Extracto
glicosilación aberrante de mucinas y otras proteínas extracelulares es un acontecimiento importante en la carcinogénesis y los glicanos de cáncer asociado resultantes se han sugerido como objetivos en la inmunoterapia del cáncer. Se evaluó el papel de O-glicosilación ligada GalNAc en la captación de antígenos, el procesamiento y presentación en MHC de clase I y II moléculas. El efecto de la GalNAc O-glicosilación se monitorizó con un sistema modelo basado en la ovoalbúmina (OVA) -MUC1 péptidos de fusión (+/- glicosilación) cargado en células dendríticas co-cultivadas con IL-2 que secreta OVA hibridomas de células T específicas de péptido. Para evaluar la
vivo
respuesta a un antígeno de tumor de cáncer relacionado, /c o B6.Cg 2Enge /J (HLA-A2 transgénico) ratones Balb en (CB) -Tg (HLA-A /H2-D) fueron inmunizados con un péptido derivado no glicosilada o GalNAc-glicosilada MUC1 seguido de la comparación de la proliferación de células T, la liberación de IFN-γ, y la inducción de anticuerpos. GalNAc-glicosilación promovido presentación de péptidos de fusión OVA-MUC1 por moléculas MHC de clase II y el antígeno MUC1 suscitó producción específica Ab y la proliferación de células T tanto en ratones Balb /c y ratones transgénicos HLA-A2. Por el contrario, GalNAc-glicosilación inhibió la presentación de OVA-MUC1 péptidos de fusión de MHC de clase I y abolió las respuestas de células T CD8 + específicas de MUC1 en ratones transgénicos HLA-A2. GalNAc glicosilación de antígeno MUC1, por tanto, facilita la absorción, MHC presentación de clase II, y la respuesta de anticuerpos, pero podría bloquear la presentación de antígenos a las células T CD8 +
Visto:. Madsen CB, Petersen C, Lavrsen K, Harndahl M, Buus S , Clausen H, et al. (2012) Cáncer de la proteína asociada aberrante O-glicosilación se pueden modificar las procesamiento de antígenos y la respuesta inmune. PLoS ONE 7 (11): e50139. doi: 10.1371 /journal.pone.0050139
Editor: Isaac Yang, UCLA, Estados Unidos de América
Recibido: 1 de mayo de 2012; Aceptado: 17 de octubre de 2012; Publicado: 26 Noviembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Madsen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este proyecto fue apoyado por la Fundación Novo Nordisk, el Consejo danés de Investigación médica, la Fundación de Investigación del cáncer de Dinamarca, los Agnes y Fundación Poul Friis, la Sociedad danesa del cáncer, la Universidad de Copenhague (Programa de Excelencia), EU-FP7, Agencia danesa para la Ciencia y Tecnología y la Innovación (FTP). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
vacunas contra el cáncer son muy prometedores para la eficacia terapéutica a largo duradera [1]. vacunas contra el cáncer experimental actuales apuntan principalmente para provocar inmunidad celular a través de la inducción de células T CD8 + específicas [2] - [5]. Sin embargo, la creciente evidencia demuestra el valor de anticuerpos en la erradicación del tumor [6], [7]. En consecuencia, existe un interés creciente en el diseño de vacunas que pueden activar tanto las células CD4 + y T CD8 + y de ese modo provocar simultáneamente la inmunidad humoral y celular del cáncer [8]. proteínas alteradas presentados en las células cancerosas son antígenos tumorales importantes, que puede ser objetivo de vacunas y anticuerpos terapéuticos. La mayoría de las proteínas de la superficie celular están glicosilados, y la transformación maligna de las células siempre se acompaña de alteraciones de modificaciones posteriores a la traducción de proteínas [9]. Aberrante de tipo mucina O-glicosilación representa uno de los cambios más abundante del cáncer postraduccional asociados creando un conjunto diverso de estructuras moleculares que se encuentran en la superficie de las células cancerosas, pero no en las células normales [9], [10]. Como resultado, el patrón específico del cáncer asociado estructuras de glicanos cortos en las proteínas asociadas al cáncer produce nuevos epítopos de glicopéptidos que pueden ser objetivo por el sistema inmune [11], [12]. Glicanos asociados
