Extracto
Antecedentes
El cáncer de próstata es la segunda causa principal de muerte por cáncer entre los hombres. múltiples evidencias sugiere que una población de tumor de iniciación, o las células madre del cáncer (CSC) es responsable del desarrollo del cáncer y la resistencia a los medicamentos excepcional, lo que representa una diana terapéutica muy importante. El presente estudio evaluó las alteraciones específicas de CSC-inducida por la nueva generación de los taxoides SBT-1214 y una novela curcuminoid polyenolic zinc vinculante, CMC2.24, en células madre cancerosas de la próstata.
Principales conclusiones
El CD133
alta /CD44
alta fenotipo fue aislado de las células derivadas de pacientes pPT2 inmortalizadas espontáneamente y células PC3MM2 altamente metastásicas. tratamiento semanal de los ratones NOD /SCID con PPT2- y tumores inducidos por PC3MM3 con el SBT-1214 condujo a la supresión dramática del crecimiento del tumor. Cuatro de las seis pPT2 y 3 de 6 tumores PC3MM2 han demostrado la ausencia de células viables en los tumores residuales.
En
in vitro
, SBT-1214 (100 nM-1μM; durante 72 horas) inducida alrededor del 60% de muerte celular en CD133
alta /CD44
+ /células cultivadas en altas colágeno I en medio de células madre (por el contrario, las mismas dosis de paclitaxel aumento de la proliferación de estas células). se aumentaron los efectos citotóxicos cuando SBT-1214 se combinó con la CMC2.24. Un ensayo de matriz de PCR específico de células madre reveló que esta combinación de fármacos mediado inhibición masiva de múltiples genes relacionados con las células madre constitutivamente hasta reguladas, incluyendo los principales factores de transcripción pluripotencia. Es importante destacar que esta combinación de drogas inducida por la expresión de p21 y p53, que estaban ausentes en CD133
/CD44
pilas de gran altura. Las células viables que sobrevivieron a este régimen de tratamiento ya no eran capaces de inducir esferoides secundarias, presentaron alteraciones morfológicas significativas y murieron en 2-5 días.
Conclusiones
Se presenta aquí que el SBT-1214 solo , o en combinación con CMC2.24, posee actividad significativa contra de próstata CD133
alta /CD44
células iniciadoras de tumores de alto + /. Esta combinación de fármacos inhibe eficazmente la expresión de la mayoría de los genes relacionados con las células madre y factores de transcripción pluripotencia. Además, induce una expresión que no tenía anteriormente de p21 y p53 ( "gen de atención"), lo que potencialmente puede revertir la resistencia a fármacos mediante el aumento de la sensibilidad a los fármacos contra el cáncer
Visto:. Botchkina GI, Zuniga ES , Rowehl RH, Parque R, R Bhalla, Bialkowska AB, et al. (2013) Cáncer de próstata Stem Cell-eficacia selectiva de un taxoide de nueva generación, SBT-1214 y la novela curcuminoid, CMC2.24 Polyenolic zinc vinculante. PLoS ONE 8 (9): e69884. doi: 10.1371 /journal.pone.0069884
Editor: G. Dean Tang, la Universidad de Texas M.D Anderson Cancer Center, Estados Unidos de América
Recibido: 1 de mayo de 2013; Aceptado el 13 de junio de 2013; Publicado: 24 Septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Zúñiga et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el NIH R21 CA150085, NYSTAR subvención 1.072.170, y en parte, por el Instituto de Biología química & amp Universidad Stony Brook; Drug Discovery (ICB & amp; DD); Stony Brook University Cancer Center de Nueva York; Chemmaster Internacional, Nueva York y SBU VP de Investigación. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. El papel de Chemmaster International, Inc., como el inventor de CMC2.24 era sintetizar y proporcionar, en especie, el material para el estudio actual. Esta empresa es una entidad semi-académica (presidente, Francis Johnson, PhD, es profesor del Departamento de Química y Departamento de Ciencias Farmacológicas al SBU) que se especializa en la síntesis de varios pasos para grupos académicos e industriales. Esta empresa no proporcionó ningún apoyo en relación con el empleo, consultoría, patentes o productos en desarrollo o comercializados queridos. Los autores confirman que la provisión de la investigación actual con CMC2.24 no altera su adhesión a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales. Los autores no tienen ningún interés potenciales consecuencias financieras o no financieras, profesionales o personales que compiten.
