Extracto
Antecedentes
AKT1 (timoma murino viral homólogo del oncogén v-akt 1) quinasa es uno de los más frecuentemente activado proliferado y vía de supervivencia del cáncer. Recientemente se ha demostrado que E17K mutación en el dominio de homología Pleckstrin (PH) de la proteína AKT1 conduce al cáncer mediante la amplificación de la fosforilación y la membrana localización de la proteína. El mutante se ha mostrado resistencia a AKT1 /2 inhibidor VIII molécula de fármaco. En este estudio hemos demostrado las consecuencias estructurales y moleculares detallados relacionados con la regulación de la actividad de la proteína mutante.
Métodos
La puntuación de acoplamiento exhibió una pérdida significativa en la interacción de afinidad a AKT1 /inhibidor 2 VIII molécula de fármaco. Además, los estudios de simulación de dinámica molecular presentan una evidencia de la rápida deriva conformacional observado en la estructura mutante.
Resultados
No hubo pérdida de estabilidad en el mutante en comparación con estructura nativa y el principal catión-π interacciones también se mostró a ser retenido. Por otra parte, los residuos activos involucrados en la localización de la membrana de proteínas mostraron aumento significativo en la formación NHbonds en el mutante. El aumento en la formación de NHbond en los residuos activos explica el aumento de 4 veces en el potencial de localización de la membrana de proteínas.
Conclusión
El resultado global sugerido que, aunque la mutación no indujo ninguna estabilidad pérdida en la estructura, las consecuencias patológicas asociadas podría haber ocurrido debido a las derivas conformacionales rápidos observados en el dominio PH AKT1 mutante.
Importancia general
la metodología implementada y los resultados obtenidos en este trabajo se facilitar la hora de determinar el núcleo mecanismos moleculares de mutaciones asociadas al cáncer y en el diseño de sus inhibidores potenciales de drogas
Visto:. Kumar a, Purohit R (2013) cáncer asociado E17K la mutación causa un rápido conformacional deriva en AKT1 Pleckstrin homología (PH ) de dominio. PLoS ONE 8 (5): e64364. doi: 10.1371 /journal.pone.0064364
Editor: Reiner Albert Veitía, Instituto Jacques Monod, Francia |
Recibido: 30 Enero, 2013; Aceptado: April 12, 2013; Publicado: 31 May, 2013
Derechos de Autor © 2013 Kumar, Purohit. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Estos autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
AKT1 (timoma murino viral homólogo del oncogén v-akt 1) quinasa es un miembro de la posibilidad de la vía de proliferación y supervivencia más activado con frecuencia en el cáncer [1] - [6]. miembros de la familia de genes AKT están asociados con el cáncer en humanos; especialmente destacado es la amplificación genética de AKT2. mutación puntual en AKT1 se ha detectado en el síndrome de Proteus [2], carcinomas endometriales [4], [7] y leucemia [5], [8] - [9], la amplificación de genes en un solo carcinoma gástrico de una pantalla de más de 225 diversos tumores malignos humanos [10], y en 1 de cada 103 gliosarcoma cánceres gliales malignos [11]. En otro estudio se encontró que la actividad quinasa se AKT1 frecuencia elevada en varios de alto grado, los cánceres en etapa tardía [12] Aunque los mecanismos exactos de estas observaciones aún no están claros. La activación de AKT1 es impulsado por la localización de membrana, que es a su vez iniciada por la unión de la homología pleckstrin (PH) de dominio a fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato (PtdIns (3,4,5) P3) o fosfatidilinositol 3,4-bifosfato (PtdIns (3,4) P2), seguido por la fosforilación de los aminoácidos serina regulador 473 (Ser 473) y la treonina 308 (Thr 308) [3], [13]. La asociación patológica de AKT con la membrana plasmática es un hilo común que conecta AKT con el cáncer [1] - [7], [14] - [15]. El comportamiento oncogénico de la proteína de fusión