densidad, tratadas como se describió anteriormente, se fijaron durante 1 h en fijador de Karnovsky, seguido de post-fijación en OsO _ solución 1%
4. Después de la deshidratación en una serie de alcoholes ascendente, los cultivos fueron embebidas en Epon y cortar ultradelgadas con un Reichert-Jung Ultracut E (Darmstadt, Alemania). Las secciones se contrastan con una mezcla de 2% de acetato de uranilo /citrato de plomo y se examinaron con un microscopio electrónico de transmisión (TEM 10, Zeiss, Instituto de farmacología Berlin, Alemania).
Cuantificación de mitocondrial Cambios (MC) y apoptótica la muerte celular
ultrafino se prepararon y evaluaron con un microscopio electrónico de secciones de las muestras (TEM 10; Zeiss, Instituto de farmacología Berlín, Alemania). Para cuantificar el MC y las células apoptóticas, se determinó el número de células con características morfológicas de la muerte celular apoptótica al anotar 100 células de 25 campos microscópicos diferentes.
tinción DAPI para células apoptóticas
condensación de la cromatina y células apoptóticas se examinaron por tinción nuclear con DAPI (4 ', 6'-diamidino-2-fenilindol, Sigma), como se describe anteriormente [32]. Brevemente, los cultivos de alta densidad se sumergieron en O.C.T. medio de inclusión y se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido. De ocho a diez micras se cortaron secciones gruesas. Las secciones fueron fijadas con metanol durante 30 min a 4 ° C en la oscuridad. Posteriormente, los cultivos se lavaron dos veces con PBS, y luego 1 l de solución de DAPI (5 mg /ml) en cinco ml de PBS se extendió a lo largo de los cultivos seguido de incubación durante 20 min en la oscuridad. Las células marcadas se lavaron varias veces con PBS para eliminar el exceso de tinte DAPI, cubierto con medio de montaje Fluoromount y evaluados bajo un microscopio de fluorescencia (Leica, Alemania). Los experimentos y análisis se realizaron por triplicado.
Análisis Western Blot
Para determinar el efecto de la curcumina, 5-FU o curcumina /5-FU en la división de PARP y la expresión de las células madre tumorales (CSC) marcadores, lisados de células enteras se prepararon y se fraccionaron por SDS-PAGE [33]. Brevemente, las células fueron lavadas en PBS, y las proteínas se extrajeron con tampón de lisis (50 mM Tris /HCl (pH 7,2), NaCl 150 mM, 1% (v /v) de Triton X-100, ortovanadato de sodio 1 mM, 50 mM pirofosfato de sodio, fluoruro de sodio 100 mM, 0,01% (v /v) de aprotinina, pepstatina a (4 g /ml), leupeptina (10 g /ml), y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF)) por 30 min en hielo. Después de ajustar la concentración de proteína total, cantidades iguales (proteína de 500 g por carril) de proteínas totales fueron separados por SDS-PAGE (7,5% o 12% de geles) en condiciones reductoras. Las proteínas separadas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se incubaron en tampón de bloqueo (5% (w /v) leche desnatada en polvo en PBS, 0,1% de Tween 20) durante 1 h a temperatura ambiente. Las membranas se incubaron durante la noche con el anticuerpo primario diluido en tampón de bloqueo a 4 ° C en un agitador, se lavaron 3 veces con tampón de bloqueo, y luego incubadas con el anticuerpo secundario conjugado con fosfatasa alcalina durante 90 minutos a temperatura ambiente. Las membranas se lavaron 3 veces en 0,1 M Tris (pH 9,5) que contiene 0,05 M MgCl
2 y 0,1 M NaCl. Finalmente, se detectan los complejos específicos antígeno-anticuerpo utilizando nitroazul de tetrazolio y 5-bromo-4-cloro-3-indoylphosphate (
p
toluidina sal; Pierce, Rockford, IL, EE.UU.) como sustratos para la fosfatasa alcalina. Análisis FODA
estadística
los datos numéricos se expresan como los valores medios (+/- SD) de un experimento representativo realizado por triplicado. Las medias se compararon mediante
t de Student
suponiendo varianzas iguales. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativos si el
valor de p
era inferior a 0,05.