Cáncer cáncer afectan inmunidad de varias maneras. Los glicanos son aberrantes inmunogénica por sí mismos, y truncadas O-glicanos (TN: GalNAc-S /T; STN: NeuAcα2,6GalNAc-S /T y T: Galβ1,3 GalNAc-S /T) son reconocidos como pan-carcinoma antígenos a los que los anticuerpos circulantes se encuentran en niveles elevados en pacientes con cáncer. glicanos aberrantes también pueden inducir nuevos epítopos en proteínas, causando el cambio conformacional o mediante la creación de nuevos epítopos S-glicopéptido [13], [14]. Además, los glicanos de cáncer asociado pueden ser incluidas en el diseño de epítopos inmunogénicos que puede inducir
in vivo
respuestas inmunes anti-tumorales [15]. Una base importante para la inmunidad inducida glucano es que glicanos aberrantes pueden unirse a los receptores de lectina. Por ejemplo, lectina de unión a galactosa macrófagos (MGL) -mediates absorción de O-glicoproteínas específicas en las células dendríticas [10], [16]. De hecho, las células dendríticas son los más potentes células presentadoras de antígenos para el cebado de ingenuo CD8 + y las células T CD4 +. Llevan una gama de receptores de hidratos de carbono de la familia de lectina tipo C (revisado en [17]) y poseen una capacidad única para transversal presentan antígenos extracelulares a las células T CD8 + [18]. La absorción selectiva de los antígenos de GalNAc-glicosilada (TN-antígenos) por la célula dendrítica humana y murina común (DC) lectina tipo C MGL, [19], [20] hace que sea posible inducir anticuerpos glucopeptídicos específico del cáncer en ratones y en el hombre mediante la inducción de una célula Th CD4 + [11], [13], [14], [21]. Tal Tn-glicopéptidos anticuerpos específicos median la citotoxicidad dependiente de anticuerpos [11], [12], [22], [23], y la aparición de anticuerpos específicos de glicopéptidos naturales en los pacientes con cáncer que se sugiere que se asocia con aumento de la supervivencia [21]. Por el contrario, muy pocas células T CD8 + dirigidas a los epítopos de glicopéptidos de antígenos tumorales extracelulares (por ejemplo, mucina 1 (MUC1)) se han descrito [24], [25].
La glicoproteína asociada a cáncer de MUC1 es un modelo importante de la molécula en la inmunoterapia del cáncer y está glicosilado de forma aberrante en la mayoría de los adenocarcinomas [26]. El dominio extracelular de MUC1 consiste de 20-120 repeticiones en tándem (VNTR), que contienen cada uno 20 aminoácidos con 5 sitios de O-glicosilación potenciales [27]. La inmunización de B6.Cg (CB) -Tg (HLA-A /H2-D) 2Enge /J (HLA-A2 ratones transgénicos) [28] y los chimpancés [29] con los antígenos MUC1 no glicosiladas ha suscitado péptido MUC1 específica CD4 + y las respuestas de células T CD8 + y varios epítopos de células T CD8 + se han identificado dentro de los dominios extracelulares e intracelulares de MUC1 [28], [30] - [33]. En ratones transgénicos MUC1 la respuesta a las vacunas a base de péptido MUC1 no glicosilada ha, sin embargo, ha sido muy baja con pequeño o no detectable CD4 + y respuestas de células T CD8 + [34], [35]. péptido MUC1 no glicosilada conjugado con el manano glicoconjugado inmunogénica suscitó una fuerte respuesta inmune, incluyendo las células T CD8 + [31]. respuestas de las células humorales y T CD4 + En los seres humanos, las vacunas de péptidos MUC1 no glicosiladas han evocado principalmente [36] - [38], mientras que las vacunas basados en virus y DC también han generado linfocitos T citotóxicos (CTL) [39] - [44] . La inducción de células T CD8 + se observó sólo en pocos pacientes o después de varias rondas de re-estimulación
in vitro
[39] - [44], la eficacia, sin embargo, varias de las vacunas han demostrado, aunque limitada [38 ] - [41], [44] - [57]. Dos vacunas virales que expresan MUC1, ya sea en combinación con IL-2 (TG4010) [41], [48] - [51] o en combinación con el antígeno carcinoembrionario (PANVAC) [52], han demostrado efecto clínico en pacientes con no pequeñas de pulmón de células y el cáncer de páncreas [39] - [41], [48] - [52]. Además, el efecto clínico también se ha demostrado con la vacuna liposomal (BLP25) que consiste en un péptido mer no glicosilada 25 de la región de repetición en tándem de MUC1 [53] - [57]. Curiosamente, en un pequeño estudio clínico en pacientes con cáncer de mama en etapa temprana inmunizados con manano-MUC1, la vacuna induce tanto respuestas humorales y de células T que no glicosilada MUC1 y la recurrencia de la enfermedad [45] eliminó.
