Extracto
Antecedentes
La prevalencia de nódulos tiroideos aumenta con la edad, el promedio de 4-7% para la población adulta EE.UU., pero es mucho más alta (19-67%) cuando se consideran los nódulos sub-clínica. Alrededor del 90% de estas lesiones son benignas y es necesario un enfoque fiable para su caracterización preoperatoria. Desafortunadamente gammagrafía tiroidea convencional no permite la distinción entre las proliferaciones benignas y malignas de la tiroides pero proporciona sólo información funcional (
nódulos fríos o calientes
).
La expresión de la molécula anti-apoptótica galectin- 3 está restringida a las células cancerosas y esta característica tiene implicaciones potenciales de diagnóstico y terapéuticos. Mostramos aquí la posibilidad de obtener imágenes de cánceres de tiroides
in vivo fotos: por la orientación galectina-3.
Métodos
La tiroides inmuno-gammagrafía con base galectina-3 utiliza como un marcador radiactivo específica
99m Tc-mAb radiomarcado. Una mini cámara gamma de alta resolución sensible a la posición se utiliza como dispositivo de captura de imágenes. galectina-3 positivos xenoinjertos humanos de cáncer de tiroides (ARO) y la galectina-3 tumores knockout se utilizaron como dianas en diferentes experimentos
in vivo
. 38 ratones con masa tumoral de aproximadamente 1 g se inyectaron en la vena de la cola con 100 Ci de
99m Tc-mAb marcado a la galectina-3 (30 mg de proteína /100 en solución salina l). imágenes tumorales fueron adquiridas a 1 hora, 3 horas, 6 horas, 9 horas y 24 horas después de la inyección mediante el uso de la cámara mini-gamma.
Los resultados
Los resultados de diferentes experimentos consecutivos muestran una óptima visualización de cáncer de tiroides xenoinjertos entre 6 y 9 horas de la inyección del radiotrazador. Galectina-3 tumores negativos no se detectaron en absoluto. A las 6 horas después de la inyección de la galectina-3 tumores que expresan se visualizaron correctamente, mientras que la actividad de todo el cuerpo se había aclarado esencialmente.
Conclusiones
Estos resultados demuestran la posibilidad de distinguir preoperatoriamente benignos de la tiroides maligno nódulos mediante el uso de un galectina-3 de radio-immunotargeting específica.
In vivo
de imágenes de cáncer de tiroides puede permitir una mejor selección de los pacientes que se refiere a la cirugía. La posibilidad de aplicar este método para la formación de imágenes y el tratamiento de otros tumores que expresan galectina-3 también se discute
Visto:. Bartolazzi A, C D'Alessandria, Parisella MG, Signore A, Del Prete M, L Lavra, et al. (2008) Cáncer de tiroides Imaging
En Vivo fotos: por la orientación anti-apoptóticos molécula galectina-3. PLoS ONE 3 (11): e3768. doi: 10.1371 /journal.pone.0003768
Editor: Andrew Boswell, Genentech, Estados Unidos de América
Recibido: 23 Junio, 2008; Aceptado: 2 de noviembre de 2008; Publicado: noviembre 20, 2008
Derechos de Autor © 2008 Bartolazzi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Con el apoyo de AIRC (Asociación italiana para la Investigación del cáncer). No hay otros patrocinadores jugaron un papel en este documento
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La alta prevalencia de nódulos tiroideos benignos en población adulta hace que la detección preoperatoria del cáncer de tiroides comparable a 'buscar una aguja en un pajar ". La prevalencia de nódulos tiroideos aumenta con la edad, el promedio de 4-7% de la población adulta U.S.A. [1] pero es mucho más alta (19-67%) cuando subclínica nódulos también se consideran [2]. Afortunadamente, alrededor del 90% de estas lesiones son benignas y por esta razón es necesario [1], [3].