Introducción
El cáncer de próstata (PRC) es la segunda causa principal de muerte por cáncer entre los hombres en el oeste la sociedad [1]. Es inicialmente sensible a la terapia de privación de andrógenos, pero más de 70% de los pacientes se enfrentará a la recurrencia post-tratamiento y la transición de la enfermedad a un estado incurable [2]. Para los pacientes con diagnóstico de PRC independiente de los andrógenos, estabilizadores de microtúbulos tales como paclitaxel (Taxol); Ptx son una estrategia de tratamiento de primera línea que es inicialmente eficaz. Sin embargo, enfoques para el tratamiento quimioresistente República Popular China se carece actualmente [3]. Tras el descubrimiento inicial de las células madre de cáncer, células madre cancerosas [4], se hizo cada vez más evidente que los tumores están organizados jerárquicamente, que contiene una población relativamente menor (pero variable) de las células iniciadoras del tumor y una mayoría heterogénea de células tumorales a granel en diferentes etapas de maduración. En apoyo del concepto de CSC de la carcinogénesis, un estudio reciente demostró que la expresión de varios marcadores utilizados comúnmente CSC, es decir CD44, CD166 y ALDH-1, así como la proporción de células que expresan estos marcadores, aumenta con el envejecimiento [5] . Es un fenómeno establecido que el envejecimiento se correlaciona con un fuerte aumento de la incidencia de cáncer de próstata y muchos otros tipos de cáncer [1]. El conocimiento acumulado indica claramente que los CAC son responsables del desarrollo del tumor, el mantenimiento y la resistencia a las modalidades de tratamiento estándar. Por lo tanto, se ha demostrado para muchos tipos de cáncer que las células tumorigénicas que expresan marcadores CSC comunes, en particular CD133 y CD44, son excepcionalmente resistentes a fármacos contra el cáncer convencionales (tales como 5-FU, oxaliplatino, irinotecán, docetaxel y otros). Además, el número de tales células puede ser propagado de manera significativa después de la terapia [6-13], que se manifiesta generalmente como más enfermedad recurrente más agresiva resistente a los medicamentos y y metastásico. Por lo tanto, es concebible que los CAC representan el objetivo más crucial en el desarrollo de una nueva generación de fármacos contra el cáncer
.
Evaluación preclínica de los agentes anti-cáncer de candidatos se basa tradicionalmente en la utilización de cultivos en monocapa de del total, las células cancerosas no seleccionados. Sin embargo, este modelo in vitro hace caso omiso de las células iniciadoras de tumores raros aún funcionalmente importantes, altamente resistentes a la droga, y por lo tanto tiene poca relevancia a la complejidad y la fisiopatología de
Tarjetas telefónicas tejidos tumorales in vivo. Además, recientemente se ha demostrado que las líneas celulares de cáncer establecidas más comúnmente utilizados no tienen correlación con muestras clínicas originales, que pueden conducir a misevaluation crítico de la eficacia del fármaco [14]. Esto puede explicar en parte la alta tasa de deserción de agentes anticancerígenos candidatos. Por lo tanto, sólo el 5% de los agentes que tienen actividad contra el cáncer en fase de desarrollo preclínico tienen licencia [15]. Por tanto, la identificación y caracterización de células madre cancerosas derivadas del paciente, el desarrollo de una óptima
in vivo
y
in vitro
modelos preclínicos y análisis específicos-CSC de las alteraciones inducidas por las drogas representan pasos críticos en la evaluación de nuevos fármacos contra el cáncer. Sin embargo, es muy difícil de establecer líneas celulares primarios de los carcinomas de próstata, y este campo sigue siendo uno de los temas más controvertidos en la investigación del cáncer [16]. En primer lugar, Prc es un tumor maligno con un alto grado de heterogeneidad celular y molecular, por lo tanto, hay dificultades objetivas en el aislamiento de poblaciones de células puras de tejidos de la próstata. A nivel molecular, actualmente no existen marcadores definitivos para demostrar la naturaleza maligna o no maligno de células de la próstata, y para distinguir entre las células madre normales y cancerosas. La creciente evidencia también sugiere que los CAC podrían representar una subpoblación heterogénea de las células iniciadoras del tumor [17-23]. Sin embargo, una combinación de varios marcadores de superficie celular para células inicial sorting seguida de caracterización funcional completa de los fenotipos celulares aisladas pueden conducir a la identificación de los más funcionalmente significativa (es decir, a tumores y la metástasis iniciadoras, o el más resistente a los medicamentos) de células poblaciones.
