Extracto
Durante la progresión de mesotelioma peritoneal maligno (MPEM), nódulos tumorales se propagan de forma difusa en el abdomen y los tumores se caracterizan por fenotípica distinta subtipos. Estudios recientes en los cánceres de órganos sólidos han demostrado que las células madre del cáncer (CSC) desempeñan un papel fundamental en la iniciación y progresión de tumores. Sin embargo, no se sabe si existen células madre tumorigénicas y si promueven el crecimiento tumoral en MPEM. En este estudio, hemos desarrollado y caracterizado un modelo de CSC para MPEM uso de células madre tumorigénicas de forma estable expandibles derivadas de tumores de pacientes. Encontramos poblaciones morfológicamente distintos de células madre cancerosas que se dividen asimétricamente o simétricamente en MPEM
in vitro
cultivo celular in. Las células madre MPEM (MPeMSCs) marcadores de células madre expresa c-MYC, NES y VEGFR2 y en presencia de componentes de la matriz células forman esferas de colonias. MPeMSCs son multipotentes, se diferencian en neuronas, vascular y la progenie adiposo tras la inducción definido y las células que se diferencian expresan marcadores específicos de linaje como TUBB3, un marcador neuronal temprana; vWF, VEGFA, VEGFC y IL-8, marcadores endoteliales; y PPAR y FABP4, marcadores de tejido adiposo. experimentos de xenotrasplante utilizando MPeMSCs demostraron el crecimiento tumoral temprana en comparación con las células parentales. La limitación de experimentos de dilución utilizando MPeMSCs y células del linaje inducido endoteliales derivadas de una única MPeMSC resultó en el crecimiento tumoral temprano en el último grupo que indica que la diferenciación endotelial de MPeMSCs es importante para la iniciación del tumor MPEM. Nuestra observación de que los tumores MPEM contienen células con potencial tumorigénico madre tiene importantes implicaciones para la comprensión de las células de origen y la progresión tumoral en MPEM y por lo tanto las CSC de orientación pueden ser una estrategia útil para inhibir la progresión maligna
Visto:. Varghese S , Whipple R, Martin SS, Alexander HR (2012) células madre del cáncer Multipotentes Derivado de mesotelioma maligno humano peritoneal promueve tumores. PLoS ONE 7 (12): e52825. doi: 10.1371 /journal.pone.0052825
Editor: José Najbauer, Ciudad del Centro Médico Nacional de la Esperanza y el Instituto de Investigación Beckman, Estados Unidos de América
Recibido: 13 Agosto, 2012; Aceptado: 23 Noviembre 2012; Publicado: December 28, 2012
Derechos de Autor © 2012 Varghese et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer stem- (como) -Cells con auto potencial de iniciar -Renovación y tumor se han identificado en diferentes tipos de tumores [1] - [3] y la evidencia reciente sugiere que estas células juegan un papel central en la progresión de tumores malignos. El modelo CSC describe la existencia de una pequeña subpoblación de células de plástico con un potencial de transdiferenciación en los tumores. Sin embargo, estudios recientes sugieren que una proporción importante de las células dentro de los tumores a mantener propiedades de células madre y las células aún más diferenciada puede ser transformado en células madre similares a [4], [5]. Si este es el caso, la eliminación de células madre cancerosas podría no ser una estrategia útil para la reducción del crecimiento del tumor. Por lo tanto, es importante el desarrollo de modelos para entender la biología CSC e identificar nuevas estrategias para prevenir la progresión del tumor maligno. Se cree que los mecanismos que regulan la auto-renovación de células madre cancerosas y ambas células madre normales a ser similares [6]. Actualmente, la identificación y el aislamiento de células madre cancerosas han sido en gran parte dependiente de marcadores de superficie celular específicos [7], [8], aunque la expresión de tales marcadores es dependiente de varios factores tales como el estado de diferenciación de las células y factores de nicho. CD133 se ha utilizado como un marcador de células madre putativa en glioblastoma [9] y el cáncer de colon [10], CD34 que expresan las células epiteliales tumorales como células madre cancerosas en el cáncer cutáneo [11], CD44 células en el cáncer de mama que expresa [12], las células CD26 positivas son involucrados en el proceso de metástasis, invasión y la quimiorresistencia en cáncer de colon [13], las células CD271 positivas inician la progresión del melanoma y metástasis [14] y las propiedades de los CAC se identificaron en células de mesotelioma pleural positivas CD24 [15]. Sin embargo, no ha habido ninguna evidencia de la existencia de células madre similares que inician el crecimiento tumoral en MPEM. Por lo tanto, se determinó la presencia de células del mesotelioma tumorigénicos con propiedades de células madre cancerosas en líneas celulares estables derivados de tumores de pacientes MPEM