La expresión de yoduro de sodio Symporter (NIS) un enfoque fiable y sistemático para su caracterización en el preoperatorio membrana de las células de la tiroides permite la glándula tiroides para concentrar yoduro del suero. Se requiere mediada por NIS captación de yoduro para las posteriores organificación y oxidación pasos, que son eventos clave para la producción de hormonas tiroideas. Esta peculiar característica de la glándula tiroides apoya gammagrafía convencional, que utiliza yodo radiactivo en la definición de la glándula tiroides en los estados tanto fisiológicas y patológicas [4]. Sin embargo, esta técnica ampliamente utilizada no permite la distinción entre las proliferaciones benignas y malignas de la tiroides. De hecho, aunque el cáncer es poco común en los nódulos tiroideos con captación de yoduro eficiente (redactado
nódulos Hot News), la gran mayoría de las proliferaciones de tiroides que no logran concentrarse yoduro (
nódulos fríos) son biológicamente
El benigna [ ,,,0],4].
células tiroideas
normalmente no expresan galectina-3. Una expresión forzada de galectina-3
a través de
transfección de ADNc específico genera un fenotipo transformado, bloqueando el programa de apoptosis, una característica que favorece el desarrollo del cáncer [5] - [9]. Curiosamente, como se informó anteriormente en un gran estudio retrospectivo multicéntrico de material histológico, los carcinomas de tiroides bien diferenciados casi invariablemente expresan galectina-3 (& gt; 94% de todos los tipos de cáncer de tiroides, con la exclusión del carcinoma medular), mientras que las proliferaciones tiroideos benignos hacen no (sólo el 2% de los nódulos benignos, en su mayoría representados por adenomas, eran galectina-3 positivo) [10]. Este hallazgo fue confirmado por varios estudios reportados en la literatura [11] - [14] y la galectina-3 inmunotinción ya se utiliza en la práctica clínica, a nivel de inmuno-citológica, para una mejor selección de los pacientes derivados a tiroidectomía [10], [15] - [17]. En este estudio, mediante el uso de
in vivo
y
ex vivo
modelos experimentales de cáncer de tiroides se presenta la posibilidad de obtener una imagen del cáncer de tiroides fiable
in vivo fotos: por la focalización galectina-3 molécula de lectina. Este enfoque de diagnóstico puede también ser utilizado para obtener imágenes de diferentes tumores que expresan galectina-3
in vivo
.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y ARNm de la galectina-3 interferencia
líneas celulares de carcinoma de tiroides ARO, proporcionado amablemente por el Dr. Silvia Soddu (Instituto Nacional del cáncer Regina Elena de Roma, Italia) fue descrito anteriormente [18] - [19]. Aunque el origen de las células de la tiroides ARO ha sido cuestionado recientemente [20], esta línea celular positiva galectina-3 crece de manera muy eficiente
in vivo
y proporciona un modelo útil para configurar experimentos de galectina-3 immunotargeting con y sin galectina -3 interferencia mRNA. Las células se cultivaron en condiciones estándar a 37 ° C y 5% de CO
2 atmósfera en medio RPMI-1640 suplementado con glutamina 2 mM, 10% de FCS, penicilina y estreptomicina (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD).
Para la galectina-3 interferencia mRNA tres secuencias diferentes se identificaron y se ensayó como se informó anteriormente [21]. Las dos secuencias siguientes, que fuertemente y de manera similar hacia abajo regulados galectina-3 expresión en células ARO se subclonaron en el vector pSUPER y se utiliza de forma intercambiable (motivos conservados están subrayadas): 5'-GATCCCCCAACAGGAGAGTCATTGTTTTCAAGAGAAACAATGACTCTCCTGTTGTTTTTGGAAA-3 '(Gal3-551, sentido); 5'-AGCTTTTCCAAAAA CAACAGGAGAGT-CATTGTTTCTCTTGAAAACAATGACTCTCCTGTTGGGG-3 '(Gal3-551, antisentido); GATCCCCACCTTACATGTGTAAAGGTTTCAAGAGAACCTTTACACATGTAA-GGTTTTTTGGAAA-3 '(Gal3-845, sentido); y 5'-AGCTTTTCCAAAAAACCTTAC-ATGTG TAAAGGTTCTCTTGAAACCTTTACACATGTAAGGTGGG-3 '(gal3-845, antisentido).
En el experimento se muestra en la Figura 1 (panel B) células ARO fueron transfectadas establemente con pSUPER-Gal3-551 (aro- ) vectores Gal-3i y falsamente transfectadas con el vector pSUPER como control (ARO-ctr). La selección de células transfectadas de forma estable se realizó mediante tratamiento con puromicina 2 g /ml (Sigma) 72 horas después de la transfección
.