En nuestros estudios anteriores, hemos encontrado que una nueva generación de los taxoides, SBT-1214, induce una supresión efectiva a largo plazo de xenoinjertos de tumores de colon [24] y dramáticamente regula a la baja la expresión de tallo múltiple genes de células relevantes [25]. La búsqueda de agentes de seguridad que potencialmente pueden disminuir la toxicidad sistémica y mejorar aún más las actividades dirigidas-CSC del SBT-1214, que fueron motivados por numerosas características anti-cáncer de la curcumina fitoquímico naturales (diferuloylmethane). En un gran número de estudios, la curcumina se ha informado para amplificar los efectos citotóxicos inducidos por diversos fármacos quimioterapéuticos y, más importante, para inhibir la capacidad clonogénico e inducir efectos pro-apoptóticos en las células resistentes a los medicamentos que expresan marcadores de células madre [26]. En particular, la curcumina disminuye significativamente el potencial de proliferación y aumenta la apoptosis de líneas celulares de cáncer de próstata tanto andrógeno-dependientes e independientes de andrógenos [27,28]. Sin embargo, la curcumina tiene una baja bioactividad y biodisponibilidad, lo que estimuló nos ha permitido desarrollar unos 30 análogos estructurales de la curcumina (agentes de unión de cinc-polyenolic; PEZBINs), incluyendo el compuesto líder actual, CMC2.24, que tiene mayor actividad biológica, mejor solubilidad y no hay evidencia de la toxicidad, incluso a dosis altas [29]. El objetivo de este estudio fue probar la eficacia del SBT-1214 como agente único, y su combinación con esta novela curcuminoid contra las células iniciadoras de tumores de próstata primarios y metastásicos.
Resultados
establecimiento y caracterización de la línea celular de cáncer de próstata primario inmortalizada espontáneamente, pPT2
las células disociadas de biopsias con aguja de 22 carcinomas de próstata resecados de diversos grados histológicos fueron probados para clonogénico y tumorigénicos potencial de
in vivo y
in vitro
como se describe en la sección Métodos. Veinte muestras contenían una subpoblación de las células de rápido adherente (FA) al colágeno de tipo I, que inicialmente proliferaron en el medio de células madre libre de suero. Catorce de los 22 especímenes inducida flotando agregados multicelulares, y sólo tres especímenes fueron capaces de inducir la densa 3D esferoides característicos de células madre cancerosas. Sin embargo, la mayoría de las células primarias perdieron sus capacidades clonogénico y de formación de esferas después de varios pasajes, el cual está en línea con numerosas observaciones que las células de cáncer de próstata primario tienen una vida útil finita (5-6 pasajes) [16]. En contraste, las células tumorales aisladas del paciente con estadio pT2c pNX PMX República Popular China fueron inmortalizadas espontáneamente y continuaron a largo plazo
in vitro
y
in vivo
crecimiento (28 pasajes, en la actualidad). Con rondas de serie de los trasplantes y los pases en un medio de células madre, tres poblaciones diferentes de células se hicieron evidentes: la población mayor de células alargadas, numerosos holoclones redondas que contienen células pequeñas y muy grandes células raras, multinucleares (que a menudo se observan en varias establecido y de próstata primario y líneas celulares de cáncer de colon). Subclonación de estos pequeños que contiene de células-holoclones condujo a un enriquecimiento espectacular de células que expresan altos niveles de CD133, CD44, CD44v6, EpCAM, CD49f y CD166 (Figura 1A). Esta línea celular (llamada pPT2) se propagó en serie como xenoinjertos /ratones NOD SCID tumorales, esferoides 3D y culturas de colágeno tipo I adherente flotante. De acuerdo con el informe de la ATCC (número ID 002872), las células son células humanas pPT2 únicas con ninguna coincidencia para cualquier perfil en la base de datos ATCC STR, lo que significa que no están contaminados con las líneas celulares establecidas conocidas. Aunque el fenotipo de los cultivos enriquecidos-CSC es dinámico debido a la naturaleza dual de las células madre cancerosas (es decir, la capacidad de auto-renovación y generar progenitores comprometidos), las células conservan pPT2 fenotipos relativamente estables incluso hasta 8 semanas después de la última MACS- CD133