La mayoría vacunas anteriores se han dirigido no glicosilada MUC1, aunque esto podría no ser el objetivo más específico de cáncer. Orientación de cáncer asociado epítopos MUC1 en glicopéptidos tales como GalNAc-MUC1 [11], [12], [58] sería favorable, pero la biosíntesis de los epítopos MUC1 glicopeptıdicos expresadas por los tumores se ha visto obstaculizada por la falta de tecnologías pertinentes y altos costos. Por lo tanto, en este momento no está claro cómo se glicanos afectar a la captación, la presentación, el reconocimiento, y la inducción de respuestas inmunes frente a epítopos de células T CD8 +. Aunque la presencia de glicanos podría tener un efecto positivo en la absorción de antígenos glicosilados [19], [20], [59], glicanos podría comprometer la entrada en la inmuno-proteasoma [60], la escisión proteasomal, translocación TAP mediada, y péptido carga en moléculas MHC de clase I [60], [61].
en este estudio hemos examinado la consecuencia de MUC1 GalNAc-glicosilación en la activación de los antígenos de células conocidas T CD8 + y CD4 +. Nos aprovechamos de la ovoalbúmina sistema modelo utilizando péptidos de fusión que contienen OVA-MUC1 la inmunodominante MHC de clase I (SIINFEKL) y epítopos OVA MHC de clase II (ISQAVHAAHAEINEAGR) como lectura para la captación y procesamiento de antígenos. Los epítopos estaban flanqueados por GalNAc glicosilada o secuencias de péptidos derivados de MUC1 no glicosiladas. Además, se examinó el efecto de GalNAc glicosilación de un glicopéptido MUC1 asociado al tumor fisiológica conocida para inducir CD4 + y respuestas de células T CD8 +. Este péptido (AHGVTSAPDNRPALGSTAPPVHNV) tiene una estrecha homología de secuencia con la repetición en tándem de MUC1, pero contiene un epítopo de HLA-A2 carente de la repetición en tándem. Se presentan datos que sugieren que los residuos GalNAc captación de antígenos MHC de ayuda y presentación de clase II para la generación de una respuesta de anticuerpos específica del cáncer potente, y la presentación de bloques de células T CD8 +.
Resultados
GalNAc- Mejora la glicosilación respuestas de células T CD4 +
en primer lugar, investigó el papel de GalNAc-glicosilación en el procesamiento de antígenos de péptido y presentación de péptidos en moléculas II (Figura 1) MHC de clase. El potente I-A
b de unión al péptido OVA se fusionó a una secuencia derivada MUC1 con y sin GalNAc-glicosilación (Tabla 1) y se cargó en los países en desarrollo que estaban co-cultivadas con péptido de ovoalbúmina /MHC de clase II complejo específico hibridomas de células T. Países en desarrollo cargados con glicopéptidos aumentaron la respuesta específica hibridoma de células T CD4 + OVA al péptido derivado de OVA cuando se compara con el péptido no glicosilado, independientemente de donde el epítopo OVA se encuentra en la secuencia del péptido (Figura 1B). Los péptidos que contienen cuatro residuos GalNAc-indujeron una respuesta mayor que los péptidos que contienen dos residuos GalNAc [62], [63] (Figura 1B). Incluso concentraciones muy bajas (30 nM) de glicopéptidos estimularon el hibridoma de células T CD4 +, mientras que las concentraciones bajas de péptido no glicosilado inducido ninguna respuesta (datos no mostrados).
visión general de síntesis A) O-glicano. B) IL-2 de producción de OVA específica hibridoma de células T CD4 + (BO.97.10) co-cultivadas con médula ósea DCs derivadas pulsadas con dos variantes de péptidos con y sin 2 y 4 residuos de glicano (GalNAc). OVA de longitud completa se utiliza como control positivo. células cultivadas de forma individual T y los países en desarrollo tenían un valor de DO igual a un segundo plano.
GalNAc glicosilación Inhibe la Elaboración y Presentación de un MHC de clase I de unión del péptido
in vitro
el mismo sistema modelo se utilizó para investigar la influencia de GalNAc glicosilación en la presentación de MHC de clase I.