A) imagen adquirida con una mini cámara gamma de alta resolución en un ratón que lleva ARO (Gal3 +) xenoinjerto después de 6 horas desde iv inyección de 100 Ci de
99m Tc-mAb marcado a la galectina-3. La flecha indica la masa tumoral revelado en la pierna izquierda. Una acumulación coherente del trazador de radio se observa en el hígado de acuerdo con la liquidación de mAb exógeno (panel 1A); Evaluación morfológica e inmunohistoquímico de los tumores extirpados xenoinjerto muestran un cáncer de tiroides pobremente diferenciado con una expresión variable de la galectina-3, según lo revelado por un mAb galectina-3 específica y un método de tinción de inmunoperoxidasa directa (panel 2A); La tabla muestra la cinética de la relación tumor /normal de los músculos del trazador de radio en diferentes puntos de tiempo (panel de 3A). B) La imagen adquirida con una mini cámara gamma de alta resolución en un ratón que lleva galectina-3 interfirió ARO xenoinjerto (Gal3-) después de 6 horas de la administración i.v. inyección de 100 Ci de
99m Tc-mAb marcado con galectina-3 (panel 1B); evaluación inmunohistoquímica del tumor extirpado muestra una constante baja regulación de la expresión de galectina-3 (2B panel); La eficiencia de la interferencia de ARN estable galectina-3 abajo en la regulación galectina-3 de expresión se demuestra en la inmunotransferencia. células ARO maqueta transfectadas con pSUPER vector se utilizaron como control (CTR); galectina-3 interfirió células ARO fueron estables transfectadas con pSUPER-Gal3-551 vector (Gal3i); α-tubulina se utilizó como control de carga. El análisis de densitometría de las especies moleculares visualizados en el gel también se muestra (panel 3B). Los resultados se expresan como unidades relativas de densitometría (RDU), medidos señal de normalización Gal-3 con la intensidad de la banda correspondiente α-tubulina.
El descenso de regulación de la galectina-3 de expresión se marcaba en Western blot en diferentes puntos de tiempo (12-72 horas después de la inyección de transfección las células tumorales y en ratones).
Los anticuerpos monoclonales e inmunohistoquímica
a purificada con peroxidasa de rábano conjugada con anticuerpo monoclonal de rata (conjugado con HRP) para la galectina -3 (srl SPACE, Milán, Italia) se utilizó en inmunohistoquímica-citoquímica de acuerdo con las instrucciones del fabricante como se informó anteriormente [13]. Brevemente, el tratamiento con microondas antígeno recuperación de tejidos diapositivas de 0,01 mol /L se aplicó tampón de citrato pH 6,0 durante tres ciclos de 3 minutos cada uno a 750 W. rata purificada mAb dirigido a la galectina-3 se utilizó en un rango de concentración de 5-10 g /ml. La actividad enzimática se visualizó con 3, 3'-diamino-bencidina (Dako, Glostrup, Dinamarca).
análisis de Western Blot
Se obtuvieron extractos de células totales (ECT), usando un tampón de lisis compuesta por: Tris HCl 50 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 1%, PMSF 1 mM y 1 comprimido de cóctel de inhibidor de la proteína completa (Roche). Una alícuota de TCE (30-70 mg) se separó en un 10% SDS-PAGE, y luego se transfirió a una membrana de nitrocelulosa (Bio-Rad). Los siguientes anticuerpos fueron utilizados en la inmunotransferencia: un mAb de rata purificada para la galectina-3 (Mabtech AB, Nacka Strand, Suecia), un mAb de ratón anti-α-tubulina (TU-02, Santa Cruz Biotechnology) y conjugado con HRP anti-ratón IgG y anti-IgG de rata antisueros específicos (Sigma). La inmunorreactividad se detectó mediante el uso de análisis de quimio-luminiscencia (kit ECL, Amersham Corporation). Las especies moleculares resueltos en el Western Blot fueron finalmente analizaron por densitometría, utilizando un software dedicar (NIH ImageJ, versión 1.32j).
Los resultados se expresan como unidad de densitometría relativa (RDU) después de la normalización de los valores de densitometría de la banda obtenido para α-tubulina.