+ clasificación de células y cultivando en superficies recubiertas con colágeno de tipo I en medio de crecimiento de células madre mesenquimales libre de suero, MSCGM (Lonza; Tabla 1; Figura 1). Por lo tanto, prácticamente toda la población de células pPT2 era indiferenciado (sólo 3-5% expresó marcador de células diferenciadas, pan-queratina), positivas para EpCAM, CD49f, isoforma estándar de la CD44 (98-99%; clon MEM-85; Invitrogen), y hasta 72% isoforma variante expresa, CD44v6 (clon 2F10; R & amp; D). Después °° 27 pasajes, alrededor del 90% de las células pPT2 todavía expresan niveles moderados a altos de CD133 y poseen una capacidad muy alta de formación de esferas en cultivo 3D que contiene de 1: 4 Tipo de colágeno I /Stemline pluripotentes medio de cultivo (SPCM; Sigma-Aldrich ). Doce-dieciséis por ciento de las células fueron positivas para pPT2 receptor de andrógenos (AR
+), y 8 a 10% fueron positivas para CXCR4 (Figura 1A). En contraste con el tejido del tumor original, purificada CD133
+ células no expresó PSA, que apareció de nuevo en los tumores de los ratones NOD /SCID después del trasplante de la CD133
+ células (Figura 1B). La gran mayoría de la CD133
+ pPT2 células expresaron altos niveles citoplasmáticos de vimentina y nestin, característica de neural y células madre embrionarias. La expresión de estos dos marcadores fue mayor en células multinucleadas gigantes (MNCs; Figura 1C). Ambas fracciones nucleares y citoplasmáticas de las células pPT2 expresan c-Myc, mientras que otros marcadores de pluripotencia (4 Oct-y Sox-2) sólo se detectaron en la fracción nuclear (Figura 1D). Es importante destacar que, las células pPT2 fueron negativos para proteínas supresoras de pro-apoptótica /tumorales, p53 y p21, y extremadamente resistente a los fármacos estándar contra el cáncer. Por tiempo presente, después de aproximadamente 2,5 años de mantenimiento, la gran mayoría de las células pPT2 se mantiene en un estado inmaduro, continúa expresando altos ratios y altos niveles de marcadores stemness y pluripotencia de uso común mencionados anteriormente y retiene muy alta iniciar tumor, clonogénico y de formación de esferas capacidades durante trasplantes de serie de los números de células relativamente bajas. Todo lo anterior motivado nuestro equipo para poner a prueba los dos fármacos patentados, SBT-1214 y CMC2.24 contra esta altamente resistente a drogas, línea celular de cáncer de próstata primario y para la comparación CSC-enriquecido, contra establecido un derivado altamente metastásico de la PC-3 línea celular, las células PC3MM2, que se caracteriza en nuestro estudio anterior [30].
(a) análisis de FACS Representante de la diferente expresión de marcadores de superficie celular en las células cultivadas sin clasificar pPT2 durante 4 semanas en colágeno de tipo I en MSGB medio. Cada cuadrado de puntos representa la población de células que expresan altos niveles moderados /de un marcador particular conjugado con diferentes etiquetas fluorescentes. Tenga en cuenta una retención a largo plazo de la CD133-APC, estándar (CD44-PE) y variable (CD44v6-FITC) y CD44-APC CD49f. En contraste, sólo pequeñas fracciones de las células pPT2 expresan un marcador de células basales, p63, un marcador de células diferenciadas, pan-queratina, CK18, AR y CXCR4. (B) El análisis inmunohistoquímico muestra que, en contraste con el tejido tumoral parental, purificada CD133
+ pPT2 células no expresan PSA
en
in vitro
; sin embargo, NOD inducida por pPT2 /xenoinjertos de tumores SCID son débilmente PSA-positivo. (C) Inmuno análisis muestra la expresión uniforme de vimentina y nestina, con niveles especialmente altos de estos marcadores de células madre neurales en las grandes empresas multinacionales. (D) Análisis de transferencia Western muestra la expresión de los marcadores de pluripotencia en fracciones nucleares y citoplasmáticas de la CD133
+ células pPT2. Tanto las fracciones nucleares y citoplasmáticas expresan c-Myc y fueron negativos para p53 y p21; Sólo la fracción nuclear expresó Oct-4 y Sox-2.