In vitro
generado, así como purificados DCs CD11c + de bazo, se cargaron con GalNAc glicosilada o péptidos no glicosilados de fusión MUC1-SIINFEKL (Tabla 1). En contraste con los resultados obtenidos con MHC presentación de clase II, GalNAc glicosilación de MUC1-SIINFEKL resultó en la activación inferior de SIINFEKL /H2-K
b hibridomas de células T específicas en comparación con péptidos no glicosilados con independencia del origen de las DCs (Figura 2A-B). Estamos próximos a prueba cómo la localización de los residuos de glicano en relación con el MHC de clase I epítopo de unión afectó a la respuesta de células T CD8 +. DCs se estimularon utilizando péptidos de fusión con SIINFEKL ya sea flanqueado por sitios de glicosilación o localizadas en el extremo C-terminal del péptido. Los péptidos de fusión con SIINFEKL terminal de demostraron una respuesta aumento de hibridoma de células T en comparación con el péptido de fusión con SIINFEKL localizada dentro de la repetición MUC1 independientemente de si los péptidos se glicosilados o no. Análisis de citometría de flujo de la SIINFEKL /H2-K
b compleja en países en desarrollo después de procesamiento de péptidos confirmó inferior presentación de MHC de clase I de GalNAc-glicosilada péptidos en comparación con péptidos no glicosilados (Figura 2C-E).
IL-2 de producción de OVA específica hibridoma de células T CD8 + (RF 33,70) co-cultivadas con DC derivadas de médula ósea (a) o CD11c + DCs purificadas a partir de bazo de ratón (B). DC se pulsaron con dos variantes de péptidos con y sin 2 y 4 restos de glicanos (GalNAc). de longitud completa OVA se usó como control positivo. Individualmente las células T y los DC cultivadas tenían un valor de DO igual a un segundo plano. La expresión en superficie por citometría de flujo de SIINFEKL en el surco de unión en países en desarrollo después de la pulsación con las dos variantes de péptidos (péptido no glicosilada (delgada púrpura línea discontinua), péptido con 2 GalNAcs péptido H2kb (línea gruesa verde) C, D), o 4 GalNAcs (línea rosa)). E) La expresión superficial de SIINFEKL en el surco de unión del péptido H2kb en países en desarrollo sin numeración (línea azul) y después pulsando con el control de OVA (línea morada). histogramas grises representan las células teñidas únicamente con anticuerpo secundario.
GalNAc La glicosilación de una proliferación celular MUC Derivado de Antígeno Específico provoca anticuerpos IgG y T
in vivo
El amino secuencia de ácido del 24 mer péptido MUC1 sintético (degMUC1) se asemeja a la repetición en tándem de MUC1, sin embargo, su secuencia de aminoácidos se altera ligeramente dando como resultado un epítopo HLA-A2 (ALGSTAPPV) [28]. DegMUC1 tanto, es óptima para la inclusión en las vacunas de cáncer humano destinadas a inducir respuestas de CTL específicas de MUC1. Para investigar el papel de la glicosilación GalNAc
in vivo
para este antígeno tumoral modelo MUC1, inmunizamos ratones Balb /c y ratones transgénicos HLA-A2 con degMUC1 con y sin GalNAc glicosilación. los ratones Balb /c inmunizados con degMUC1 GalNAc-glicosilada desarrollaron una fuerte respuesta de IgG específica para degMUC1, mientras que no hubo respuesta en los ratones inmunizados con el degMUC1 no glicosilada (Figura 3A). Inmunizaciones con degMUC1 glicosiladas y no glicosiladas KLH conjugados dieron como resultado una respuesta de IgG en dos cepas de ratón, aunque la variante glicosilada dio lugar a una respuesta más prominente (datos no mostrados). De acuerdo con la respuesta de IgG humoral, los ratones Balb /c inmunizados con GalNAc degMUC1 provocaron proliferación significativa de células T después de la re-estimulación con cualquiera degMUC1 no glicosiladas (P≤0,0004) GalNAc o. No se detectó la proliferación de células T en ratones inmunizados con degMUC1 no glicosilada (Figura 3B). Similar, una respuesta proliferativa más alta se observó en los ratones transgénicos HLA-A2 inmunizados con glicosilada en comparación con degMUC1 no glicosiladas que verifican el efecto positivo de GalNAc glicosilación en la reactividad de las células T CD4 + y la respuesta inmune humoral (Figura 3C). Como un derivado de proteína purificada de control de tuberculina (PPD) estimulación resultó en la proliferación de células T similares en ambos grupos de ratones transgénicos HLA-A2.