Los modelos murinos de xenoinjertos de cáncer de tiroides
libres de patógenos 4-5 semanas de edad desnuda
(nu /nu)
ratones (Charles River , EE.UU.) fueron utilizados para el establecimiento de xenoinjertos de cáncer de tiroides
in vivo
. Los ratones fueron mantenidos en jaulas de 4 animales cada uno con agua y comida
ad libitum
. La galectina-3 que expresa y altamente tumorigénicas pobremente diferenciado de tiroides folicular línea celular de carcinoma (ARO) y se consideraron las células ARO derivada galectina-3 knockout (ARO-Gal3 negativos) para estos experimentos.
De tipo salvaje y interferido ARO células se mantuvieron en condiciones de cultivo estándar como antes mencionados, separados de placas de cultivo de tejido con tripsina 0,05% EDTA 0,02% (Gibco), se lavó en PBS estéril y se inyectaron por vía subcutánea en ratones desnudos a una concentración que varía de 7 × 10
6 a 10
7 células /0.2 ml de solución salina, dependiendo del experimento. La inyección de las células se realizó mediante el uso de una aguja de insulina estándar.
No anestesia fue necesario. Cincuenta animales fueron utilizados en tres conjuntos diferentes de experimentos para establecer xenografs tumorales. Los ratones fueron examinados tres veces a la semana en busca de signos de crecimiento tumoral medible.
Los ratones fueron seleccionados para
in vivo
experimentos de imagen en cuando el peso del tumor fue de alrededor de 0,5-1 g. Para determinar el
in vivo
expresión de galectina-3 en xenoinjertos tumorales, algunos de los tumores fueron extirpados quirúrgicamente y se utiliza para el análisis de la expresión de galectina-3 como se informó anteriormente. Este trabajo se realizó de acuerdo a los lineamientos específicos proporcionados por el Ministerio de Salud Pública italiana para la experimentación con animales. Este estudio ha sido aprobado por el Comité Institucional de Ética para la experimentación animal en el Instituto Nacional del Cáncer Regina Elena de Roma. La instalación de animales en el Instituto Nacional del Cáncer de Roma está certificada por el Ministerio de Salud Pública italiana.
Radio etiquetado de anticuerpo monoclonal para la galectina-3
La afinidad purificado y altamente concentrado (5 mg /ml) anticuerpo monoclonal humano de la galectina-3 (Mabtech, Nacka, Suecia) fue de marcado radiactivo utilizando el método se informó anteriormente [22]. En pocas palabras, los puentes disulfuro de anticuerpo se redujeron usando un exceso molar de 2-mercaptoetanol (Sigma-Aldrich) durante 30 minutos a temperatura ambiente seguido por la purificación con una columna Sephadex G-25 (Amersham Biosciences GmbH, UK) y tampón de fosfato frío purgado con nitrógeno pH 7,4 como eluyente. El anticuerpo reducido se almacenó a -80 ° C hasta su uso. Activado galectina-3 mAb (400 g /200 l de volumen) se marcó mediante la adición de 7 l de un diposphonate-metilen (MDP) Kit gammagrafía ósea (Medrotec®, Amersham Health, Reino Unido) como se informó anteriormente [22] y 10 mCi (370 MBq) de
99mTcO
4
- recién eluido de (
99Mo /
99m) generador (GE-Healthcare, Reino Unido). eficiencia de marcaje (LE) se evaluó mediante el uso de cromatografía en capa fina instantánea (ITLC-SG, VWR, Italia) con 0,9% NaCl como fase móvil.
Las tiras se analizaron mediante un escáner computarizado mini-radio (Sistema Bioscan , Italia). LE, era & gt;. 95% con una actividad específica final de 70 Ci /g (Fig. S1 línea)
Con el fin de optimizar la eficiencia del etiquetado anticuerpo varios experimentos se realizaron variando la relación molar 2-mercaptoetanol /mAB (rango: 1.000:1 a 4.000:1) y la relación de mAb /
99m para el etiquetado (rango 250.000:1 a 4.500.000:1)
la reducción de los puentes disulfuro en una. relación molar de 2145:1 (2-mercaptoetanol /mAb) y una relación molar de 1,500,000:1 para Ab /
99mTc dio la más alta LE de
99mTc-anti-galectina-3 y se utilizaron para todos los experimentos adicionales (Fig. S1 en línea).