Resultados
células CRC humano MMR-deficientes y -proficient (HCT116, HCT116 + CH3 ) y sus respectivas líneas celulares derivadas de quimio-resistentes a 5-FU (HCT116R, HCT116 + ch3R) fueron utilizados en nuestro estudio para investigar el efecto de la curcumina y /o 5-FU sobre la viabilidad celular, la apoptosis y las células madre del cáncer (CSC) en cultivos de alta densidad.
Las células MMR- deficiente CRC y sus respectivas células resistentes a 5-FU son sensibles a la curcumina
se determinaron los efectos citotóxicos de 5-FU o la curcumina en líneas celulares de cáncer de colon de cuatro usando el ensayo de MTT. Las células se trataron con diferentes concentraciones de 5-FU (0, 1, 5, 10 y 20 mM) o curcumina (0, 1, 5, 10 y 20 mM) y la viabilidad celular se examinó mediante MTT de ensayo (Fig. 1A & amp ; 1B). Hemos observado que 5-FU bloqueado la proliferación de las líneas celulares HCT116, HCT116 + CH3 de una manera dependiente de la dosis con una CI
50 valor de 5 M, mientras que, sus respectivos derivados resistentes a 5-FU no tenían ninguna respuesta a 5-FU tratamiento (Fig. 1A). Las células HCT116 + CH3 y las correspondientes líneas celulares de quimioterapia resistente a 5-FU eran igualmente sensibles a la curcumina (IC
50 5 M), mientras que las células de ADN MMR deficiente en líneas celulares HCT116 y HCT116R eran menos sensibles a la curcumina en comparación con el ADN MMR-competente líneas celulares HCT116 + CH3 y HCT116 + ch3R (IC
50 20 M; Fig. 1B). Estos resultados sugieren que la restauración de la actividad hMLH1 en la línea celular HCT116, mediante la introducción del cromosoma 3, se asoció con un aumento de la sensibilidad a 5-FU.
HCT116, HCT116 + CH3, célula HCT116R y HCT116 + ch3R líneas fueron tratados con diferentes concentraciones de 5-FU (0, 1, 5, 10 y 20 mM) solo (a) durante 24 horas, diferentes concentraciones de la curcumina (0, 1, 5, 10 y 20 mM) solo (B) durante 24 horas, o se pre-tratados con curcumina 5 M durante 4 h, y después se expusieron a diferentes concentraciones de 5-FU (0, 0,1, 1, 2, 4) durante 24 horas (C). La viabilidad celular se midió con el método MTT y IC
50 determina en la inhibición del crecimiento del 50%. Los resultados se proporcionan como valores medios con desviaciones estándar de al menos tres experimentos independientes. Los valores se compararon con el control y los valores estadísticamente significativos con p & lt; 0,05. Los valores significativos están marcados con (*).
Para evaluar la sensibilidad de las células a la combinación de la curcumina y el tratamiento con 5-FU, pretratados las respectivas células quimio-resistentes a 5-FU HCT116, HCT116 + CH3 y primero con 5 M curcumina seguido de tratamiento con diferentes concentraciones de 5-FU (0, 0,1, 1, 2 y 4 mM) durante 24 h (Fig. 1C). MTT ensayos se llevaron a cabo y se determinaron IC
50 valores. Los resultados muestran que la curcumina aumentó significativamente la citotoxicidad del 5-FU para ambas líneas celulares (HCT116 y HCT116 + CH3) aproximadamente a 0,1 M 5-FU (Fig. 1C). Curiosamente, el pretratamiento con 5 M curcumina reduce IC
50 valores para 5-FU a 2 M en el HCT116R resistente 5-FU y HCT116 + ch3R líneas de células (P & lt; 0.05; Fig. 1C). Estos resultados sugieren que el ADN MMR deficientes HCT116R y HCT116 ADN MMR-competente + ch3R células pretratadas con curcumina fueron más sensibles a 5-FU de las células tratadas con 5-FU solo y la introducción del cromosoma 3 en las células HCT116 mostraron un aumento de la sensibilidad de las células al tratamiento con 5-FU y /o curcumina en comparación con las células HCT116.