A) la reactividad del suero de diferentes glicoformas de mucina procedentes de ratones Balb /c inmunizados con degMUC1 + /- GalNAc por ELISA. Los datos son representativos de un mínimo de 4 ratones Balb /c inmunizados con cada antígeno. (B) la proliferación de células T de ratones de ratones Balb /c o (C) ratones HLA-A2 inmunizados con GalNAc degMUC1 (barras blancas) y degMUC1 no glicosilada (barras grises) para cada péptido utilizado para
in vitro
re-estimulación (100 ug /ml) como se indica en el eje x. D) Los linfocitos de los ratones HLA-A2 inmunizados pulsadas con el péptido degMUC1 9 mer, ALGSTAPPV, con y sin glicosilación. Se seleccionaron DegMUC1 células T CD8 + específicas basadas en anti-CD8 Ab (eje x) y anti-IFN Ab (eje y) después de 4 horas de tratamiento de detención del Golgi. E) Las células de bazo después de 24 días de re-estimulación con el péptido ALGSTAPPV no glicosilada. Todos los datos de las células T se genera a partir de bazo o ganglios linfáticos de al menos 4 ratones, pero en la mayoría de los casos 6 ratones.
GalNAc La glicosilación de un antígeno MUC1 Bloque Derivado de la célula CD8 + T de respuesta
In vivo
a continuación examinó la respuesta de células T CD8 + después de la inmunización de ratones transgénicos HLA-A2 con degMUC1 (+/- GalNAc glicosilación), seguida por la re-estimulación con el degMUC1 9 mer CD8 + epítopo ALGSTAPPV (+ /- glicosilación GalNAc). Sólo los ratones que se inmunizaron y volvieron a estimular con el péptido degMUC1 no glicosilada generado IFN-γ producción, ALGSTAPPV específica, las células T CD8 +, mientras que no se observó respuesta en los ratones inmunizados con la GalNAc glicosilada degMUC1 (Figura 3D). las células T de ratones inmunizados fueron ampliados por la re-estimulación
in vitro
para un total de 24 días con ALGSTAPPV confirmar que solamente los ratones inmunizados con los degMUC1 no glicosiladas respondieron a re-estimulación con ALGSTAPPV (Figura 3E) . A continuación, analizamos la estabilidad y la afinidad del complejo HLA-A * 02:01-ALGSTAPPV con y sin GalNAc glicosilación. El HLA-A * 2:01-ALGSTAPPV complejo tenía una vida media de 19 horas y una afinidad de 100 nM, mientras que el HLA-A * 0201-ALGST [GalNAc] complejo APPV tenía una vida media de 11 horas con una afinidad de 300 nM. Por lo tanto, ALGST [GalNAc] APPV es todavía un aglutinante intermedio sólido y debe ser capaz de provocar una respuesta de células T CD8 + sobre la base de los datos de unión de MHC.
High Density GalNAc glicosilación aumenta la captación de MUC1 y MUC2 péptidos derivados pero inhibe MHC de clase I Presentación
Densidad de glicosilación puede afectar a la captación mediada por los receptores de lectina, como MGL. Por lo tanto, se especuló que la falta de respuestas de células T CD8 + contra péptidos GalNAc degMUC1 podría ser causada por una baja utilización de los péptidos MUC1 corta GalNAc modificados. Aunque, un número limitado de residuos GalNAc son suficientes para inducir una respuesta potente I-Ab, podría ser insuficiente para la presentación transversal necesaria para inducir una H-2K
b respuesta. Para probar el efecto de la densidad de GalNAc que pulsaron con DCs biotinilado 60 merMUC1-péptido GalNAc-glicosilada que abarca tres repeticiones en tándem de MUC1 (60 merMUC1). Mientras GalNAc incorporación no aumentó la captación de la forma de monómero de 60 merMUC1, aumento de la captación se observó cuando la formación del complejo fue inducida por estreptavidina (datos no mostrados). A continuación, probamos la captación de perlas fluorescentes recubiertas con MUC1 con y sin glicosilación. Perlas recubiertas con GalNAc MUC1, que proporcionan una densidad muy alta de GalNAc MUC1, dieron lugar a un marcado incremento en la absorción en comparación con MUC1 no glicosilada (Figura 4A). El efecto de múltiples residuos GalNAc en la absorción de DC nos llevó a probar si los péptidos sintéticos que contienen múltiples residuos GalNAc podrían superar la falta de presentación transversal de epítopos de células T CD8 + observadas con los péptidos MUC1 más cortos. Un péptido de fusión que contiene múltiples sitios de MUC2 glicosilaciones GalNAc fue diseñado y
in vitro
glicosilada para producir un péptido con y sin 9-10 residuos GalNAc localizadas en la secuencia de MUC2. El péptido de fusión GalNAc MUC2 fue tomada fácilmente por el DCs (Figura 4B). expresión de la superficie Sin embargo, GalNAc glicosilación aún inhibe de SIINFEKL /H2-K
B complejos y la activación de hibridoma de células T fue menor (Figura 4C-D). Obtención de imágenes de péptido de fusión MUC2 interiorizado con y sin GalNAc confirmada aumento de la captación del péptido GalNAc-glicosilada por el DCs (Figura 4E-F). El péptido GalNAc MUC2 predominantemente co-localizada con marcador lisosomal LAMP-2, mientras que el péptido de fusión MUC2 no glicosilada predominantemente co-localizada con principios marcador endosomal EEE-1 (Figura 4E-F, Figura S1). En conclusión, GalNAc glicosilación aumenta la absorción, pero impide el procesamiento de los dos péptidos de fusión que contienen MHC de clase I epítopos de unión.