estudios específicos de estabilidad se llevaron a cabo incubando la radio fresco anticuerpo marcado en solución salina o plasma humano a 37 ° C durante 24 horas y la evaluación de la pureza radiofármaco por ITLC-SG en diferentes puntos temporales (1 hr, 3 horas, 6 horas y 24 horas). La estabilidad en solución salina y plasma fue alta durante las primeras 6 horas (& gt; 90% y & gt; 80% para solución salina y plasma, respectivamente) con una ligera disminución a las 24 h (Fig. S1 línea)
. alta Resolución de la cámara gamma
La cámara gamma de alta resolución (HRC) (Li-tech Srl, Italia), que se muestra en la figura S2 en línea está compuesta por una estructura de cristal-colimador acoplado a un Hamamatsu H8500 (Hamamatsu, Japón) sensible a la posición del tubo fotomultiplicador (PSPMT), carga electrónica de lectura y un sistema de adquisición de datos
El colimador de orificio paralelo patentado, ya se ha descrito [24] - [25]. está hecho de tungsteno puro con 200 micras de espesor septos. Se compone de un colimador 24 mm dispuestas sobre una estructura de colimador 6 mm adyuvante, en el que los cristales están integrados en los agujeros. La estructura se compone de centelleo en un 20 × 20 cristales CsI (Tl) array (Spectra Physics-Hilger, Reino Unido) con un campo de visión (FOV) de 49,0 × 49,0 mm
2. Las dimensiones de cristal son 2,05 × 2,05 × 5,0 mm
3 y cada cristal está cubierto by100 micras epoxi blanco reflectante en sus cinco superficies ciegas. La estructura cristalina de colimador está acoplado al PSPMT a través de la grasa óptica.
El H8500 PSPMT tiene un tamaño de 52,0 × externa de 52,0 × 18,0 mm
3 con un área activa de 49,0 × 49,0 mm
2. El fotocátodo es bi-álcali y el sistema de multiplicación, compuesta por dınodos canal 12 de metal, proporciona una ganancia de 3 × 10
6 @ -1000 V.
El precio de la operación se recogió mediante una matriz de 8 × 8 ánodos.
La lectura es un miniaturizados (52,0 × 52,0 × 5,0 mm
3) Electrónica de front-end, y las señales se muestrean con una tarjeta ADC compacto USB dedicado. El sistema de adquisición proporciona 4 canales a 20 M muestras /seg. adquisición y procesamiento de datos se lleva a cabo en un sistema Linux integrado equipado con ARM PXA255 CPU con pantalla táctil de 10 ". El control del sistema y el software de procesamiento de datos son aplicaciones propietarias desarrolladas en lenguaje C ++. El sistema permite la realización de una adquisición en tiempo real con un tiempo de refresco de 0,5 seg. El sistema está concebido para ser una batería operado dispositivo portátil; como consecuencia de los pesos de la cabeza del detector cerca de 2 kg, mientras que el peso total es de aproximadamente 4,5 kg.
La resolución de energía HRC es de aproximadamente 20% FWHM @ 140 keV (
99m) en todo el campo de visión. La sensibilidad es de 210 cps /MBq y la uniformidad es de ± 5%, mientras que proporciona 2,2 mm intrínseca resolución espacial adecuada para nuestros experimentos de imagen
in vivo en ratones
xenotransplantes tumorales, y
ex-vivo
con piezas quirúrgicas derivadas de pacientes humanos.
ex-vivo de imágenes de cáncer de tiroides humana
Como una prueba de concepto para la imagen diferenciada cáncer de tiroides en humanos, se realizó un
ex-vivo
Los estudios de unión usando como objetivo un ganglio linfático cervical metastásico recién extirpado de un paciente que lleva un carcinoma papilar de tiroides. Inmediatamente después de la extirpación quirúrgica del ganglio linfático se cortó por la mitad longitudinalmente a través de la lesión del cáncer y las dos secciones de tejido se incubaron a 37 ° C durante 3 h en una solución de 50 ml que contiene 2 Ci de
99mTc-anti-Gal-3 ( 0,1 g de proteína) en una solución salina con 1% de HSA en presencia o ausencia de 100 mg de no marcado contra-Gal-3 de anticuerpos
resultados
con el fin de evaluar la especificidad de unión de un
mAb marcado con 99mTc a la galectina-3
in vivo
, seis animales portadores de la galectina-3 xenoinjertos de carcinoma positivas (ARO-Gal-3
+) fueron consideradas en un experimento preliminar.