células pPT2 ** *** células PC3MM2
marcador
Fuente
Expr. nivel
% de las células
Expr. nivel
% de las células
CD133Miltenyi Bio +++ 75 ± 15 ++ /+++ 3 ± 1CD44Invitrogen MEM-85 +++ 99,5 ± 0,5 ++ /+++ 7.5 ± 2.5CD44v6R & amp;. Clon D 2F10 +++ 56 ± 16CD49fBioLegends +++ +++ 99,5 ± 0,5 94 ± 2CD166BD BIOSCI. +++ 99,3 ± 0,5 ++ /+++ 86 ± 8EpCAMMiltenyi Bio. +++ 98 ± 0,5 ++ /+++ 83 ± 5Pan-KeratCell señal. 4 ++ ± 1CK5Santa Cruz + 7 + 3 ± 1 ± 1CK18Santa Cruz + 5,5 ± 2,5 + 3,5 ± 0.5CK5 /CK18Santa Cruz + 4,5 ± 0,5 + 2,5 ± 0.5p63Santa Cruz + 5 + 7 ± 2,5 ± 1ARSanta Cruz + 14 ± 2 ++ /+++ 5 ± 2CXCR4R & amp;. D ++ +++ 10,5 ± 1 12 ± 2Table 1. perfiles fenotípica de las células y pPT2 PC3MM2 con análisis FACS * * porcentaje medio
en particular de células que expresan el marcador de superficie celular se calculó sobre la base de los tres FACS análisis independientes. ** células pPT2 (sin ordenar antes del análisis, pero establecidos por las repetidas anteriores MACS-CD133
+ clasificación de células) se cultivaron en placas recubiertas con colágeno tipo I en medio MSCB para 2, 4 y 8 semanas. *** células no clasificadas PC3MM2 se cultivaron en placas recubiertas con colágeno tipo I en medio MSCB durante 1-2 semanas. + ++ y +++ representa baja, moderada y alta expresión. Descargar CSV CSV
Los efectos citotóxicos de SBT-1214 contra las células de cáncer de próstata enriquecidos-CSC
in vitro
El tratamiento con SBT-1214 y, por comparación, con el agente de estabilización de los microtúbulos de uso general paclitaxel (Ptx; Taxol) aumentó las proporciones de células con alta expresión de CD133 de una manera dependiente de la concentración (de 10 nM a 10μM; durante 24 horas) en ambas líneas celulares pPT2 y PC3MM2 (FACS representativos se muestran en la Figura 2A, B) . Estos datos sugieren que ambos fármacos células con baja expresión de CD133 afectadas preferentemente, e inicialmente no afectó o incluso estimular la proliferación de las CD133
pilas de gran. Sin embargo, un tratamiento más prolongado (durante 48-72 horas) reveló una profunda diferencia entre los efectos citotóxicos de SBT-1214 y Ptx: mientras que las células tratadas con Ptx conservan la viabilidad y el número de células viables todavía se incrementó, hasta el 60% de la SBT-1214-CD133 tratada
+ células murieron con las mismas concentraciones de la droga (los datos del ensayo de MTT se muestran en la Figura 2C, D, Figura 3A). Sorprendentemente, las concentraciones más bajas de SBT-1214 (100 nM-con 1 m) indujeron mayor citotoxicidad en células pPT2 en comparación con la concentración de fármaco 10μM. Paclitaxel a 10 mM fue citotóxica inducida y sobre 40% de muerte celular (Figura 2C, D). En este punto de tiempo, un aumento de la relación de muy grandes MNCs (a menudo ≥200 M) era evidente tanto en las células pPT2 y PC3MM2 (Figura 3A, B). Para probar si o no el tratamiento con SBT-1214 afecta el potencial clonogénico de la CD133
+ células, pPT2 y esferoides flotantes PC3MM2 fueron tratados con 1μM del fármaco durante 24 horas con el fin de inducir alteraciones, pero evitar la muerte celular profunda. Hemos encontrado que, en contraste con el control de esferoides sin tratar, las células tratadas SBT-1214 perdieron su capacidad de inducir tanto esferoides secundarias 3D (Figura 3C) o colonias de colágeno-adherente (no mostrado). Tanto las células de tratamiento de supervivientes y pPT2 PC3MM2 ejercieron la muerte celular profunda a los 2-5 días después del tratamiento con SBT-1214 (Figura 3D).
análisis FACS representativos muestra un aumento dependiente de la dosis en las proporciones de CD133
pPT2 alta (A) y PC3MM2 (B) las células 24 horas después del tratamiento con SBT-1214 y Ptx. tratamiento más largos (durante 72 horas) con SBT-1214 (10 nM-10 mM) inducidas a la muerte celular 65% en las células pPT2 (C) y hasta 60% en las células PC3MM2 (D; línea inferior). En contraste, el tratamiento con las mismas dosis de Ptx no suprimió la proliferación de las células de cáncer de próstata tumorigénicos (C, D; línea superior). Las células se incubaron con las concentraciones de fármaco indicadas, y se obtuvieron datos con el ensayo MMT estándar basado en tres experimentos independientes con cuatro repeticiones en cada grupo de tratamiento. Los valores son las medias ± SD.