Gag-AKT desde el AKT8 retrovirus de la leucemia murina (timoma murino viral homólogo del oncogén v-akt 8) requiere una señal de la miristoilación primera evidencia presuntiva membrana de metas de que la localización de la membrana patológica de la actividad quinasa AKT1 podría transformando en ratones [16]. Además, la importancia de AKT en el cáncer humano se infiere en gran parte de las mutaciones que ocurren con frecuencia en las enzimas que regula la actividad de estos segundos fosfolípidos mensajero (PtdIns (3,4,5) P3, PtdIns (3,4) P2) y en última instancia provoca la activación de AKT a través de la membrana reclutamiento [1], [3], [17], [18]. Tumores muestras de los pacientes con cáncer de mama, cáncer colorrectal y los casos de leucemia se ha demostrado que el puerto frecuencia activación de mutaciones somáticas en AKT1 [1], [5]. Además, la pérdida de miembros que interactúan asociados, tales como la fosfatasa y tensina homólogo actividad de la fosfatasa de lípidos (PTEN) ha sido reportado en glioblastoma, cáncer de próstata y de endometrio por medio de mutaciones somáticas [11], o en el cáncer de mama por medio de silenciamiento epigenético [12], lo que representa un mecanismo indirecto alternativa para la activación de AKT. Por lo tanto, AKT1 parece tener un papel crucial, pero pasiva en la oncogénesis y actúa como intermediario indirecta entre las proteínas mutadas de regulación aguas arriba y aguas abajo moléculas de señalización.
La activación oncogénica de AKT1 puede ser inducida por varios medios, que se producen con mayor frecuencia ya sea por el compromiso en su membrana de la orientación por dominio PH, o debido a los cambios conformacionales patológicos que ocurren en la estructura mutante. Las mutaciones genéticas en el dominio PH se ha informado anteriormente perturbar el comportamiento de la localización y la pérdida de sensibilidad hacia los PtdIns y ha dado lugar a importantes consecuencias para su comportamiento funcional [1]. Mientras monitorea las causas de dicha observación, el enfoque computacional forma una espina dorsal significativa y sirve en la realización de observaciones experimentales agudos en la entrada de bajo coste. Una mutación puntual en el nucleótido 49 que resulta en una sustitución de lisina por ácido glutámico en el aminoácido 17 (AKT (E17K)) ha sido implicado en los casos de cáncer [1], [3], [19] - [21]. La causa molecular detrás del resultado oncológico asociado todavía no se ha estudiado con mucho detalle. Se sabe que la unión de fosfoinosítidos al dominio PH activa AKT1. En la conformación apo, Glu 17 ocupa el bolsillo de unión phosphoinositide-y forma una red de enlaces de hidrógeno. En la obra de Carpten et al. (2007), se demostró que las Lys 17 sustitución dé como resultado un cambio en la carga de la superficie alrededor de la bolsa de negativo con Glu 17 a efectivamente neutral en el mutante [1]. Esta mutación ha resultado en un aumento del nivel de fosforilación de AKT en Thr 308 y Ser 473 en comparación con los de tipo salvaje. AKT1 actividad de la quinasa (E17K) se demostró que era aproximadamente cuatro veces mayor que la de AKT1 (WT), lo que sugiere que la mutación ha alterado la regulación AKT1 y por lo tanto aumenta la actividad celular [1]. Además, también se ha propuesto que la mutación induce aumento de afinidad grande para PI (4,5) P2 que es esencial para la membrana plasmática constitutiva de orientación del dominio PH mutante y por lo tanto a la naturaleza de la proteína oncogénica E17K AKT1 de longitud completa [3]. Por otra parte, también se sugirió que el dominio de la mutación E17K PH provocó cambios estructurales en el dominio PH, lo que afectó aún más su interacción con AKT1 /2 inhibidor VIII [1]. Todas estas observaciones sugieren fuertemente que los cambios conformacionales perjudiciales en dominio PH mutante podrían haber causado tales resultados patológicos.