A) la captación de corriente continua de perlas fluorescentes no recubiertos, perlas de MUC1-fluorescentes, o perlas fluorescentes GalNAc MUC1. DCs sin perlas se utilizan como referencia. B) La ejecución de los péptido de fusión MUC2 +/- GalNAc fue evaluada por citometría de flujo después de 48 horas de pulsos de péptidos. DC no teñidas de color púrpura (relleno) y las DC sin carga péptido (verde) se utilizaron como control de fondo. C) Evaluación de la expresión en la superficie por citometría de flujo de SIINFEKL en la ranura de unión a péptidos H2kb. Países en desarrollo fueron pulsadas con el péptido de fusión MUC2 (la más alta concentración de D) con GalNAc (línea verde) y sin GalNAc (púrpura rellenos) 48 horas antes de la tinción. D) de IL-2 de SIINFEKL específica hibridoma de células T CD8 + (RF 33,70) co-cultivadas con países en desarrollo derivados de la médula ósea pulsado
in vitro Opiniones de dos días con péptido de fusión MUC2 con y sin glicosilación en un gradiente de concentración . de longitud completa OVA se usó como control positivo. Se muestran los datos representativos de al menos dos experimentos independientes. E, F) Confocal de imágenes de DC internalizado fusión GalNAc MUC2 (E, verde) y la fusión MUC2 (F, verde) co-teñidas con marcador endosomal EEE-1 (rojo) y el marcador lisosomal LAMP-2 (rojo).
Discusión
cáncer glicanos aberrantes asociados representan potentes antígenos tumorales [11], [12]. Uso de MUC1 y ovoalbúmina como moléculas modelo se presentan datos que sugieren que GalNAc glicosilación aumenta la captación de antígenos, MHC clase II presentación, y la activación de células T CD4 + inducir respuestas de anticuerpos potentes. Por el contrario, GalNAc glicosilación puede inhibir MHC de clase I de antígenos presentación y activación de las células T CD8 + específicas de antígeno.
Está claro que GalNAc glicosilación potencia las respuestas de anticuerpos y proliferación de células T después de la inmunización con un péptido modificado GalNAc MUC1 ( degMUC1) (Figura 3A). Una explicación para esta respuesta de anticuerpos inducida GalNAc
in vivo
es probable que sea el aumento de la presentación de antígenos, y después de la estimulación de células T observada en GalNAc glicosilación de las degMUC1 de péptidos que contienen un modelo OVA deriva IA
b péptido de unión (Figura 1). Esto está de acuerdo con nuestra anterior conclusión de fuertes respuestas IgG contra MUC1 GalNAc en ratones transgénicos humanos MUC1 [11], [12] y los pacientes con cáncer [13], [14]. Además, es consistente con la mejora de las respuestas de células T CD4 + a OVA conjugados con restos GalNAc en otros estudios [59]. La capacidad de GalNAc de romper la tolerancia inmunológica y para ayudar a la generación de una respuesta inmune humoral dependiente de células T CD4 + es de particular importancia en la inmunoterapia del cáncer dirigida a la generación de anticuerpos de IgG. Por otra parte, la inducción específica de las células T CD4 + se ha sugerido para conducir a la erradicación del tumor por respuestas tardías de hipersensibilidad de tipo [64] y, recientemente, los pacientes de cáncer se han curado después de la transferencia adoptiva de células T CD4 + con la reactividad del tumor [65].