Ratones con masa tumoral de alrededor de 1 g se inyectaron en la vena de la cola (iv) con 100 Ci de
marcado con 99mTc mAb a la galectina-3 (30 mg de proteína /100 en solución salina l). Las imágenes fueron adquiridas en 1 hr, 3 horas, 6 horas, 9 horas y 24 horas después de la inyección mediante el uso de la cámara mini-gamma. La galectina-3 immunotargeting de tumores ARO era muy eficiente en ratones xenoinjertados. Una zona central de necrosis tumoral (confirmado histológicamente) con alteración de la unión del radiotrazador fue representado correctamente en uno de los casos (fig. S2 en línea). Los experimentos preliminares con diferentes galectina-3 tumores positivos, incluyendo melanomas, linfomas y carcinomas de mama también se consideraron para este fin con resultados superpuestos (datos no mostrados). Como se esperaba, la mayoría de la galectina-3 anticuerpo marcado de radio se concentró en el hígado de acuerdo con la liquidación de mAbs exógenos de la sangre [26] (fig. S2 en línea). Con el fin de optimizar la captura de imágenes y para demostrar la especificidad de unión del anticuerpo monoclonal galectina-3 una más grande
in vivo
experimento (repetido por triplicado) se consideró.
El experimento incluyó 12 ratones xenoinjertados , dos grupos de seis animales cada uno. El primer grupo fue trasplantado con 3 galectina-células ARO positivas a una concentración de 5-8 x 10
6 células /0,2 ml de solución salina /ratón; el segundo grupo de ratones fue trasplantado con células de la galectina-3 knockout Aro (ARO-Gal3 negativo), obtenido mediante el uso de un galectina-3 interferencia específica de ARN (ARNi) [20].
células negativas ARO-Gal3 eran inyecta por vía subcutánea a una concentración de 10
7cells /0,2 ml de solución salina /ratón, con el fin de promover un rápido crecimiento del tumor
in vivo
en unos 4 días.
Esto fue necesario para mantener una eficiente regulación a la baja de la galectina-3 en las células estables interfirió ARO, creciendo
in vivo Hoteles en ausencia de antibióticos como puromycine selectiva. La galectina-3 baja regulación estable en interfirió células ARO se comprobó en western blot en diferentes puntos de tiempo (12-72 horas). Después de 4 días de la inyección de células todos los ratones desarrollaron un tumor subcutáneo visible con un tamaño medio de diámetro de 0,5 cm. Los animales fueron inyectados en la vena de la cola con 100 Ci de
marcado con 99mTc mAb a la galectina-3 (proteína de 30 mg) y las imágenes de todo el cuerpo se adquirieron en 1 hr, 3 horas, 6 horas, 9 horas y 24 hrs mediante el uso de la cámara de alta resolución gamma.
se analizaron Imágenes dibujar las regiones de interés (ROI) sobre el tumor implantado y sobre el músculo lateral contador tomado como fondo. Como era de esperar la visualización óptima de la ARO-Gal-3
+ xenoinjertos se obtuvo entre 6 y 9 horas desde la inyección del radiotrazador, mientras que la galectina-3 tumores negativos no fueron detectados en absoluto (Fig. 1 Paneles A y B) . Los tumores se explantaron finalmente para la evaluación histológica y análisis inmuno-fenotípica como se muestra en la Figura 1.
En un conjunto diferente de experimentos, 20 ratones xenoinjertados ARO fueron inyectados con 100 Ci de
marcado con 99mTc mAb a galectina -3 (proteína de 30 mg) y 5 grupos de 4 animales cada uno, fueron sacrificados a las 3 horas, 6 horas, 9 horas, 12 horas y 24 horas después de la inyección, respectivamente.