La simulación dinámica molecular (MDS) ha sido un enfoque prometedor para investigar los cambios conformacionales en la estructura de la proteína mutante con respecto a su conformación nativa [22] - [29]. Sabemos que el cambio en la orientación conformacional de una molécula de proteína afecta a su interacción con el ligando, así como sus socios biológicos. En este trabajo nos hemos centrado nuestro estudio en la investigación de los cambios en el comportamiento dinámico del dominio PH AKT1 inducida por el cáncer que causa la mutación E17K. Investigaciones anteriores han demostrado que E17K mutación tiene un papel potencial en la inducción de una alteración significativa en el dominio de conformación AKT1-PH, así como en la inducción de resistencia contra AKT1 /2 inhibidor VIII [1]. Hemos llevado a cabo MDS en la noción de inferir los cambios conformacionales que se producen en la estructura mutante que puede dar cuenta de los cambios moleculares observados y los resultados patológicos asociados. Por otra parte, los estudios de acoplamiento también ayudaron en la determinación de los cambios en la afinidad de la interacción ligando de proteína. En general, nuestros resultados proporcionan una fuerte evidencia de graves que se producen deriva conformacional en la proteína mutante en comparación con el nativo.
Materiales y Métodos
Conjuntos de datos
Se seleccionaron las estructuras cristalinas de los nativos PH (AP ID: 1UNP), la estructura E17K (AP ID: 2UZS) y la estructura de AKT1 /2 inhibidor VIII (AP ID: 3O96) de Brookhaven Protein Data Bank [30] para nuestra investigación. Las estructuras fueron obtenidos utilizando la energía minimizada GROMOS96 43a1 campo de fuerza a través gromacs 4.5.4.package [31].
catión-π interacciones
interacciones catión-pi se calcularon utilizando el programa de captura [32]. Se identificaron las interacciones de cationes-pi en las estructuras de proteínas y se evaluaron mediante el uso de un criterio basado en la energía para la selección de pares de cadena lateral significativos. La composición porcentual de un residuo de aminoácido específico que contribuye a las interacciones de cationes π se obtiene de la ecuación: donde "i" significa los cinco residuos (Lys, Arg, Phe, Trp, y Tyr),
n
cat-π es el número de residuos que participan en las interacciones de cationes π, y
n gratis (i) es el número de residuos de tipo "i" en las estructuras de las proteínas consideradas.
Furthere la interacción catión-π se reconoce cada vez más como una importante interacción de unión no covalente relevante para la biología estructural. Se utiliza una variante de los potenciales de campo optimizados para simulaciones de líquidos (OPLS) la fuerza para proporcionar una evaluación energética de todas las interacciones potenciales de cationes π en una proteína. La energía electrostática () se calcula utilizando la ecuación: donde y son los cargos por los átomos de
i
y
j
, respectivamente, y es la distancia entre ellos. La energía de van der Waals viene dada por:
¿Dónde y; y son el radio de van der Waals y la profundidad del pozo, respectivamente.
Si ≤-2,0 kcal /mol, el par se cuenta como una interacción catión-π. Si & gt; -1,0 kcal /mol, la estructura es rechazada. Si -2,0 & lt; ≤-1,0 kcal /mol, la estructura se retiene sólo si ≤-1,0 kcal /mol
unión de ligando Análisis cavidad
La unión del ligando cavidad de la estructura de dominio AKT1 PH se. examinado por la herramienta CASTp [33]. CASTp implementa triangulaciones regulares incrementales, comúnmente conocida como la triangulación de Delaunay ponderada y el complejo alfa para medir la forma de complementariedad macromolécula dada. También mide los bolsillos accesibles de superficie y las cavidades interiores que son inaccesibles. Las medidas siguen los cálculos analíticos área y volumen de cada bolsillo y la cavidad [33] que identifican.