maligno mesotelioma peritoneal difusa origina en el revestimiento serosa del peritoneo.; es un cáncer agresivo con una tendencia marcada para las metástasis regionales. Al momento del diagnóstico, este cáncer se encuentra generalmente en una etapa de la progresión maligna difusa con un gran número de nódulos tumorales de tamaño variable. Generalmente, los tumores tienen un núcleo interno de espesor poco vascularizado rodeado de una zona exterior neovascular. Las opciones de tratamiento, tales como la citorreducción quirúrgica y la quimioterapia sistémica pueden controlar la progresión tumoral en algunos pacientes, pero la muerte del paciente se debe predominantemente a la recaída tumoral progresivo. Recientemente hemos informado de que la activación de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) y el objetivo mamífero de la rapamicina en la señalización MPEM se asocia con la supervivencia del paciente más corta [16]; estas vías están implicadas en la activación de células madre y la proliferación [17], [18]. la señalización de PI3K también es importante para el mantenimiento de la polaridad celular en células de cáncer [19].
Aunque las líneas celulares derivadas MPEM sobrevivir indefinidamente durante los pases, en este estudio, hemos utilizado células de paso temprano derivadas de tumores de pacientes a evitar la selección de un subconjunto particular de células iniciadoras de tumores agresivos conservados durante los pases prolongado. Aquí identificamos que una proporción importante de las células MPEM estables generados de forma prospectiva en la cultura generar células flotante con propiedades de las células madre embrionarias tales como la división celular asimétrica, auto-renovación y multipotencia. Los MPeMSCs individuales seleccionados al azar mostraron progresión clonal, la diversidad fenotípica en condiciones y con los potenciales de transdiferenciación. Por lo tanto, la considerable plasticidad de MPeMSCs puede contribuir a la formación de la población de células de desarrollo diversa que se encuentra en los tumores y agresividad de los tumores durante la progresión patológica. En conjunto, nuestro estudio revela que las CSC MPEM puerto y la progresión tumoral se debe a la auto-renovación y diferenciación de las células madre cancerosas.
Resultados
morfológicamente distintas poblaciones de MPeMSCs que dividen asimétricamente o simétrica y para expresar el vástago los marcadores de células
Entre las líneas celulares estables generadas MPEM, Meso-CL1 fue PTEN negativo
(neg) mientras que Meso-CL2 y CL3 Meso-eran las líneas celulares que expresan PTEN (Fig. S1). Aunque las tres líneas celulares MPEM generaron células madre con la auto-renovación que se desprenden y flotan en la cultura antes que el crecimiento adherente, Meso-CL1 tiene la propensión a generar los xenoinjertos tumorales después de la implantación subcutánea o intraperitoneal en ratones inmunodeficientes y se utilizó para generar un modelo MPEM CSC . En general, las CSC de mamíferos forman agregados de varias colonias esferoide en la cultura [20]; la formación de colonias era limitado cuando MPeMSCs se cultivaron bajo condiciones estándar de cultivo de células adherentes. Sin embargo, la formación esfera clonal se activa cuando las células se cultivaron en una placa de Matrigel. estudios de microscopía de luz han identificado dos poblaciones morfológicamente distintos de células madre cancerosas en cultivo MPEM; las células con o sin un recubrimiento de encapsulación exterior, tanto exhiben división asimétrica o simétrica. Para demostrar que las células aisladas mantienen propiedades de las células madre, que por primera vez los estudios de lapso de tiempo en las células vivas en cultivos y estudios de inmunofluorescencia en células de formaldehído-fijo y encontramos que las células divididas tanto de forma asimétrica y simétrica (fig. 1A, B). En una división asimétrica, generando células divididas desigualmente un gran células madre y una pequeña celda se denomina generalmente como la célula progenitora. experimentos de pulso-caza utilizando el análogo de la timidina BrdU han demostrado que durante la división celular asimétrica la plantilla de ADN marcado con BrdU, después de un largo pulso, separado