(A, B) microfotografías de contraste de fase muestran que un solo tratamiento con 1 mM SBT-1214 para la muerte inducida de 48 horas de las células y pPT2 PC3MM2 con el enriquecimiento de la grandes células multinucleadas (flechas). (C) la pérdida post-tratamiento de la capacidad de formación de esferas de células sobrevivientes en comparación con los no tratados. Los valores son las medias ± SD basado en 3 repeticiones independientes. (D) la muerte de las células pPT2 profunda y PC3MM2 tratados durante los próximos días en cultivo.
En vivo
eficacia de SBT-1214 contra xenoinjertos de tumores de próstata inducida por CD133
+ poblaciones de células
Después del trasplante de la CD133
+ pPT2 y PC3MM2 células, los ratones NOD /SCID se dividieron al azar en 3 grupos para cada tipo de células: una como un control no tratado (n = 4), un segundo grupo para el tratamiento SBT-1214 con 40, 40, 40 mg /régimen kg semanal (n = 4), y un tercer grupo de tratamiento con 40, 20, 20, 20 mg /régimen semanal kg (n = 6). El tratamiento se inició 2-3 semanas después del trasplante de las células tumorales, cuando xenoinjertos de tumor llegó a 100 mm
3; el desarrollo tumoral se controló semanalmente. Aunque los cuatro tumores tratados con 40, 40, 40 mg /kg régimen semanal había reducido drásticamente por el tercer tratamiento, todos los ratones expresaron signos comunes de toxicidad sistémica y se sacrificaron (datos no se muestran). El tratamiento con 40, 20, 20, 20 mg /kg régimen semanal inducida por la regresión del tumor más significativo (Figura 4A-D), con toxicidad sistémica muy inferior. Una semana después del último tratamiento, todos los tumores residuales se recogieron y analizaron histológicamente y por
ex vivo
capacidad clonogénico. tumores de control no tratados se retiraron al llegar a ~ 2 cm de diámetro más grande de acuerdo con los requisitos del IRB.
NOD /ratones SCID se implantaron ectópica con 3.000 de CD133
+ células pPT2 y PC3MM2 en los flancos. Tres semanas después de la inyección, los ratones fueron tratados con la administración i.v. semanal inyecciones de SBT-1214 (x4: 40, 20, 20, 20 mg /kg). Esta modalidad de tratamiento indujo reducción dramática en el tamaño del tumor en la mayoría de la PPT2- y tumores inducidos por PC3MM2 (A-D). Casos representativos se muestran en B y D. Los valores son las medias ± SD;
p
≤0.0009 para los tumores inducidos por pPT2 (SBT-tratados frente a los controles no tratados; n = 6), y
p
≤0.0018 para los tumores inducidos por PC3MM2 (n = 6). El análisis histopatológico de los tumores residuales mostró la presencia de células viables y la acumulación de grandes células multinucleadas en 2 de 6 pPT2 tumores y 3 de 6 PC3MM2 tumores (representante H & amp; E tinción de tejidos tumorales pPT2-tratados SBT-1214 sin tratar y se muestra en E, F).
Ex
la muerte vivo Red de las células tratadas con el fármaco en cultivo (G). las células tumorales no tratadas de control retenidos profundas capacidades clonogénico y de formación de esferas durante la pasada en serie (H).
El análisis histopatológico.
La hematoxilina y eosina secciones de tejido teñido de control sin tratamiento en el paciente CD133 derivan
+ NOD /SCID xenoinjertos de tumores inducidos por células mostraron células epiteliales altamente atípicos que forman nidos y estructuras glandulares, en consonancia con adenocarcinoma pobremente diferenciado (Figura 4E). Numerosas figuras de mitosis atípicas y necrosis central eran generalmente presentes. Las dos más grandes tumores residuales tratados con SBT-1214 inducidas por pPT2 también eran de diagnóstico de adenocarcinoma pobremente diferenciado, pero poseían un mayor grado de atipia nuclear, y sólo pocas figuras mitóticas. Además, el tumor tratado-SB-1214 mostró hialinización focal pero no hay evidencia de necrosis. tumores residuales menores (n = 4) mostraron un mayor nivel de hialinización y la falta de células viables.