Análisis de Complementariedad
Se utilizó el PatchDock servidor web [34] para calcular la complementariedad de AKT1 inhibidor /2 dominio PH VIII y AKT1. El principio subyacente de este servidor se basa en la representación molecular forma, superficie coincidente parche y filtrado y la puntuación. Está dirigido a la búsqueda de transformaciones de conexión para que produzcan buena complementariedad forma molecular. Tales transformaciones, cuando se aplica, inducen ambas zonas de interfaz de ancho y pequeñas cantidades de choques estéricos. algoritmo de segmentación se implementated para la detección de parches geométricas. Los parches se filtran, por lo que sólo las muestras con residuos "punto caliente" se conservan. Además, las técnicas híbridas de la geométrica de hashing y Pose-Clustering coincidentes se implimented para que coincida con los parches. Todos los complejos con penetraciones inaceptables de los átomos del receptor a los átomos del ligando se descartan. Por último, los candidatos restantes se clasifican de acuerdo con una puntuación de forma complementariedad geométrica. Coordenadas 3D de las estructuras nativas y mutantes fueron sometidos a acoplamiento con AKT1 /2 inhibidor VIII.
Análisis Docking
Se realizaron estudios de acoplamiento molecular para investigar el papel de la mutación en que afecta el inhibidor de AKT1 /2 actividad de unión VIII de dominio kinesin usando Autodock 4,0 [35]. Autodocktools 1.4.6 se utilizó para establecer los puntos AutoGrid así como la visualización de las estructuras de ligando de ácido amino-atracados [35]. mapa de la red centrada en los ligandos de los sitios de las estructuras nativas y mutantes de unión se construye para cubrir los bolsillos de unión de AKT1 /2 inhibidor VIII. Se utilizó el algoritmo genético lamarckiana para llevar a cabo simulaciones de acoplamiento molecular. Las simulaciones se realizaron con hasta 2,5 millones de valoraciones de energía con un máximo de 27000 generaciones. Las conformaciones de energía más bajos fueron considerados como las conformaciones de unión entre AKT1 /2 inhibidor VIII y PH de dominio.
Molecular Simulación Dinámica
Dinámica Molecular Simulation se llevó a cabo mediante el uso de gromacs 4.5.4 paquete [31] . Estructuras de PH nativa y mutante se utilizaron como punto de partida para las simulaciones MD. Los sistemas fueron solvatados en una caja rectangular con moléculas de agua TIP3P en 10 radio marginal Å. A pH fisiológico se encontró que las estructuras se tiene carga negativa, por tanto, con el fin de hacer que el sistema de simulación eléctricamente neutro, añadimos 2 iones de cloro (CL
-) en la caja de simulación con la función "Genion" que acompaña con el paquete gromacs . Inicialmente, las moléculas de disolvente se relajaron mientras que todos los átomos de soluto se armónicamente restringidos a sus posiciones originales con una constante de fuerza de 100 kcal /mol para 5000 pasos. se utilizó Emtol criterio de convergencia de 1000 kcal /mol y fourierspacing de 0,12 nm. Después de esto, el sistema molecular conjunto se sometió a minimización de energía usando el método de gradiente conjugado. Berendsen método de acoplamiento de temperatura [36] se utiliza para regular la temperatura dentro de la caja. acoplamiento de presión isotrópica se llevó a cabo utilizando el método de Parrinello-Rahman. interacciones electrostáticas se calcularon utilizando el método de partículas de malla Ewald [37]. Los estados de ionización de los residuos se conjunto apropiado a pH 7 con todas las histidinas supone neutral. La presión se mantuvo a 1 atm con la gama de compresibilidad permitido de 4.5E
-5 atm. SHAKE algoritmo se utiliza para restringir las longitudes de enlace de hidrógeno que implican, lo que permite un tiempo de paso de 2 fs. Van der Waals y las interacciones de Coulomb se cortan después de 1,0 nm. La lista no enlazados pareja se actualiza cada 10 pasos y conformaciones se almacena cada 0,5 ps. Posición de simulación de restricción para el año 2000 ps se llevó a cabo para permitir que las moléculas de disolvente para entrar en la región de la cavidad de la estructura. Finalmente, los sistemas se sometieron a la simulación MD de 50 ns. Hemos calculado el análisis comparativo de las desviaciones estructurales en la estructura PH nativa y mutante. RMSD, la FMR, SAS y análisis Rg se llevaron a cabo mediante el uso de g_rms, g_rmsf, g_sas y herramienta g_gyrate respectivamente. Número de enlaces de hidrógeno formados por distintos residuos específicos de otros aminoácidos dentro de la proteína durante la simulación (NHbond) se calculó utilizando g_hbond. NHbond determina sobre la base de la distancia donador-aceptor más pequeño que 0,35 nm y de donante-aceptor de hidrógeno. Los gráficos se representaron usando Gracia herramientas GUI versión 5.1.22.