exclusivamente dentro de la nueva de células madre, mientras que el ADN recién sintetizado condensa dentro de la célula de diferenciación. Además, también se encontró que durante la división celular simétrica ambas células hijas compartieron la plantilla de ADN (Fig. 1C). Otra población morfológicamente distintos de los CAC fue identificado en la cultura MPEM con una cubierta exterior de encapsulación que se forma a partir de las células de los padres protuberancias similares a burbujas oscuras. Las células recién formadas desprendidas de la célula parental y flotaban en la cultura y las células 'hatched'-hacia fuera de la cubierta externa para iniciar el crecimiento. Debido a la naturaleza flotante de estas células, los estudios de lapso de tiempo no tuvieron éxito; sin embargo, las evidencias de microscopía de luz y fluorescentes sugieren que las células también dividen asimétricamente o simétricamente (Fig. 2A). Como se encuentra en otras líneas celulares de cáncer, también hemos identificado grandes células adherentes multi-nucleadas en cultivo de células que generan una o más células madre normalmente se originan en el núcleo sin citocinesis completa de la célula parental (Fig. 2B).
(A) imágenes con lapso de tiempo de la división celular asimétrica y simétrica en MPeMSCs. la división celular asimétrica (flechas) genera dos células desiguales (panel superior); la división celular simétrica (flechas) genera dos células idénticas (panel inferior). tamaño de la célula se muestra en la M. Tiempo (horas: minutos) observó en la esquina inferior izquierda. Barras de escala: 20 m. (B) Las imágenes fluorescentes de asimétrica (panel superior) y simétrica (panel inferior) la división celular en MPeMSCs. Hoechst tinción nuclear muestra división asimétrica y simétrica de las células. DNA (C) es segregada de forma asimétrica durante la división celular (panel superior). Las células se cultivan en BrdU durante varios pasajes (el período de pulso) y después de un largo impulso de BrdU se retira del cultivo celular (la persecución); retención de BrdU en las células en división se estudió usando anticuerpo anti-BrdU. En una división celular asimétrica, la plantilla de ADN marcado con BrdU segregado dentro de la nueva célula madre hija mientras que el ADN recién sintetizado sin la etiqueta de BrdU condensado dentro de la célula de diferenciación. Durante la división celular simétrica BrdU marcado con ADN segregado al azar dentro de las células hijas (panel inferior).
(A) Formación de MPeMSCs con capsular que cubre y la posible división de células madre asimétrica y simétrica. a, b, células madre cancerosas se originan en las células parentales protuberancias similares a burbujas oscuras (flechas). Las células se desprenden y flotan en la cultura y MPeMSCs 'escotilla de salida' de la cápsula (flechas). c, la división celular asimétrica en las células madre capsulares. Asimétricamente dividiendo células se originan a partir de la cápsula (panel superior, flechas) o las células se dividen de forma desigual a lo largo de la cápsula con la generación de dos células no idénticos (panel inferior). d, la división celular simétrica de una célula madre capsular. Las barras de escala: 100 px. e, f, imágenes fluorescentes de asimétrica (e) y la división celular (f) simétrica de las células encapsuladas. Las flechas indican la cubierta capsular externa de la célula (B) a, MPeMSCs se originan en el núcleo de una célula multinucleadas; la célula recién formado se mueve a través del citoplasma y se libera de la célula parental. b, origen de múltiples células madre cancerosas a partir de una célula multinucleadas. c, imágenes fluorescentes de una célula multinucleadas.
A continuación se determinó si las MPeMSCs aislados fueron realmente derivan de las células mesoteliales malignos de los padres. Se evaluó la expresión de un marcador conocido mesotelioma, MSLN, y encontramos una sólida expresión del gen en ambos MPeMSCs y células MPEM parentales (Fig. 3A). Las propiedades de células madre de la MPeMSCs aisladas se determinaron aún más por la expresión de marcadores de células madre conocidos incluyendo NANOG, SOX2, Oct4, c-MYC y KLF4 (Fig. 3B). Curiosamente, el patrón de expresión de marcadores de células madre temprana fue similar tanto en las células parentales y MPeMSCs mientras que c-MYC expresión fue significativamente mayor en comparación con las células MPeMSCs parentales. Por el contrario, el marcador de células madre pluripotentes, CD133 y los marcadores de células madre endoteliales, CD31 y CD144, fueron indetectables en MPeMSCs (Fig. 3C).