alteraciones post-tratamiento en las capacidades clonogénico y de formación de esferas.
suspensiones de células totales de la control y tumores residuales tratados con SBT-1214 se sembraron en placas recubiertas con colágeno de tipo I y las placas ULA a ensayo para la presencia de células madre cancerosas y su capacidad para inducir esferoides secundarias o colonias de células adherentes. Cuatro de las seis pPT2 inducida y tres de seis PC3MM2 inducida por SBT-1214 tumores residuales tratadas fueron compuestas de bronceado o masas de color rojo oscuro que no mostraron la presencia de células viables, y no genera ni colonias adherentes o flotantes en cultivo. Dos de los tumores residuales trató posteriormente inducidos por pPT2 y tres de los tumores inducidos por PC3MM2 contenían células que proliferan lentamente viables. Los dos pPT2 tumores residuales también mostraron racimos de células gigantes multinucleadas de tratamiento de supervivientes (la aguja en la Figura 4F) similares a los comúnmente observados después del tratamiento de las poblaciones enriquecidas-CSC con agentes quimioterapéuticos
in vitro gratis (Figura 3B) . Sin embargo, estas células no indujo ningún esferoides compactos en condiciones de cultivo no adherentes, que sólo producen agregados multicelulares sueltos, que se sometieron a la muerte celular profundo en varios días de
ex vivo
cultivo (Figura 4G). En contraste, las células disociadas de xenoinjertos de tumores no tratados se sometieron a pases en serie
in vivo
y en
in vitro gratis (Figura 4H muestra de tipo I colágeno holoclone-adherente y esferoides flotantes inducidos durante el paso seriado de la pPT2 sin tratar ratones portadores de tumores de xenoinjertos de células).
Combinación de SBT-1214 con CMC2.24 aumenta su citotóxicos dirigidos-CSC y actividades moduladoras de células madre
Para estudiar las posibles interacciones entre SBT-1214 y Ptx con un curcuminoide sintético novela, CMC2.24, se evaluó la eficacia de varias concentraciones de fármacos y su combinación con CMC2.24 en las fracciones iniciadoras de tumores de las líneas celulares y pPT2 PC3MM2. La viabilidad celular se determinó por el ensayo de MTT y el análisis FACS. Hemos encontrado que la CMC2.24 (así como curcumina; no se muestra) a menudo ejercen efectos bifásicos sobre próstata CD133
+ células. Por lo tanto, el tratamiento con bajas concentraciones de CMC (hasta 10μM) para 72 horas estimuló la proliferación celular, mientras que las dosis más altas (10-40μM) eran cada vez más citotóxica (Figura 5A, B). análisis FACS reveló que, en contraste con SBT-1214 y Ptx, CMC2.24 no indujo un aumento en las proporciones de células con alta expresión de CD133 (Figura 5C; negro área punteada), pero dio lugar a un cambio significativo de toda la célula la población hacia la diferenciación (C; zona con asterisco rojo) y un cierto aumento en las células con alta expresión de pan-queratina (C; rojo área punteada). Estos datos indican que las concentraciones bajas de CMC2.24 aumentar la proliferación de los progenitores no madre en lugar de células madre cancerosas. Es importante destacar que la combinación de 30 micras CMC2.24 (que no es tóxico incluso dosis mucho más altas [29]) con bajas concentraciones de SBT-1214 o Ptx (10 nM-con 1 m) ejercido más profunda muerte del CD133
+ células que cada compuesto como agente único (Figura 5D, E). Después de la acumulación de post-tratamiento temporal de las grandes células multinucleadas, perdieron la capacidad de inducir esferoides 3D flotante y se sometieron a la muerte celular profunda de manera similar a las células tratadas con SBT-1214 que se muestran en la Figura 3.
(A, B ) El CMC2.24 como agente único provoca efectos bifásicos sobre la proliferación de células de cáncer de próstata: concentraciones más bajas de lo promovió la proliferación, mientras que las más altas fueron citotóxicos. (C) En contraste con SBT-1214, el tratamiento con CMC2.24 no indujo un aumento en la proporción de CD133
+ células (áreas de puntos negros), pero de manera similar a SBT-1214, el aumento de expresión de la sartén marcador de diferenciación -keratin (áreas rojas punteadas) y se desplaza a toda la población de células hacia la diferenciación (áreas con asteriscos). Una combinación de los dos agentes indujo la muerte celular más significativo de las células PC3MM2 (E) CD133
+ pPT2 (D) y en comparación con cada compuesto como agente único. Los datos se obtuvieron con el ensayo estándar de MMT (A, B, D, E). Los valores son la media ± SD de los tres experimentos independientes con 4 repeticiones para cada concentración de fármaco.