Resultados y Discusión
Carpten et al. (2007) propusieron que la mutación E17K había causado importante elevación de la actividad AKT1 [1]. De acuerdo con las inferencias que se presentan en su trabajo, la mutación provoca un cambio significativo en la conformación de dominio PH AKT1 que finalmente conduce a más de fosforilación, 4,5 subida veces en su tendencia localización de la membrana y la elevación de la actividad quinasa que puede conducir a cáncer [1] - [6]. Por otra parte, la mutación causa la pérdida en la unión con AKT1 /2 inhibidor VIII. A pesar de los resultados experimentales han presentado el resumen marginal del mecanismo molecular asociado a la mutación E17K, todavía falta la explicación detallada del fenotipo observado a nivel molecular y atómico. Con el fin de entender los cambios estructurales y moleculares asociados, se realizó acoplamiento molecular y simulación de dinámica molecular. Los resultados obtenidos en nuestro estudio proporcionan inferencias interesantes, que apunta hacia un rápido desplazamiento conformacional en el dominio PH E17K. En primer lugar se analizó la cavidad del dominio PH AKT1 usando la herramienta CASTp unión al ligando más accesible. De los resultados CASTp, estaba claro que los residuos 38 a 52 y 77 a 87 posiciones de aminoácidos forman las regiones de la cavidad más accesibles para la interacción ligando. Para examinar el cambio en la afinidad de unión de la proteína nativa y mutante, llevamos a cabo un análisis más detallado complementariedad con el útil patchdock. En los resultados se encontraron patchdock la puntuación total de acoplamiento de mutante con ligando a ser menor en comparación con la estructura nativa (Tabla 1).
Análisis de acoplamiento molecular se llevó a cabo utilizando AutoDock 4.0 paquete para desentrañar los cambios en AKT1 /2 inhibidor VIII afinidad en la estructura mutante de unión en comparación con nativo. Se observó una notable pérdida de la afinidad de la interacción en la estructura mutante en comparación con nativo. En nativa la energía de enlace óptima fue -12,32 kcal /mol, mientras que en el mutante que se encontró que era -3,87 kcal /mol (Tabla 1). Un mejor conocimiento de los cambios en la interacción molecular se puede ver en la Fig. 1. Se observaron un total de 6 aminoácidos interacciones de residuos de ácido con AKT1 /2 inhibidor VIII en la estructura nativa, mientras que en el mutante que sólo había una interacción encontrada. Por otra parte, los patrones de interacciones nativas no se retuvieron en la estructura mutante. Los residuos Met 1, 2 Ser, Asp 3, Gln 59, Gln 79 y Arg 86, que estaban participando activamente en la interacción inhibidor en nativo, no mostraron ningún papel en la estructura mutante (Fig. 1). Estas interacciones moleculares revelaron las consecuencias perjudiciales de la mutación sobre la AKT1 /2 inhibidor de la interacción VIII afinidad del dominio PH.
Estructura de la izquierda muestra nativa PH- AKT1 /2 inhibidor VIII compleja y la estructura de la derecha muestra PH mutante ( E17K) -. AKT1 /2 inhibidor VIII complejo
interacciones proteína-ligando a menudo se acompañan de cambios significativos en su conformación. Así, para investigar la causa de AKT1 /2 inhibidor VIII pérdida de afinidad de unión en la estructura mutante y para comprender las consecuencias estructurales de la mutación E17K, se realizó simulación de dinámica molecular de nativo y el dominio PH AKT1 mutante. Investigamos RMSD, RMSF, Rg, SASA y la variación NHbond, y las fluctuaciones de distancia entre los residuos que interactúan importantes en la estructura nativa y mutante. RMSD para todos los átomos Cα de la estructura inicial se calcularon los cuales fueron considerados como el origen central para medir el sistema de la proteína. Aquí el RMSD mide la distancia media entre los átomos de la proteína en los dos estados consecutivos. En la Fig. 2 y Fig. 3, la proteína nativa y mutante PH mostraron distinta de la moda de la desviación hasta 13 ns de su estructura de partida, lo que resulta en RMSD columna vertebral ~ 0,3 en ~0.4 nativo y en el mutante. Después de 13 ns, la proteína mutante mostró PH patrón de desviación extrema hasta el final de la simulación cuando se compara con nativo. A 13137 ps la estructura mutante mostró un aumento brusco en el valor RMSD alcanzando hasta 3,36 nm y volvió aún más a 0,44 nm a 16078 ps (Fig. 2, Fig. 3). Esta tendencia de fluctuación continuó en la estructura mutante hasta el final y mostró desviaciones extremas en comparación con los nativos. Además, el mutante llegó hasta su nivel más alto en RMSD 35931 ps, alcanzando hasta 4,9 nm. Todos estos datos sugieren que de la estructura mutante se había sometido a distinta deriva conformacional largo de la simulación, mientras que tales desviaciones no se observaron en la estructura nativa. Las derivas conformacionales anteriormente observados fueron aún más en concordancia con los resultados obtenidos por el análisis de las fluctuaciones de estructura secundaria dependientes del tiempo a través del análisis DSSP. Los residuos terminales de estructura mutantes mostraron deriva conformacional de hélice alfa para doblar la forma, mientras que tales deriva no se observó en la estructura nativa (Fig. 2). Además, se observaron desviaciones conformacionales extremas en el mutante entre 25 ns-35 ns. La cantidad de curvas aumentó considerablemente después de 34 ns paso de tiempo en la estructura mutante (Fig. 2). Particularmente en la región de residuos 80 a 105, se observaron distinta manera de la deriva conformacional de hélice alfa de doblar y forma de la bobina en la estructura mutante (Fig. 2), y se muestra en la Fig. 4. Todos los resultados fueron estrechamente en concordancia a las desviaciones RMSD (Fig. 2, Fig. 3, Fig. 4). También hemos mostrado las estructuras superpuestas para nativo y mutante en el comienzo de la simulación y para pasos de tiempo específicos en los que las derivas conformacionales se produjeron en mayor rango (Fig. 2). Parecía como si también la rápida deriva había causado ciertas transiciones de dominio y los cambios conformacionales en la estructura mutante, especialmente en la región terminal C del dominio PH, en comparación con nativo.
Figura se muestra en la parte superior representa nativo y la trama DSSP mutante. En el centro, se muestran las estructuras nativas y mutantes superpuestas. Aquí se muestra el nativo en verde y en rojo mutante. En la parte inferior, se muestra el diagrama RMSD. Nativo se muestra en negro y mutante en rojo.
Nativo se muestra en negro y mutante en rojo.
A continuación se muestra el nativo en verde y en rojo mutante.
con el objetivo de determinar si la mutación afecta el comportamiento dinámico de los residuos y para examinar la causa de tales derivas conformacionales observados en RMSD y DSSP resultados, se calcularon los valores de la FMR de residuos de la columna vertebral nativas y mutantes ( Fig. 5). Se encontraron valores rmsf de residuos de mutantes para ser significativamente mayores en la estructura mutante en comparación con nativo (Fig. 5). Esto mostró que la deriva observada estuvo acompañado por aumento de las fluctuaciones en la estructura atómica mutante. El radio de giro (Rg) se define como la raíz de peso medio en masa cuadrado de la distancia del conjunto de átomos de su centro de masa común. Por lo tanto, da una idea de la dimensión global de la proteína y ha asistido al examinar la noción de derivas conformacionales rápidos observados en la estructura mutante. Radio de parcela giro para los átomos Cα de proteína frente al tiempo a 300 K se muestra en la Fig. 6. Las fluctuaciones en la estructura Rg mutante fueron muy similares a los cambios observados RMSD anteriores. Después de 13137 ps se observó un aumento brusco en los valores Rg en la estructura mutante, llegando hasta su nivel más alto de 4,1 nm, mientras que el valor de Rg estructura nativa se mantuvo en 1,5 nm. Por otra parte, en el 35931 ps llegó hasta el valor máximo de 5,62 en el mutante. Al final de la simulación, la estructura mutante mostró valor de Rg de 4.16 mientras que en nativa que se encontró que era 1,42.
Nativo se muestra en negro y mutante en rojo.
( a) fluctuaciones completos Rg. (B) no se limite a límite máximo superior Rg de 6 nm. Nativo se muestra en negro y mutante en rojo.
accesibilidad cuentas de la zona superficial de disolventes para la superficie de bimolecular evaluable a moléculas de disolvente. Subida del valor de SASA en la estructura mutante indica que es expansión relativa en comparación con los nativos. El cambio de SASA de proteína nativa y mutante con el tiempo se muestra en la Fig. 7. proteína mutante indica un mayor valor de SASA con el tiempo, mientras nativa mostró menor valor SASA. fluctuación más tiempo en la trama Rg indicó que la proteína mutante, así como el dominio de unión a ATP podrían estar experimentando una transición estructural significativo. Esto fue apoyado además por resultado SASA donde se encontró el mutante de exhibir gran SASA en comparación con los nativos. Todos estos observación colectivamente sugiere que el mutante podría haber sido sometidos a la deriva que finalmente condujo a su transición en una conformación abierta y podría haber ocurrido debido a las pérdidas de estabilidad en la estructura de proteínas. Así, para dilucidar si la mutación había causado ningún daño a la estabilidad estructural de la proteína durante el proceso de la deriva, se determinó la fluctuación total de energía a través de la simulación. Los resultados mostraron muy ligero aumento en el valor total de energía en la estructura mutante que descartó la noción de pérdida de estabilidad inducida por mutación (Fig. 8).
Nativo se muestra en negro y mutante en rojo.
nativo se muestra en negro y mutante en rojo.
enlace de hidrógeno es el principal factor para el mantenimiento de la conformación nativa de la proteína y la flexibilidad proteína es directamente proporcional a NHbonds intramoleculares entre residuos de aminoácidos [38] - [40]. análisis NHbond intramolecular de proteínas nativas y mutantes se realizaron con respecto al tiempo con el fin de comprender la relación entre la flexibilidad y la formación de enlaces de hidrógeno. estructura del mutante mostró una significativamente menor número de formación NHbond durante la simulación cuando se compara con estructura nativa (Fig. 9). Esta observación fue en concordancia con el aumento del valor de Rg y SASA en el mutante y sugiere fuertemente que las derivas conformacionales observados y el aumento de las fluctuaciones atómicos podrían haber despertado debido a la pérdida de la formación NHbond en proteínas. Por otra parte, los residuos de aminoácidos K30, K32, W36, R38, R40, Q53, R56, K57 y V58 se habían mostrado ser componentes activos en su localización a la membrana [41]. Por lo tanto, se calculó el número de NHbond formando por estos residuos para estudiar el efecto de la mutación sobre la localización de la membrana. Aunque el número total de NHbonds formados en la estructura mutante fueron significativamente más bajos en comparación con nativo, el número total de NHbonds formados en estos residuos no sufren de las pérdidas importantes impuestas por mutación. se observó pérdida en la formación NHbond en los residuos K30 y Q53, mientras que otros residuos o bien ha mostrado mayor número de NHbonds o mantenido el recuento nativo de NHbonds largo de la simulación en la estructura mutante (Fig. 10). Estos resultados fueron también en fuerte concordancia con la observación informado por Carpten et al., (2007) [1], donde se demostró que la mutación había causado aumento significativo en el potencial de localización de la membrana de proteínas. El aumento en la formación de NHbond en estos residuos podría ser un factor importante para explicar el aumento en el potencial de membrana localización de la proteína mutante
.
Nativo se muestra en negro y mutante en rojo.
(a) K30 (b) K32 (c) W36 (d) R38 (e) R40 (f) Q53 (g) R56 (h) K57 (i) V58. Nativo se muestra en negro y mutante en rojo.
La importancia de la interacción catión-π había sido examinado en varias investigaciones por su papel correspondiente en el mantenimiento de la estabilidad de las proteínas. Se investigaron un total de 3 interacciones energéticamente significativos cationes π incluyendo Arg86-Phe55 (Fig. 11a), Lys8-Trp99 (Fig. 11b) y Arg69-Trp22 en el dominio PH AKT1 (Fig. 11c). Para examinar si las interacciones de cationes π son retenidos en la estructura mutante, que investigarse más a las fluctuaciones de longitud de enlace para éstos interacción catión-π distante. Era notable observación de que se retuvieron las interacciones de cationes π en nativa, así como mutante. Por otra parte, la interacción Arg69-Trp22 mostró patrón de fluctuación distinta y podría estar jugando papel importante en la inducción de la deriva conformacional (Fig. 11c). Mediante el estudio de forma colectiva todos los cambios estructurales y moleculares en el dominio PH AKT1 podríamos decir que la deriva conformacional observado, aumento de las fluctuaciones atómicas y la pérdida de NHbonds totales en la estructura mutante contribuido significativamente en la causa de consecuencias patológicas observadas impuestas por E17K mutación. Además, el aumento de 4 veces en el potencial de membrana localización podría haber sido inducida por aumento de NHbonds en los residuos de localización de activos del dominio PH. Estas observaciones nos llevaron a la conclusión de que el cáncer asociado fenotipo observado en el caso de AKT1 PH mutación E17K dominio es causada por los reportados cambios moleculares y conformacionales que también causan resistencia a la AKT1 /2 inhibidor VIII mediante la inducción de la forma a la deriva en el bolsillo de unión correspondiente .
(a) Arg86-Phe55 (b) Lys8-Trp99 (c) Arg69-Trp22. Nativo se muestra en negro y mutante en rojo.
Conclusión
variantes de aminoácidos normalmente induce resultados patológicos al dañar la conformación nativa de la proteína. La mutación E17K en el dominio PH AKT1 había sido informado de inducir el cáncer y la resistencia a AKT1 /2 inhibidor VIII. Para examinar el mecanismo molecular detallado detrás de este resultado, se realizó molecular de acoplamiento y la simulación dinámica molecular de la estructura nativa y mutante. Las interacciones de estabilidad y de aminoácidos importantes fueron retenidos en la estructura mutante, que descartó la posibilidad de efectos perjudiciales de la mutación. Por otra parte, un aumento brusco en los valores de RMSD y derivas conformacionales se observaron en sructure mutante. Por otra parte, la resistencia a la AKT1 /2 inhibidor VIII fuerza había sido causada por los cambios en la estructura conformacional del bolsillo de unión. En conclusión, el resultado global exaplained que la causa molecular de 4 veces en la subida localización de la proteína mutante y la actividad quinasa, que tiene en última instancia causó cáncer asociado fenotipos.
Reconocimientos
Agradecemos la gestión de Instituto de Tecnología de la Universidad de Vellore y el profesor Riccardo Zecchina de HuGeF-Torino para proporcionar las facilidades para llevar a cabo este trabajo.