(A) la expresión de ARNm relativa de mesotelina (MSLN) y (B) los genes marcadores de células madre en células parentales y MPEM en MPeMSCs. la expresión de c-MYC fue significativamente mayor (*
p
& lt; 0,05) en MPeMSCs mientras que otros marcadores de células madre mostraron patrón relativamente similar de expresión en ambos grupos. (C) La citometría de flujo evaluación de CD133 humano, CD31 y CD144 demostraron que las proteínas no se expresan en MPeMSCs. diagramas de barras se expresan como media ± SEM.
Múltiple de Inducción Lineage en MPeMSCs
multipotencia es el sello distintivo de las células madre. Sin embargo, no se ha demostrado de manera concluyente que las CSC pueden obtener múltiples destinos tras la inducción de linaje. Para demostrar la capacidad de MPeMSCs para lograr múltiples destinos, los CAC se cultivaron en las condiciones neuronales, vasculares y diferenciación adiposo. Cuando MPeMSCs adherentes sub-confluentes se trataron con ácido trans-retinoico, seguido por la adición de medio de diferenciación neural, las células diferenciadas en células similares a neuronas con morfología típica neuronal. estudios de imagen y qPCR fluorescentes de la expresión del ARNm mostraron que las células de linaje neuronal inducida expresaron NES marcador de células madre neurales y un TUBB3 marcador neuronal temprano; sin embargo, BEX1 no mostró diferencias significativas entre MPeMSCs y células diferenciadas neural (Fig. 4A). Se recogieron las células madre neurales flotantes derivadas de las células neuronales diferenciadas y se cultivaron durante varias generaciones para demostrar la auto-renovación y muchas de estas células muestran morfologías típicas neuronales.
Diferenciación
(A) de MPeMSCs en células similares a neuronas en el medio de diferenciación neural (flecha). La inmunofluorescencia y los estudios de expresión de ARNm relativos muestra que las células neuronales diferenciadas expresan el marcador de células madre nestina neural y principios de un marcador neuronal βIII-tubulina (*
p
& lt; 0,01). (B) la diferenciación endotelial de MPeMSCs en un formulario superficie de Matrigel redes tubulares (flechas). de imagen fluorescente muestra que las células expresan el marcador endotelial de células madre, VEGFR2, y la captación de Dil-AcLDL por las células endoteliales diferenciadas. estudios de expresión relativa del mRNA demuestra que durante la diferenciación endotelial VEGFR2 y VEGFR3 expresión disminuyó significativamente (*
p
& lt; 0,05), mientras que las expresiones de marcadores de células endoteliales, de vWF, VEGFa, VEGFC e IL-8 aumentó significativamente (*
p Hotel & lt; 0,001). (C) Un único MPeMSC formar una esfera colonia sobre una superficie de Matrigel seguido por extensa proliferación de MPeMSCs. Barras de escala 100 px. (D) MPeMSCs diferenciadas en adipocitos (aceite rojo) y (F) expresan marcadores adipocito PPAR y FABP4 (*
p Hotel & lt; 0,01) en las células adiposas diferenciadas en comparación con los controles. diagramas de barras se expresan como media ± SEM; ND, no detectable.