El inmunodominante H2-K
b de unión al péptido SIINFEKL, derivado de OVA, se usó como lectura para la presentación de MHC de clase I. Aquí, GalNAc glicosilación del péptido MUC1 flanqueando inhibida MHC presentación de clase I de SIINFEKL en países en desarrollo, así como la activación de una respuesta de células CD8 + T específica (Figura 2). De acuerdo con estos resultados, la inducción GalNAc glicosilación inhibido de las respuestas de células T CD8 +
in vivo
después de la inmunización de ratones transgénicos HLA-A2 con un péptido GalNAc glicosilada degMUC1 que contiene el HLA-A * 2:01 epítopo de unión (ALGSTAPPV ) en comparación con la variante no glicosilada (Figura 3D-E). Esto podría explicarse por la disminución de la estabilidad de la HLA-A * complejo 2:01-ALGSTAPPV cuando el péptido es GalNAc-glicosilada. Sin embargo, a pesar de HLA-A * 2:01 afinidad y la estabilidad del péptido GalNAc-glicosilada de unión se reduce ligeramente todavía parece unirse a un nivel que es suficiente para la inmunogenicidad. Por lo tanto, nuestras observaciones sugieren explicaciones alternativas. Una posibilidad es que glicopéptidos alteran la activación DC, cambiando de este modo la activación de células T. Para apoyar esta se ha demostrado que las glicoformas MUC1 selectivos inducen tolerancia de células T [66]. Sin embargo, el efecto inhibidor más probable se lleva a cabo durante el procesamiento ya que menos de péptidos complejos MHC /llegaron a la superficie de las DCs. Por lo tanto, el efecto de la GalNAc en la respuesta de las células CD8 + T puede ser debido a la inhibición de la escisión proteasomal. Esta explicación también ha sido confirmado por estudios bioquímicos de la escisión de los péptidos derivados de MUC1 por las enzimas purificadas immunoproteosomal [60]. En este estudio, la glicosilación, tanto en el -VTS- y -GST- sitios de la secuencia de repetición en tándem de MUC1 (VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG) resultó en bloque total de procesamiento de antígenos, mientras que GalNAc glicosilación en sólo uno de estos sitios de procesamiento de antígeno inhibido. Esto explicaría nuestra presentación parcial del epítopo CD8 +, SIINFEKL, cuando sólo dos GalNAcs estaban presentes en el péptido de fusión SIINFEKL-MUC1, mientras que la glicosilación con cuatro GalNAcs por repetición de plomo a un bloque casi total de la presentación. De acuerdo con nuestro
in vitro
hallazgos, se ha demostrado que la función de las células T CD8 + se correlaciona inversamente con el grado de glicosilación de la proteína MUC1 se usa para el cebado de las células T CD8 + [67]. Esto apoya la idea de que la glicosilación puede representar un problema en la inducción de células T CD8 +.
aumento de la captación de antígenos por APC es de gran importancia en la determinación de las respuestas de células T [19], [20]. Se ha demostrado que GalNAc MUC1 reviste sobre microperlas fluorescentes son internalizados por las DC humanas a través de la unión con el de tipo de galactosa de tipo C de la lectina de macrófagos (MGL) y entregado a HLA de clase 1 y 2 compartimentos dentro de la DC [19], [20] . También se ha demostrado que GalNAc conjugado OVA dianas proteicas MGL y proporciona una mejor absorción y respuesta de células T CD8 + [59]. Esto está en contraste con nuestros hallazgos con antígenos peptídicos pequeños. La densidad de glicosilación podría explicar en parte este. A partir de nuestros resultados, es evidente que densamente glicosilada 60 MUC1 mer en complejo con estreptavidina y se revistió sobre microperlas inducidas marcadamente aumento de la absorción (Figura 4A). Con el fin de probar si la introducción de múltiples residuos GalNAc aumentó la activación de células T CD8 +, hemos creado un péptido de fusión MUC2 densamente glicosilada con un enlazador escindible entre los dos elementos de péptidos [68], [69]. MUC2 fue elegido debido a que tiene múltiples sitios de glicosilación con una densidad mucho mayor que MUC1 que resulta en un péptido con más de dos veces más residuos GalNAc en la secuencia de ácido 25 amino. Como era de esperar, la fusión GalNAc MUC2 se recogió de manera más eficiente que la contraparte no glicosilada (Figura 4B). Sin embargo, esto no se refleja en la activación de las células T CD8 + específicas o expresión en la superficie /MHC péptido (Figura 4C-D). Presumiblemente, los bloques de glicosilación densa GalNAc activación de las células T CD8 +, ya sea mediante la inhibición de procesamiento de antígenos o dirigiendo el inmunógeno para los compartimentos no MHC I. Apoyar a estos últimos, las imágenes microscopio confocal demostrado co-localización de la proteína de fusión GalNAc MUC2 interiorizado con LAMP-2. Por el contrario, no glicosilada MUC2 co-localizada con el marcador endosomal temprano EAA-1 (Figura 4E-F, Figura S1). Cabe señalar, sin embargo, que una inducción robusto de GalNAc-MUC1 y MUC1 CTLs específicos han sido reportados en estudios murinos utilizando un adyuvante agonista de TLR-2 ligado a un epítopo de células T helper polio derivada y un tándem glicosilada solo GalNAc repetir MUC1 [70 ]. El grado y la localización de los glicanos, la inclusión de epítopos helper, y la vía de absorción son de gran importancia para la respuesta inmune.