alteraciones inducidas por el SBT-1214 en el perfil de expresión de genes relacionados con stemness-
En nuestro estudios previos, utilizando en todo el genoma y de la vía específica perfiles de expresión génica, se han encontrado que las poblaciones de células tumorigénicas aisladas de las líneas celulares de cáncer de próstata y de colon establecidos expresaban niveles upregulated de los genes anti-apoptóticos, los transportadores ABC y la mayoría de vástago genes relacionados con las células [25,30,31]. Nuestro estudio de la proteómica lleva a cabo en colaboración con Recursos de Proteómica de Harvard en el CSC enriquecida frente a las células diferenciadas PC3MM2 reveladas 198 proteínas expresadas diferencialmente de los 600 analizados los (datos no publicados). Entre ellos se encontraban muchas proteínas implicadas en la función de células madre, la motilidad celular, invasión, metástasis y mal pronóstico, incluyendo vimentina, nestina, S100, proteínas de choque térmico y HS90A HS90B, moesina, la galectina y muchos otros. Para determinar posibles alteraciones inducidas por drogas en la expresión génica stemness, analizamos CD133
+ pPT2 células antes y después del tratamiento con el SBT-1214 /CMC 2.24 combinación. Usando el ensayo de matriz de PCR (PAHS 501; SA
Biosciences
) con criterios de filtrado de un cambio de 1,5 o mayor- veces en la expresión, se han encontrado que alrededor del 50% de los factores de transcripción relacionados con las células madre de 84 analizadas ( TFS) se upregulated en CD133
+ frente a las células diferenciadas República Popular China (Figura 6A). Entre ellos estaban CDX2, DLX2, DNMT3B, EGR, FOXP3, GLI2, familia HOX TFS, Irx4, Jun, KLF2, NFATc1, NR2F2, PCNA, Pitx3, POU4F1, SIX2, Sox2, SOX9, ter, WT1 y otros. Un solo tratamiento con SB-1214 (con 1 m) y CMC2.24 (10μM) durante 24 horas indujo significativa baja regulación de estos genes sobre-expresados (Figura 6B). Western blot ha demostrado que SBT-1214 y CMC2.24 como agentes únicos inducidos moderada baja regulación de c-Myc y Sox2 en extractos nucleares de ambos CD133
+ y células pPT2 a granel, mientras que la administración del fármaco combinado llevó a prácticamente completa la inhibición de su expresión (Figura 6C). Es importante destacar que, fracciones nucleares de ambos CD133
+ y células pPT2 granel no expresaron los dos tumorales supresores /reguladores de apoptosis, p53 y p21 (Figura 7A), que en parte puede explicar su extrema resistencia a fármacos contra el cáncer. Tanto SBT-1214 y CMC2.24, y especialmente de su expresión induce combinación de p21 y p53. Tal "gen de atención" inducida por el tratamiento previo con la combinación de fármacos (SB-1214; 1μM y CMC2.24; 10μM) durante 24 horas dramáticamente aumentó aún más la sensibilidad de estas células altamente resistentes al fármaco al segundo tratamiento, lo que lleva a prácticamente completa la muerte de las células enriquecidas-CSC (Figura 7B, C)
.
(a) múltiples de células madre relevantes factores de transcripción son regulados hasta en la población de células CD133 + en comparación con sus homólogos diferenciados. (B) El descenso de regulación de los factores de transcripción regulados hasta después del tratamiento con 1 mM SBT-1214 y 10 mM CMC2.24 durante 24 horas (ensayo de PCR matriz; SABiosciences; PAHS 501). Western blot confirmó significativa baja regulación de los principales factores de transcripción pluripotencia, c-Myc y Sox-2 en CD133
+ células (C). Histona H1 se utilizó como control de carga.
(A) que no tenía anteriormente proteínas supresoras de pro-apoptótica /tumor, p21 y p53 fueron inducidos por el tratamiento único con SBT-1214 /CMC2.24 combinación de 24 h en tanto CD133
+ y células pPT2 a granel. Tal "gen de atención" llevado a un aumento significativo en la sensibilidad del CD133
+ células a esta combinación de fármacos (B, C). El tratamiento previo [SBT-1214 (1 M) + CMC2.24 (10μM)];