A continuación se evaluó la capacidad de los MPeMSCs para formar células endoteliales. MPeMSCs expresar VEGFR2, un marcador de células progenitoras endoteliales. Las células madre embrionarias positivas para VEGFR2 forman progenitores vasculares y se transforman en los vasos sanguíneos maduros [21]. Para el estudio de la diferenciación de MPeMSCs en linaje endotelial, las células fueron cultivadas en placas de cultivo recubiertas con componentes de la matriz del sótano-membrana (Matrigel). En Matrigel, las células inducidas diferenciación de las células endoteliales y las redes tubulares formadas. estudios de expresión génica en células de linaje endotelial inducida en comparación con MPeMSCs revelaron que la expresión de VEGFR2 y VEGFR3 se redujeron significativamente en las células durante la diferenciación endotelial, mientras que la expresión de vWF, VEGFA y VEGFC se upregulated en la diferenciación de las células. Del mismo modo, el factor pro-angiogénico, IL-8 mostró un aumento de 10 veces durante la diferenciación de las células endoteliales en comparación con MPeMSCs. A fin de validar la diferenciación endotelial, las células se incubaron con la lipoproteína de baja densidad, Dil-AcLDL, y encontraron la captación de lipoproteínas por las células endoteliales diferenciadas (Fig. 4B). En el Matrigel MPeMSCs también formar esferas de colonias seguido de la amplia proliferación de las células (Fig. 4C). Las células proliferantes generan múltiples esferas clonales en
in vitro de células Francia culture facilitando la rápida proliferación de las células progenitoras endoteliales.
Para determinar si los MPeMSCs se diferencian en adipocitos, las células fueron expuestas a ácido trans-retinoico seguido por medio de diferenciación adiposo y probado para la acumulación intracelular de lípidos neutros. depósitos de lípidos se identificaron en células diferenciadas de tejido adiposo. Control de las células diferenciadas y se analizaron adicionalmente para los marcadores adipocito conocidos utilizando qPCR y encontraron una significativa regulación de PPAR y FABP4 (Fig. 4D, F).
formación de tumores a partir de una sola célula MPeMSCs
Nuestra inicial estudios que utilizan MPEM células parentales han demostrado que las inyecciones de 3 × 10
6 células Meso-CL1 fueron capaces de generar tumores tanto subcutánea e intraperitoneal en ratones inmunodeprimidos mientras que Meso-CL2 y CL3 Meso-eran no tumorigénicos. En los ratones inyectados por vía subcutánea, las células Meso-CL1 generan constantemente tumor primera palpable en el día 30 después del trasplante de las células tumorales mientras que las inyecciones similares de MPeMSCs tomaron sólo 15 días para desarrollar el primer tumor palpable. Por el contrario, el trasplante de células de linaje neuronal inducida mostró la palpación del tumor el día 35 que demuestra que tanto las células parentales y células neuronales diferenciadas tenían potencial tumorigénico similar. Los estudios han demostrado que las inyecciones de células tumorales suspendidas en Matrigel tienen frecuencias más altas de la formación de tumores [22]. Nuestro
in vitro
estudios demostraron que Matrigel promovió la diferenciación endotelial y la activación de los factores angiogénicos en las células endoteliales diferenciadas. Por lo tanto, es posible que un pequeño número de MPeMSCs podría generar tumores dentro de un nicho endotelial. Para probar la importancia de la diferenciación de células endoteliales de MPeMSCs sobre el crecimiento del tumor, se realizó la limitación de experimentos de dilución. Quinientos células derivadas de una única MPeMSC no seleccionado inyectado con Matrigel generaron tumores palpables en ratones en el día 59 después del trasplante de las células tumorales mientras que los ratones recibieron un número igual de células suspendidas en PBS no crecer los tumores durante un periodo de tiempo de dos mes (Fig. 5A) lo que indica que la diferenciación endotelial de células madre cancerosas es fundamental para el crecimiento del tumor. Para probar
in vivo
transdiferenciación de las células endoteliales derivadas de MPeMSCs, se analizaron primeros tumores derivados de células de linaje dirigida endoteliales co-inyectados con Matrigel para la expresión de NES y TUBB3 y encontraron que las células expresan ambas proteínas neuronales ( la Fig. 5B).
(A) las células parentales de los que se inyectaron MPeMSCs derivados por vía subcutánea (n = 8) en el flanco derecho de ratones desnudos atímicos (nu /nu). En primer lugar tumor palpable apareció en día 30 después de la inyección de células tumorales. inyecciones similares de MPeMSCs (n = 8) generaron tumores palpables en el día 15 (se muestran los tumores en etapa terminal). En experimentos de dilución limitante, se dividieron las células derivadas de una única MPeMSC y se hicieron crecer bien en una placa de Matrigel para inducir la diferenciación endotelial o en una placa de cultivo celular regular con LIF contiene medio. Quinientos células disociadas del primer grupo se resuspendieron en Matrigel y se inyectan por vía subcutánea (n = 8). Los tumores se encontraron primero por palpación en día 59 (ratones con 60 días de crecimiento del tumor después de la palpación del tumor se muestran) mientras que las inyecciones similares de MPeMSCs (n = 10) se resuspendieron en PBS no generar tumores. (B) con hematoxilina y eosina (H & amp; E) tinción de inmunofluorescencia y de tejidos tumorales. Los primeros tumores generados a partir de células del linaje inducido endoteliales expresan marcadores neuronales; NES y TUBB3.