En conclusión, nuestros datos sugieren que aberrante GalNAc O-glicosilación puede inhibir la generación de una respuesta de las células de cáncer específico CD8 + T pesar del aumento de la captación de antígenos por países en desarrollo. Esto podría ser un problema potencial para el diseño de vacunas contra el cáncer de orientación MUC1. La creación de péptidos de fusión con dos o más antígenos de las células CD4 + y T CD8 +, en la que se han introducido los sitios de escisión y de procesamiento específicas, podría superar este problema. Sin embargo, tales enfoques pueden resultar difícil debido a la inhibición de las respuestas de células T CD8 + se ha observado incluso cuando los residuos GalNAc se separaron del epítopo de células T CD8 + con una secuencia de engarce. En conclusión, GalNAc glicosilación de antígenos peptídicos puede impulsar la generación de respuestas de células T CD4 +, pero inhibir las respuestas de células T CD8 +.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Todos los animales los experimentos fueron aprobados por la instalación para animales local y la Administración de Alimentos y Veterinaria danesa con el número de registro: 2008 /561-1460. Los animales se controlaron diariamente después de la inyección para detectar efectos secundarios no deseados y se sacrificaron por dislocación cervical en el final del experimento.
péptidos
MUC1 60 mer-péptido (VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG
)
3 con y sin la biotinilación (Bio) como se describe anteriormente [19], MUC2 (ITTTTTVTPTPTPTGTQTPTTTP), péptido de fusión MUC2 (biotina-PTTTPITTTTTVTPTPTPTGTQTPTAAAAAAPSIINFEKL), degenerado (deg) MUC1 24 mer (AHGVTSAPDNRPALGSTAPPVHNV), 9 péptido meric ALGSTAPPV y péptidos de fusión OVA-MUC1 (Tabla 1) fueron adquiridos de Schafer-N (Dinamarca) y glicosilada
in vitro
utilizando glicosiltransferasas recombinantes humanos GalNAc-T2, y -T11-T4 como se describe anteriormente [12]. Las concentraciones de todos los péptidos se equilibraron por las curvas de calibración de HPLC y la degradación de los péptidos en suero fue insignificante durante el periodo relevante h 48 (datos no presentados). se hicieron KLH péptidos conjugados como se describe anteriormente [11].
Medición de péptido-MHC-I La afinidad y la estabilidad
Las mediciones * 0201 afinidad de péptido-HLA-A se realizaron utilizando un AlphaScreen homogénea ensayo basado en [71]. la estabilidad pMHC-I se midió utilizando un ensayo de proximidad de centelleo homogénea [72]
Líneas Celulares
El siguiente péptido OVA /se utilizaron complejos MHC hibridomas específicos:. ISQAVHAAHAEINEAGR /IA
b complejo hibridoma de células T específicas BO-97.10 [73] fue una especie de regalo de John Kappler y Philippa Marrack y el SIINFEKL /H-2K
b hibridoma de células B específicas complejo 25- D1-16 [74] fue una especie de regalo de Ronald D Germain (NIH). También se utilizó complejo SIINFEKL /H-2Kb restringido el hibridoma de células T RF33.70 [75]. Todas las células se mantuvieron en RPMI 1640 con glutamax, 100 U /ml de penicilina y 0,1 mg /ml de estreptomicina, así como 10% de FCS (medio estándar). Más 5% de suplemento de enriquecimiento se añadieron hibridomas de células T. El suplemento de enriquecimiento contiene: glucosa, aminoácidos esenciales y no esenciales, etanolamina, Na.pyrovat, insulina, testosterona, 2-ME y ácido linoleico. Para el hibridoma de células B FCS al 5%, 0,1% de SSR-3 y el 5% de suplemento de enriquecimiento se añadió.
Ratones y Protocolo de inmunización
Todos los ratones se mantuvieron en el alojamiento de los animales instalaciones de la Facultad de Ciencias de la Salud y medicina (Universidad de Copenhague). Todos los experimentos han sido aprobados por las autoridades danesas.