curcumina y /o 5-FU reprimir Colonosphere crecimiento de células de CRC MMR-deficientes y sus respectivas células resistentes a 5-FU en los cultivos de alta densidad
Para evaluar los efectos de 5-FU y /o curcumina ya sea solo o en combinación del tamaño de colonospheres, una característica prominente de células madre del cáncer [34], tridimensionales cultivos de alta densidad [31] de la HCT116 y se llevaron a cabo (Fig. 2A-C).
cultivos de alta densidad de HCT116 (A) o HCT116R (B) las células se dejaron sin tratar o fueron las líneas celulares de quimioterapia resistente correspondientes tratados con 5-FU (5 M), la curcumina (20 mM), o 5-FU /curcumina en combinación (0,1 /5 mM). Los cultivos fueron evaluadas después de 1, 3, 7 y 10 días, y las imágenes de las culturas nativas tomadas. Los cuadros son representativos de tres experimentos individuales. tamaño Colonosphere se midió y los resultados presentados son los valores medios con desviaciones estándar de tres experimentos independientes. C: Los cultivos de alta densidad de sus respectivas células 5-FU-chemoresistant HCT116, HCT116 + CH3 y se dejaron sin tratar o se trataron con 5-FU (5 M), la curcumina (20 mM), o 5-FU /curcumina en combinación (0.1 /5 M). Los cultivos se evaluaron después de 10 días, se midió colonosphere tamaño y los resultados presentados son los valores medios con desviaciones estándar de tres experimentos independientes. Los valores significativos están marcados con (*).
En los cultivos de control no tratados, los resultados mostraron que tanto las células HCT116 y HCT116R formaron colonias esferoide, con un aumento dependiente del tiempo en el tamaño de colonospheres durante el 10 período de días (Fig. 2A, 2B). El tratamiento de cultivos de HCT116 con 5-FU solo, en contraste con su correspondiente línea celular resistente HCT116R 5-FU, reduce drásticamente el tamaño de colonospheres en comparación con los controles correspondientes (Fig. 2A, 2B). Como era de esperar, el tratamiento de 5-FU células resistentes con 5-FU de forma individual no tenía un efecto negativo en tamaño colonosphere (Fig. 2B). En contraste, en los cultivos tratados con curcumina sola y /o 5-FU, el tamaño colonosphere se redujo significativamente en comparación con los controles correspondientes (Fig. 2A, 2B, 2C). El tratamiento con curcumina solo o tratamiento de combinación ha demostrado ser muy eficaz en la inhibición de la capacidad de formación de la esfera de las cuatro líneas celulares de CRC. Los tamaños de colonospheres en los grupos tratados con curcumina fueron significativamente menores en comparación con los grupos de control, lo que indica que a) la curcumina por sí mismo suprimida tamaño colonosphere en células HCT 116 deficientes ADN MMR, y b) las células sensibilizadas curcumina HCT116R y HCT116 + ch3R de 5- citotoxicidad inducida-FU (Fig. 2A, 2B, 2C). Al final del período experimental (10 días), se pudo observar que mientras que las células de control formaron colonospheres bien desarrollados, las 5-FU células CRC resistentes expuestos a la curcumina sola o en combinación de tratamiento mostraron la formación de esferoides significativamente más pequeño (Fig. 2C). Tomados en conjunto, estos resultados indican que colonoshere tamaño se redujo marcadamente en cultivos de alta densidad tratados ya sea con la curcumina sola o combinación de curcumina y 5-FU, que indica un colonosphere efecto de la curcumina y /o 5-FUon HCT116, HCT116 + CH3 y su inhibición respectivos derivados resistentes a 5-FU.