Discusión
El hallazgo importante de este estudio es la identificación de los CAC con la división de células madre asimétrica característica y tumorigenicidad en los tumores humanos MPEM. Hasta la fecha marcadores CSC han sido ampliamente utilizados para identificar y aislar células madre de tumores. Sin embargo, ningún marcador de células madre se ha demostrado ser un marcador universal de células madre cancerosas. cultivo definido de MPeMSCs derivados de tumores de pacientes promueve la auto-renovación, la formación de colonias y la diferenciación multilinaje confirmando un fenotipo de células madre. La característica distintiva de MPeMSCs más de otro CSC es que las células raramente forman esferas clonales en cultivo de células adherentes regular y por lo tanto el patrón de división de célula individual se pueden visualizar mediante microscopía, que ayuda a identificar y aislar células madre cancerosas. la división celular asimétrica es característica de las células madre embrionarias y nuestros estudios de lapso de tiempo mostró que MPeMSCs dividen asimétricamente y las células hijas heredan componentes citoplasmáticos distintas [23] para formar células madre y células que se diferencian. Esta observación fue apoyada además por pulso-caza procedimiento de marcaje BrdU y se encontró que el ADN plantilla retiene dentro de la célula madre hija. Por otra parte, encontramos la división celular simétrica en MPeMSCs generan células con aproximadamente el mismo tamaño. Aparte de estas divisiones de células madre característicos, MPeMSCs muestran un mecanismo diferente para la proliferación de células madre mediante la generación de células encapsuladas dentro de una cubierta exterior membranosa. Estas células flotan en general, en la cultura, y muestran tanto la división asimétrica y simétrica. La importancia de la formación de células madre capsular necesita de mayor investigación. Es posible que la formación de tales células encapsuladas es nicho homeostasis dependiente y que permite que las CSC a proliferar rápidamente y sobrevivir en condiciones de nicho adversos. Las características morfológicas únicas de estas células también se pueden utilizar para identificar células madre cancerosas
in vitro
. Los MPeMSCs derivados muestran una expresión significativa de MSLN, un marcador importante para el mesotelioma [24] que indica que los CAC se originó a partir de las células del mesotelioma parentales. Los marcadores de células madre probados tanto en las células parentales y MPeMSCs muestran similitudes en su expresión, excepto por el oncogen MYC, y esta consistencia en la expresión génica indica que las células parentales también tienen potencial para desdiferenciación [5]. La oncoproteína MYC que se activa en varios tipos de tumores [25] es upregulated significativamente en MPeMSCs; gen MYC es importante para la proliferación de células madre y para el mantenimiento de las propiedades de las células madre pluripotentes [26], [27].