Las muestras de tejido de la sangre, el hígado, bazo, riñón, intestino delgado, intestino grueso, el músculo y el tumor ARO xenoinjertos fueron retirados, ponderan y se contaron para determinar la presencia de radiactividad. Todos los animales fueron fotografiadas antes de ser abatido con resultados reproducibles (datos no mostrados). La
in vivo
bio-distribución de radio etiquetado galectina-3 mAb expresado como porcentaje de la dosis inyectada por gramo de tejido (% ID /g), mostró una depuración de la sangre rápida del producto radiofarmacéutico dentro de 3 horas de la inyección. La mayor parte de la radiactividad se detectó en el hígado y los riñones que indican un pronto despacho del trazador
a través of the hepática y del tracto urinario (tabla 1).
Como era de esperar la captación tumoral de mAb marcado con 99mTc galectina-3 específica
aumentó de 3 a 9 horas después de la inyección. A las 6 horas después de la inyección de los tumores diana eran claramente visibles mientras que la actividad de todo el cuerpo se había aclarado en esencia (tabla 1 y fig. S2 en línea).
A pesar de la traducción de estos hallazgos en el ámbito clínico requerirá el uso de anticuerpos monoclonales humanizados vinculados a diferentes radionucleidos y más extensos estudios preclínicos, se intentó simular una imagen basada en la galectina-3 de cáncer de tiroides humana
ex-vivo
. Para este fin un ganglio linfático cervical fresco quirúrgicamente extirpados de un paciente que lleva una metástasis de carcinoma papilar de tiroides (histológicamente confirmado), fue utilizado como diana para el estudio de la eficacia de la unión del radiotrazador específico Gal-3.
Inmediatamente después quirúrgica eliminación de los ganglios linfáticos se redujo a la mitad a través de la lesión de cáncer y se incubó a 37 ° C durante 3 horas en 50 ml de solución salina que contiene 2 Ci de
99mTc-mAb a la galectina-3 (0,1 g de proteína) y 1% humana albúmina de suero, en presencia o ausencia de 100 g de no marcado (frío) anti-galectina-3 mAb (ensayo de desplazamiento).
Después de un extenso lavado en solución salina se realizó una imagen comparativa de las dos preparaciones de tejido. Los resultados de este experimento se muestran en la figura 2.
La figura muestra la muestra de ganglios linfáticos cortados por la mitad longitudinalmente y la imagen mediante el uso de la mini cámara gamma después de 1 hora y 2 horas de incubación con 2 Ci de
marcado con 99mTc mAb a la galectina-3 (0,1 g de proteína) en solución salina, en presencia (panel B) o no (panel a) de un exceso (100 g) de no marcado galectina-3 mAb específico. El panel A muestra la detección de tumores por radiotrazador después de 1 hora y 2 horas de incubación. El panel B muestra una menor absorción constante del radiotrazador en presencia de un exceso de no marcado anti-gal3- mAb, debido al efecto de desplazamiento específico.
La mini cámara gamma detectar rápidamente la metástasis del cáncer de tiroides (panel a), mientras que una captación tumoral escasa del radiotrazador fue visible en el control, debido al efecto de desplazamiento del frío mAb en exceso (panel B).
Discusión
en conjunto estos resultados sugieren la posibilidad de detectar el cáncer de tiroides y otros galectina-3 tumores que expresan
in vivo
mediante el uso de un determinado radio immunoscintigraphy galectina-3. El uso de galectina-3 radiotrazador para la detección del cáncer de tiroides
in vivo
se apoya en un fundamento sólido molecular [5], [7] - [10]. Además recientemente hemos demostrado que la galectina-3 immunotargeting representa una herramienta de diagnóstico útil para la identificación de las proliferaciones malignas de la tiroides antes de la operación en las bases de inmuno-citológico, aunque algunos carcinomas tiroideos (alrededor del 10-15%, dependiendo de los estudios) no expresan galectina-3 [10] - [14], [17]. La radio-inmunogammagrafía galectina-3 basada propone aquí, proporciona información biológica sobre los nódulos tiroideos y representa una guía útil para identificar correctamente los proliferaciones de tiroides que deben ser evaluados citológico y /o eliminado con prontitud.
La combinación de imágenes galectina-3 con la tiroides FNA-citología, de hecho, puede permitir a distinguir preoperatoriamente benignos de la tiroides proliferaciones malignas con alta eficiencia. Como consecuencia de ello muchos tiroidectomías innecesarias podrían evitarse y el uso clínico de la gammagrafía de tiroides convencional con yoduro de radio, que sólo proporciona información funcional en las condiciones específicas de la tiroides, podría estar restringido a cuestiones clínicas más seleccionados. Otros estudios que utilizan la galectina-3 anticuerpos monoclonales humanizados específicos conjugados con diferentes radionucleidos será necesaria para confirmar y validar estos hallazgos. Si el enfoque diagnóstico propuesto tendrá éxito un objetivo de radio-ablación de la galectina-3 tumores que expresan también puede ser explorado mediante el uso de galectina-3 anticuerpos monoclonales específicos conjugados con diferentes compuestos de radio (es decir,
186Re,
177Lu o
90Y,
64Cu,
67Cu). A la galectina-3 'radiación terapia dirigida "proporciona la dosis de radiación, específicamente al tumor positivo galectina-3 con una exposición limitada de los tejidos normales. La penetración de los rayos beta en los tejidos vivos es de varios milímetros y el efecto terapéutico puede obtenerse también en las células cancerosas que no toman directamente del radiofármaco (efecto de fuego cruzado). Este enfoque podría ser útil para la detección y el tratamiento de los carcinomas papilares de tiroides micro (lesiones menores de 1 cm, comúnmente redactadas '
oculta PTC de búsqueda:'), que actualmente son indetectables antes de la operación.
Además, la posibilidad de tratar neoplasias de la tiroides primarios y metastásicos que son galectina-3 positivo, pero ávido no yodo y por esta razón por la que no responden a la terapia de radio-metabólica convencional con
131Iodine, representa un logro importante en la oncología que será investigarse más a fondo.
los datos preliminares de
in vivo
también se han obtenido imágenes de la galectina-3 melanomas, linfomas positivos y los carcinomas de mama abrir posibilidades interesantes para el futuro utilizar mAbs marcados de radio para galectin- 3
in vivo
imágenes y el tratamiento de diferentes tipos de tumores malignos humanos [27] - [31]
Apoyo a la Información
Figura S1..
estabilidad y eficacia de marcado del radiotrazador galectina-3. La estabilidad del radiotrazador se evaluó mediante la incubación de una muestra de la radio marcado mAb en solución salina y suero durante 24 horas a 37 ° C. El porcentaje de tecnecio unido a la mAb se evaluó mediante instantánea en capa fina de gel de sílice Chromatography- base (ITLC-SG) tiras en diferentes puntos temporales. El gráfico muestra la retención de tecnecio que oscila entre 100% y 85% durante los primeros seis horas (alrededor de 360 minutos) con una ligera disminución de 6 a 24 horas (panel superior). La actividad para el mAb radiomarcador contra galectina-3 se ha evaluado en un experimento de valoración. La mejor relación de mAb /Tc se ha calculado mediante la variación de la actividad de 99mTc añadido a un volumen estable de anticuerpo reducido. La eficiencia de marcaje (LE) se evaluó mediante ITLC-SG. La relación óptima mAb /Tc encontraron fue 1.200.000 /1 que corresponde a 30 a 40 mCi de actividad y una eficacia de marcado de hasta 95%. Una actividad superior a este valor no aumentó la LE (panel inferior B)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0003768.s001 gratis (DOC 8,52 MB)
figura S2.
imágenes de tumores in vivo mediante el uso de mAb marcado con 99mTc de galectina-3 y una mini cámara gamma portátil de alta resolución. A) El portátil mini cámara gamma de alta resolución utilizada en este estudio. B) La imagen captada por la cámara gamma de alta resolución en un ratón que lleva el xenotrasplante positivo carcinoma de tiroides galectina-3 ARO, después de 6 horas de la administración i.v. inyección de 100 Ci de mAb marcado con 99mTc de galectina-3. El tumor se confirmó en la histología fue de 1,2 cm de diámetro y mostró una gran zona necrótica central correspondiente a la laguna que no pudo solucionar el radiotrazador (flecha)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0003768.s002 gratis (10.39 MB DOC)
Reconocimientos
agradecemos Marco Paolo Martegani para la asistencia técnica en la preparación de manuscritos.