La curcumina y /o 5-FU Aumentar la citotoxicidad de células Colonospheres de CRC MMR-deficientes y sus respectivas células resistentes a 5-FU en cultivos de alta densidad
Para examinar si el efecto formación inhibidora colonosphere de la curcumina y 5-FU en HCT116, HCT116 + CH3, líneas celulares HCT116R y HCT116 + ch3R se relaciona con la inducción de la apoptosis, se evaluaron las células tratadas mediante la tinción DAPI, que mostraron que los cuerpos apoptóticos que contiene nuclear fragmentos y condensación de la cromatina se generaron dentro de la piscina apoptótica de las células (Fig. 3A, 3B). De hecho, la incubación de las células HCT116 y HCT116R en un medio de suero de hambre como resultado la formación de colonosphere durante un período de 10 días. Sin embargo, la incubación de las células HCT116 y HCT116R con 5-FU, la curcumina, o la curcumina, junto con 5-FU durante 10 días dio lugar a una desintegración marcada de colonosphere (s) en comparación con sus correspondientes controles (Fig. 3A, 3B). se observó más alta desintegración en respuesta a la combinación de la curcumina y 5-FU en líneas celulares HCT116 + ch3R (Fig. 3A, 3B) HCT116 + CH3 y.
culturas de alta densidad de HCT116, HCT116 + CH3 (A ), o HCT116R y HCT116 + ch3R (B) se dejaron sin tratar o se trataron con 5-FU (5 M), la curcumina (20 mM), o 5-FU /curcumina en combinación (0,1 /5 mM). Los cultivos se evaluaron después de 1, 3, 7, y 10 días, y se tiñeron con Hoechst 33258 (DAPI) para revelar cambios apoptóticos de los núcleos celulares. Los cuadros son representativos de tres experimentos individuales.
mediada por 5-FU curcumina potencia la apoptosis de las células CRC MMR-deficientes y sus respectivas células resistentes a 5-FU en cultivos de alta densidad
Para examinar si el efecto inhibidor del crecimiento de la curcumina y 5-FU en la formación colonosphere en cultivos de alta densidad tridimensionales está relacionado con la inducción de la apoptosis, se realizaron evaluaciones ultraestructurales (Fig 4 & amp;. 5) en HCT116, HCT116 + CH3 , células HCT116R y HCT116 + ch3R tratados con 5-FU (5 M) y la curcumina (20 M) de forma individual, o 5-FU /curcumina en combinación (0,1 /5 M) para 1, 3, 7 y 10 días. En los cultivos de control, sus líneas celulares de contrapartida 5-FU resistentes HCT116, HCT116 + CH3 y exhibió grandes células viables redondeadas (que contiene distinta distribución de retículo endoplásmico, mitocondrias y otros orgánulos celulares) y estas células se pusieron en contacto íntimo de célula a célula ( Fig. 4A, 5A). El tratamiento de células HCT116 con 5-FU o la curcumina sola dio lugar a la degeneración de los orgánulos celulares, hinchamiento mitocondrial y la apariencia de múltiples vacuolas, con signos prominentes de apoptosis especialmente en cultivos de alta densidad de curcumina tratados con alrededor de día 10 (Fig. 4A-B). Estas áreas incluidas de heterocromatina condensada dentro de los núcleos, y múltiples vacuolas citoplásmicas autophagocytic. Se hicieron observaciones similares para las células HCT116 + CH3 (datos no presentados). Por el contrario, estos efectos no podían ser observados en 5-FU o tratada curcumina HCT116R (Fig. 5A-B) o + ch3R células HCT116 (datos no mostrados). Sin embargo, un tratamiento combinatorio de 5-FU y la curcumina más de 10 días notablemente mayor degeneración de todas las células tumorales. se detectaron marcados cambios degenerativos y células apoptóticas en torno a día 3 en HCT116 (Fig. 4A-B) y las células HCT116R (Fig. 5A-B), que ya eran visibles alrededor del día 1 en las células HCT116 + CH3 (Fig. 4A-B) y las células HCT116 + ch3R (Fig. 5A-B). La cuantificación y el análisis estadístico de los datos ultraestructural destaca los efectos prominentes de combinado 5-FU y la curcumina tratamiento en la inducción y la mejora de los cambios mitocondriales (MC) y efectos apoptóticos en las células HCT116 (Fig. 4B) y las células HCT116R (Fig. 5B).
a: culturas alta densidad de de HCT116 y HCT116 + CH3 se dejaron sin tratar o se trataron con 5-FU (5 M), la curcumina (20 mM), o 5-FU /curcumina en combinación (0.1 /5 M). Los cultivos se evaluaron después de 1, 3, 7, y 10 días, y se evaluaron ultraestructuralmente con un microscopio electrónico de transmisión. En el punto de tiempo más temprano cuando se detectó la apoptosis (flechas) primero, las imágenes se destacan en cajas de color rojo. Las micrografías muestran son representativos de tres experimentos individuales. Ampliación: x5000, bar = 1 m. B: cambios mitocondriales (MC) y la apoptosis se cuantificó contando 100 células con características morfológicas de la muerte celular apoptótica de 25 campos y resultados presentados microscópicas diferentes son valores medios con desviaciones estándar de tres experimentos independientes. Los valores significativos están marcados con (*) guía empresas
A:. cultivos de alta densidad de HCT116R y HCT116 + ch3R se dejaron sin tratar o se trataron con 5-FU (5 M), la curcumina (20 M) o 5-FU /curcumina en combinación (0,1 /5 mM). Los cultivos se evaluaron después de 1, 3, 7, y 10 días, y se evaluaron ultraestructuralmente con un microscopio electrónico. En el momento más temprano cuando la apoptosis (flechas) se detectó por primera vez las imágenes se destacan en cajas de color rojo. Las micrografías muestran son representativos de tres experimentos individuales. Ampliación: x5000, bar = 1 m. B: cambios mitocondriales (MC) y la apoptosis se cuantificó contando 100 células con características morfológicas de la muerte celular apoptótica de 25 campos y resultados presentados microscópicas diferentes son valores medios con desviaciones estándar de tres experimentos independientes. Los valores significativos están marcados con (*).
La curcumina potencia el efecto antitumoral del 5-FU través de la apoptosis Camino en HCT116, las células HCT116 + CH3 y sus respectivas células resistentes a 5-FU en cultivos de alta densidad
Desde la evaluación ultraestructural con los resultados de microscopía electrónica mostró que 5-FU +/- apoptosis curcumina inducida (Fig. 4-5), y PARP parece estar implicado en la inducción de apoptosis en células tumorales [35], por lo tanto se investigó si la curcumina potencia PARP división con 5-FU tratada HCT116, HCT116 + CH3 y sus homólogos 5-FU-resistentes correspondientes. Como se muestra en la Fig. 6, el análisis de inmunotransferencia demostró que la escisión de PARP se mejoró, cuando las células fueron expuestas a la curcumina (20 mM) o 5-FU (5 mM) sola, o en la combinación de la curcumina y 5-FU (0.1 /5 M) . Estos efectos fueron más pronunciados en el tratamiento de combinación con curcumina y 5-FU que en los tratamientos individuales (Fig. 6).
cultivos de alta densidad de HCT116 y HCT116 + CH3 (izquierda Lanel) y de HCT116R y HCT116 + ch3R células (panel derecho) se dejaron sin tratar o se trataron con 5-FU (5 M), la curcumina (20 mM), o 5-FU /curcumina en combinación (0,1 /5 mM). Los cultivos se evaluaron después de 3 días y lisados de células enteras preparadas y analizadas por Western Blot para la escisión de PARP. Las transferencias Western se muestran son representativos de tres experimentos independientes. La proteína de limpieza β-actina sirvió como control de carga positiva en todos los experimentos.
La curcumina tiene efecto potente quimiosensibilización sobre las células madre del cáncer de colon en MMR-deficiente y células CRC -proficient en cultivos de alta densidad
Para demostrar el efecto de la curcumina en quimiosensibilización de colon CSC marcadores CD133, CD44 y expresión ALDH1 en cultivos de alta densidad, se realizó análisis de transferencia Western (Fig. 7). culturas alta densidad de HCT116, HCT116 + CH3 y sus correspondientes homólogos de 5-FU-resistentes se dejaron sin tratar o se trataron con 5-FU (5 mM) o la curcumina (20 M) solo, o 5-FU /curcumina en combinación (0,1 /5 mM) durante 12 h.