Los recientes informes sobre las células madre similares derivadas de glioblastoma sugieren que los CAC se diferencian en células endoteliales durante la el crecimiento del tumor [28], [29]. Para confirmar aún más la presencia del fenotipo de células madre en MPEM, hemos probado multipotencia de MPeMSCs por su cultivo en múltiples condiciones de diferenciación. Las células fueron cultivadas en condiciones de diferenciación neuronal suero reducido al mínimo y se encontró que MPeMSCs diferenciarse en células con morfología neuronal típica y expresan marcadores neuronales. Se identificaron NES como un importante marcador de células madre neuronales en MPeMSCs y su expresión se encuentra también en los xenoinjertos de tumores que indican que la diferenciación neuronal de las células endoteliales es posible durante el crecimiento del tumor. Del mismo modo, la expresión de marcadores de células madre endoteliales VEGFR2 también fue notablemente alta en MPeMSCs; en una matriz de células de nicho diferenciarse en células endoteliales [9] con redes tubulares típicos sugiriendo MPeMSCs se programan intrínsecamente para la diferenciación endotelial. Esta contribución directa de MPeMSCs a la vasculatura del tumor puede ser importante para el crecimiento rápido y difusa tumor encontrado en pacientes MPEM. Las células madre neurales son ectodérmica en origen mientras que las células endoteliales se originan a partir del mesodermo. Sin embargo, las células similares a las endoteliales pueden derivarse de células madre neuronales [30]. En nuestros estudios (datos no publicados), cuando se sembraron las células neuronales diferenciadas en una placa Matrigel, las células diferenciadas en células endoteliales con redes tubulares típicos que indican la transdiferenciación de células de linaje-comprometido. Se ha informado de que las células endoteliales transdiferenciarse en células mesenquimales para inducir propiedades madre-como [31]. Estudios clínicos han mostrado que los beneficios de la terapia anti-angiogénica para el cáncer son limitados y en muchos casos las terapias anti-angiogénicas resultar en una respuesta inicial seguido de recaída del tumor [32]. En esta diferenciación vascular contexto de CSC que residen dentro de los tumores pueden tener un papel central en la reposición rápidamente las células endoteliales.
Ningún estudio hasta la fecha se ha ocupado de que un tipo de célula particular inicia el crecimiento del tumor en los pacientes. Nuestros estudios de xenotrasplantes iniciales usando el factor inhibidor (LIF) tratados MPeMSCs indiferenciadas leucemia mostraron una inducción de tumores en ratones principios que demuestren que son MPeMSCs tumorigénico. Aunque MPeMSCs no forman esferas de colonias en cultivo de células adherentes, cultivo celular individual en una placa de matriz generada esferas de colonias que muestran el fenotipo de células madre de las células derivadas. En este estudio, hemos generado un modelo de tumor CSC usando un número limitado de células proliferadas a partir de una sola MPeMSC. Los datos de este estudio, cuando se ve junto con
in vitro
evidencias apoyan un modelo en el que MPeMSCs se volvieron a suspender en Matrigel promueven el crecimiento de tumores agresivos, principalmente debido a la diferenciación endotelial de las células madre cancerosas debido a que todos los ratones inyectados desarrollaron tumores palpables unos 60 días de tumor la inyección de células. Por el contrario, la palpación del tumor no fue evidente en los ratones inyectados con MPeMSCs indiferenciadas se resuspendieron en PBS. Aunque las células con potencial tumorigénico se distribuyen por igual en dos grupos, los componentes de la matriz promueven la formación de colonias y la rápida inducción de linaje endotelial. En los tumores de células endoteliales dedifferentiate o transdifferentiate para formar células más tallo o similar a otros tipos de células distintas que pueden contribuir a un crecimiento tumoral temprano. Se ha demostrado que el microambiente que rodea a la neovasculatura de tumores es altamente proliferativa y células madre cancerosas se han encontrado en las proximidades de las células endoteliales [33]. Juntos, nuestros datos sugieren que la multipotencia y la plasticidad de MPeMSCs pueden ser un factor contribuyente para el crecimiento tumoral MPEM en los pacientes. Un examen más detallado de los factores asociados con la proliferación y diferenciación de linaje CSC puede proporcionar importantes conocimientos sobre el desarrollo de MPEM y puede proporcionar una base para el desarrollo de intervenciones terapéuticas más eficaces.
Materiales y Métodos
Cell líneas, cultivo celular y el aislamiento de MPeMSCs
MPEM líneas celulares (Meso-CL1, CL2 y Meso-meso-CL3) se derivaron de tumores MPEM humanos recogidos en la junta de revisión de los protocolos aprobados institución del Instituto Nacional del cáncer e informados se obtuvo el consentimiento de todos los pacientes para el uso de muestras de tumores, incluyendo la generación de líneas de células [15]. Las células fueron cultivadas en medio RPMI-1640 (RPMI; Gibco) suplementado con 10% v /v FBS (Atlanta Biologicals) en condiciones estándar de cultivo celular en un incubador humidificado con CO2 al 5% a 37 ° C. Las células fueron confirmados como mesotelioma mediante técnicas de inmunohistoquímica para marcadores de mesotelioma conocidas y mediante microscopía electrónica y se caracterizaron por
in vitro
características de crecimiento y en
in vivo
el crecimiento de xenoinjertos. Aunque las tres líneas celulares MPEM generaron células madre flotantes, Meso-CL1, el PTEN
(neg) línea celular con potencial para generar tumores tanto subcutánea e intraperitoneal en se utilizó (nu /nu) ratones desnudos atímicos para el estudio. Activamos generación de células madre en células MPEM sembrando ellos en la densidad de sub-confluente de minimizar anclaje de célula a célula en 5% v /v FBS-RPMI (medio de suero reducido-). En estas condiciones los MPeMSCs presentes en la población de células de los padres generan flotante células madre que luego se recogieron y cultivadas en presencia de LIF para su mantenimiento en un estado no diferenciado. Los MPeMSCs flotante recogido del LIF tratados de cultivo celular se usó para experimentos posteriores. Para todos los experimentos MPeMSCs se cultivaron en ausencia de LIF menos que se indique lo contrario.
Short-Time imágenes de células vivas e inmunofluorescencia
células madre Determinar que las células flotantes aisladas eran células madre cancerosas, lo primero que estudiamos división en células vivas mediante estudios de lapso de tiempo utilizando microscopía (Olympus IX71); imágenes fueron capturados utilizando el software cellSens. Por inmunofluorescencia, las células se fijaron con 4% de paraformaldehído durante 10 min a temperatura ambiente, y después se trataron con 0,2% Triton X-100 (Sigma) en PBS durante 10 min, excepto para la detección de proteínas de superficie celular. Se lavaron las células, con PBS y se bloquearon con 5% de BSA en PBS que contiene 0,25% de NP-40 durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células fueron incubadas con cualquiera de los siguientes anticuerpos primarios: Alexa Fluor conjugado monoclonal anti-α-tubulina (1:1000; Millipore), Alexa Fluor conjugado faloidina (1:1000; Invitrogen), Hoechst 33342 (1:5000; Sigma) , anti-nestina (anti-NES, 1:250; Millipore), anti-βIII-tubulina (anti-TUBB3; 1:1000; Covance), factor de crecimiento endotelial anti-vascular (anti-VEGFR) 2 (1:200 ; Cell Signaling), anti-CD133 /1-aloficocianina (APC, 1:100; Miltenyi Biotech). Se usaron los siguientes anticuerpos secundarios de Molecular Probes (Invitrogen): Alexa Fluor ratón conjugado o de conejo anti-IgG (1:1000). Los anticuerpos secundarios solos o IgG1 de ratón sirvió como control para la unión no específica. Las imágenes fueron capturadas utilizando Olympus CKX41 microscopio de fluorescencia equipado con cámara digital F-View II CCD o el uso de Olympus 1 × 81 microscopio con un escáner láser confocal Fluoview-1000.
BrdU etiquetado y Chase
a fin de determinar la división celular asimétrica en MPeMSCs, hemos tratado de probar la segregación de la plantilla de ADN durante la división celular mitótico usando 5-bromo-2-desoxiuridina (BrdU) pulso-caza [34]. Brevemente, MPeMSCs se trataron con 1 M de BrdU (Sigma) durante varios pasajes para asegurar que las hebras de ADN se marcaron con BrdU en la vasta mayoría de las células. Después de un largo impulso de BrdU se retiraron del cultivo de células y se examinaron para el patrón de marcación BrdU durante la división celular. Las células se fijaron en etanol al 70% y se incubaron en 2 N HCl que contiene 0,5% de Triton X-100 durante 1 h. y se bloquearon con BSA al 5% que contiene 0,25% de NP-40. Las células se lavaron y se incubaron con anticuerpo anti-BrdU-FITC (BD Biosciences) durante la noche a 4 ° C, se lavaron y contratinción con DAPI. patrón de marcaje con BrdU en las células fueron vistos usando Olympus 1 × 81 microscopio con un escáner láser confocal Fluoview-1000.
Preparación de ARN, en tiempo real PCR cuantitativa y Western Blot
El ARN total fue extraído a partir células utilizando Trizol (Invitrogen) y pre-tratado con DNasa. Un total de ARN 1 g se transcribe de forma inversa en ADNc con la transcriptasa inversa III (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante.