Extracto
Un número creciente de enfermedades malignas se ha demostrado que ser iniciado e impulsado por los pequeños subpoblaciones de células madre del cáncer (CSC). Sin embargo, si la agresividad del tumor es impulsado por CSC y por qué medida esta propiedad puede ser relevante dentro de la masa tumoral está todavía sin resolver. Para abordar esta cuestión, hemos aislado una población de células tumorales raras sobre la base de su CD44
+ CD24
- fenotipo de la línea celular de carcinoma de próstata independiente de andrógenos humano DU145 y establecimos sus propiedades CSC. El comportamiento de CSC seleccionado se investigó con respecto a las células DU145 a granel. La inyección de CSC en ratones desnudos generado tumores altamente vascularizados que infiltran los tejidos adyacentes, que muestran alta densidad de las células neuroendocrinas y que expresan bajos niveles de E-cadherina y β-catenina, así como altos niveles de vimentina. Por el contrario, cuando se inyectó un número comparable de células DU145 sin clasificar, el tumores resultantes eran menos agresivos. Para investigar las diferentes características de los tumores
in vivo
, se examinó la influencia de las células tumorales diferenciadas en CSC
in vitro fotos: por CSC crecimiento en ausencia o en presencia de medio condicionado de células DU145. CSC cultiva en condiciones permisivas diferenciados en las poblaciones de células con características similares a las de las células tuvo lugar en los tumores agresivos generados a partir de la inyección CSC. Con otras palabras, el medio condicionado inducida CSC para diferenciarse en un fenotipo celular comparable a las células de tumores apenas agresivas originado a partir de la inyección de células DU145 a granel. Estos resultados muestran por primera vez que CSC son capaces de generar células diferenciadas expresan bien fenotipo altamente o poco agresivo, influyendo así en la progresión del cáncer de próstata. El destino de CSC se determinó mediante señales liberadas de ambiente del tumor. Por otra parte, mediante el análisis de microarrays se seleccionaron algunas moléculas que podrían estar involucrados en esta señalización de célula a célula, la hipótesis de su valor potencial para aplicaciones terapéuticas o de pronóstico
Visto:. Salvatori L, M Caporuscio, Verdina A, Starace G, Crispi S, Nicotra MR, et al. Señalización (2012)-célula a célula influye en el destino de cáncer de próstata Células Madre y su capacidad de generar tumores más agresivos. PLoS ONE 7 (2): e31467. doi: 10.1371 /journal.pone.0031467
Editor: Alfredo Fusco, Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), Italia |
Recibido: 8 de Junio, 2011; Aceptado: 9 Enero 2012; Publicado: 6 Febrero 2012
Derechos de Autor © 2012 Salvatori et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado en parte por el Ministerio de Sanidad italiano (PRIN 2006062242). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Sin financiación externa adicional fue recibida para este estudio
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El adenocarcinoma de próstata (CaP) es un líder. causa de muerte entre los hombres en los Estados Unidos y Europa occidental [1]. Debido a su crecimiento dependiente de andrógenos, la hormona de ablación sigue siendo el principal tratamiento de la enfermedad metastásica. Si bien inicialmente eficaz, este tratamiento es seguido en pocos años por la recurrencia del tumor [2] en el que se cree un neuroendocrino (NE) subpoblación independiente de andrógenos de las células a desempeñar un papel importante [3], [4]. células NE son células quiescentes, diferenciadas terminalmente que se caracterizan por procesos dendríticos que se extiende entre las células adyacentes y por la expresión de proteínas neuronales similares, tales como CD56 y cromogranina A (CGA) contenidos en los gránulos citoplasmáticos densos [5]. A través de la secreción de neuropéptidos células NE modulan la actividad de epitelio de próstata normal, pero también son capaces de influir en las células epiteliales transformadas adyacentes a través de señales paracrinas, estimulando así el crecimiento del tumor y la capacidad metastásica [5] - [7]. De hecho, una población de células NE aumento en el CaP se cree que está asociada con una enfermedad más agresiva, mientras que un número bajo de células NE en el tejido tumoral no tienen ningún significado pronóstico específico [6], [8], [9]. Curiosamente, tanto NE y el linaje epitelial secretora se derivan de una célula madre pluripotente común de próstata [10].
A mecanismo básico más implicados en la progresión del CaP se reduce la expresión de E-cadherina, la molécula principal de adhesión transmembrana responsable de las interacciones célula a célula y la organización del tejido en las células epiteliales [11], [12]. A través del dominio citoplásmico, se une β-catenina, que influye en disposición de citoesqueleto [13]. Como consecuencia, la pérdida de la función de E-cadherina o expresión se considera un evento crucial en la rotura de la adhesión célula-célula y la arquitectura del citoesqueleto y en la adquisición de un fenotipo invasivo en las células tumorales [14]. En particular, en el CaP, una menor expresión de E-cadherina se asoció con mayor estadio tumoral avanzado y grado [15], [16]. Mal de próstata diferenciado tumores también mostraron una mayor expresión de vimentina, un componente del citoesqueleto responsable de mantener la integridad celular, y altos niveles de vimentina en correlación con la capacidad de invasión de líneas celulares de cáncer de próstata, incluyendo DU145 [17].
Tradicionalmente, se han considerado los tumores que se compone de células heterogéneas con proliferativa ilimitada comparable y el potencial tumorigénico. Sin embargo, recientemente se ha planteado la hipótesis de que sólo las células raras dentro del tumor, las células madre del cáncer con nombre (CSC), son capaces de proliferar extensivamente y son tumorigénicos, mientras que la mayoría de las células de la masa tumoral muestran un grado variable de diferenciación y se someten a una número limitado de divisiones. Su contribución al crecimiento tumoral y la metastatización se considera que es bastante limitado. Es importante destacar que este modelo implica la necesidad de un nuevo enfoque terapéutico específicamente dirigidas a la CSC en el intento de erradicar definitivamente el tumor [18]. Sin embargo, si la agresividad del tumor es impulsado por CSC y por qué medida esta propiedad puede ser biológicamente relevante dentro de la masa tumoral de origen natural todavía es no aclarado.
A medida que la presencia de CSC en el CaP [19] y las líneas celulares de cáncer de próstata [20] recientemente se ha demostrado sobre la base del perfil antigénico de superficie CD44
+ /α
2β
1
hi /CD133
+ y CD44
+ CD24
- , respectivamente, en el presente estudio tuvo como objetivo evaluar la contribución de CSC para la progresión del tumor. Se aislaron CD44
+ CD24
- stem-como las células cancerosas de la línea celular de cáncer de próstata independiente de andrógeno-DU145 derivado de una metástasis cerebral de PCa humana, mostró sus propiedades CSC, y se investigó su fenotipo y el comportamiento con respecto a la las células DU145 a granel. Es importante destacar que, en este modelo de cáncer de próstata se observó que CSC fueron capaces de generar tumores altamente agresivos en ratones NOD /SCID y que este potencial se limita por la presencia de células DU145 diferenciadas con el consiguiente crecimiento de los tumores menos agresivos. En consonancia, por el crecimiento de CSC en el medio condicionado de células DU145
in vitro
, que dio a conocer que los factores difusibles liberadas de las células tumorales diferenciadas fueron capaces de frenar CSC de diferenciarse en las poblaciones de células que muestra un fenotipo agresivo y con características similares a las de las células mantenidas en los tumores generados en los ratones de la inyección de CSC. Finalmente, el análisis funcional de genes que se encuentran diferencialmente expresado en células de CSC y DU145 por el análisis de microarrays confirmó el papel esencial de las moléculas de señalización célula a célula para determinar el comportamiento de CSC. Otras investigaciones realizadas también en otros modelos de cáncer de próstata podría asignar un valor pronóstico o terapéutico de esta firma.
Resultados
El aislamiento y la caracterización de CSC a partir de células de cáncer de próstata DU145
DU145 las células fueron enriquecidas por células activadas por fluorescencia (FACS) para la población que expresa CD44
+ CD24
- [20], que representa aproximadamente el 10% de las células DU145 granel (Figura 1A). Hemos probado las propiedades madre, de células seleccionadas para describir indiscutiblemente como la próstata CSC. Un porcentaje muy pequeño de CD44
+ CD24
- células aisladas fue capaz de generar agrupaciones esféricas no adherentes, esferoides o prostaspheres denominados, en medio libre de suero suplementado con EGF, bFGF e insulina (recambio Medium Suero, SRM ). Esferoides crecieron muy lentamente, alcanzando el tamaño de alrededor de 300 micras dentro de 6-8 semanas (Figura 1B). Como era de esperar, los esferoides se enriquecieron para CD44
+ CD24
- células, como se determina tanto por inmunofluorescencia (IF) tinción (datos no mostrados) y el análisis cuantitativo PCR en tiempo real (Q-PCR), con resultados comparables. De hecho, en esferoides CD44 mRNA se expresó en niveles similares a las células DU145, mientras que la expresión de CD24 fue significativamente menor (Figura 1C).
(A) FACS análisis de CD44 y la expresión de CD24 en las células DU145. (B) Cultivo de aislados CD44
+ CD24
- células que crecen en SRM prostaspheres como no adherentes (5 × objetivo). (C) Q-PCR de la expresión de CD24 y CD44 en las células DU145 y esferoides. Los datos se presentan como media ± SEM de 3 experimentos. *,
p Hotel & lt; 0,05
vs células DU145
. (D) Capacidad de auto-renovación de esferoides. la administración de suplementos de suero y la retirada de factores de crecimiento inducen el crecimiento de células esferoide células como adherentes con morfología (E), la tasa de proliferación (F) y la expresión de vimentina (G) comparable a las células DU145. Las fotografías de las células esferoides fueron tomadas con un microscopio de contraste de fases después de 10 y 20 días de crecimiento en medio que contiene FBS-(20 ×). Las transferencias de Western representativas muestran la expresión de vimentina y β-actina en células esferoide cultivadas en medio suplementado con FBS con respecto al control esferoides y células DU145. El histograma muestra la cuantificación densitométrica de la vimentina normalizado a ß-actina niveles. Los valores se expresan como media ± SEM de 3 experimentos independientes. (H) la incidencia de tumores y la latencia después de la inyección de 1 esferoide, 5.000 ó 3 × 10
6 DU145 células en ratones NOD /SCID.
Los esferoides contenía células auto-renovación a largo plazo, como demostrada por la capacidad de una fracción de células a partir de esferoides disociadas para generar nuevas prostaspheres duró más de 5 pasajes (Figura 1D).
Hemos observado que las células esferoide muestran capacidad de diferenciación. De hecho, cuando se retiran de factores de crecimiento y se expuso a 10% de medio que contenía FBS, una fracción significativa de células esferoide convirtió adherente, creció como una monocapa plana y mostró una morfología heterogénea altamente similares a las células DU145 después de 20 días (Figura 1E). En los primeros días de crecimiento en estas condiciones permisivas, las células esferoide mostraron un tiempo de duplicación de aproximadamente 50 h que disminuyó progresivamente hasta la tasa de proliferación de las células DU145, a saber, 30 h, a partir de 15 días de cultivo (Figura 1F). Por otra parte, para confirmar la aparición del fenotipo de las células cancerosas diferenciada DU145 se analizó la expresión de la proteína intermedia vimentina filamentos. De hecho, se ha informado la expresión de vimentina para ser modulados durante la maduración de las células de acuerdo con el linaje de células [21] y se encontró altamente expresado en la línea celular DU145 [17]. medio En realidad, después de 20 días en FBS suplementado con, las células vimentina-negativas derivadas de esferoides expresadas vimentina en niveles comparables a las células DU145 (Figura 1G).
Finalmente, se determinó la capacidad de producción de tumor de células esferoide con respecto a las células DU145 no clasificados en ratones inmunodeficientes. La inyección de 1 esferoide de 300 micras de diámetro, que contenía aproximadamente 5000 células, resultó en tumores en 80% de los ratones, mientras que la inyección de 5.000 células DU145 a granel generado tumores en 40% de los animales (Figura 1H). Además, la latencia del tumor fue también más corta en los ratones-esferoide inyectado que en los ratones inyectados con células no clasificadas (37 y 54 días, respectivamente). La inyección de 3 x 10
6 DU145 células, que se utilizaron como controles, los tumores con la menor latencia en todos los ratones generados. Coherente con un informe anterior [20], todos juntos nuestros resultados indican que CD44
+ CD24
- células esferoide presente propiedades biológicas clave de CSC, ya que mostraban la capacidad de auto-renovación, eran capaces de diferenciarse en células DU145 parentales y eran más tumorigénico de las células DU145 a granel cuando se inyectó el mismo número de células en los ratones.
composición heterogénea de esferoides
esferoides hasta 300 hasta 400 micras de diámetro mostró una arquitectura compacta (Figura 2A) debido a la presencia de contactos muy estrechos de célula a célula, como se ve en Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM). magnificación de alta potencia mostró múltiples complejos de unión formados por desmosomas y uniones adherentes (Figura 2B). células esferoides también presentan complejos de poro nucleares organizados en laminillas anilladas (Figura 2C), que se consideran precursores en el montaje de la envoltura nuclear. Son típicamente presente en las células embrionarias e inmaduros y desaparecen durante la diferenciación [22]. Sin embargo, los esferoides también tienen células diferenciadas que, en estas condiciones de cultivo selectivas para las células madre, mostraron varios niveles de degradación celular. En particular, las vesículas citoplasmáticas característicos fueron evidentes (Figura 2D), indicando que la fase degradantes se acercó a la necrosis celular (Figura 2F), mientras que los núcleos aparecieron casi intactos (Figura 2E). Estos daños sugieren el destino del terminal de células diferenciadas. Evaluación
(A) Fase de contraste de la estructura esferoidal (10 ×). análisis (B) TEM que muestra desmosomas y uniones adherentes (parte superior e inferior, respectivamente), así como las láminas anillados (C) en las células esferoide. (D) contraste de fase (20 ×) de un fragmento de esferoide rodeado de células caracterizadas por que sobresale blebs de citoplasma vacío, que presentan núcleos intactos como se muestra por tinción con DAPI (40 ×, E). (F) La tinción con azul de tripano muestra la presencia de células muertas en esferoides (10 ×). La tinción de inmunofluorescencia de una sección de esferoides y células DU145 (aumento original x 200) que muestra la expresión de E-cadherina (G), β-catenina (H) y vimentina (I).
Los esferoides y también se evaluaron las células DU145 para la expresión de marcadores de vástago (e-cadherina y β-catenina [23] - [25]) células diferenciadas (vimentina) y. La tinción de inmunofluorescencia identificó E-cadherina y expresión β-catenina en ambas poblaciones de células, pero a niveles más altos en esferoides (Figuras 2G y 2H, respectivamente). En particular, en las células esferoide E-cadherina y tinción β-catenina fue localizado en la membrana plasmática, mientras que en las células DU145 fue principalmente citoplasmática, lo que indica que las células tumorales diferenciadas fueron bastante independientes de las interacciones de célula a célula. El fenotipo maduro de las células DU145 fue acompañada por una alta expresión de vimentina, que, por el contrario, se expresa sólo por las células raras en esferoides (figura 2I). Por lo tanto, podemos concluir que los esferoides se enriquecen de CSC, sino también a cabo algunas células diferenciadas dañadas destinados a la necrosis.
Análisis de los tumores desarrollados en ratones
La comparación de los tumores generados en ratones NOD /SCID después de la inyección de 1 esferoide (que contiene aproximadamente 5000 células totales, teniendo en cuenta tanto CSC y células diferenciadas dañados) 5.000 células DU145 no clasificados (que contiene principalmente células diferenciadas y un porcentaje muy pequeño de CSC) o, varias diferencias macroscópicas fueron evidentes en el momento de la escisión del tumor. Los tumores de los esferoides crecieron profundamente en el sitio de inyección, invadieron los tejidos adyacentes y mostraron una marcada vascularización. A diferencia, los tumores procedentes de la inyección de células DU145 crecieron superficialmente y parecían estar bien delimitado y móvil en relación a los tejidos circundantes. vasos visibles eran raros o ausentes (datos no mostrados).
Estas diferencias fueron confirmados por análisis histológico. Los tumores de esferoides derivados se componen de células monomórficas con una alta relación núcleo /citoplasma y presentan un marcado crecimiento infiltrante que se caracteriza por bandas que invaden los tejidos musculares y adiposos circundantes (Figura 3A, panel izquierdo). Por el contrario, los tumores generados a partir de células DU145 sin clasificar que se componen de subpoblaciones de células morfológicamente heterogéneas y mostraron un crecimiento expansivo, comprimiendo en lugar de la infiltración de los tejidos del huésped adyacentes (Figura 3A, panel derecho). Curiosamente, los tumores altamente invasivos mostraron menor expresión de E-cadherina y β-catenina y la más alta expresión de vimentina en comparación con los tumores escasamente invasivas (Figura 3B). En particular, en cada tumor el patrón de expresión de estos 3 marcadores fue opuesta a la de las células que se originó el tumor en sí, es decir, células de CSC o DU145 (Figuras 2G, 2H).
(A) tinción histológica con H & amp; e de tumores crecido después de la inyección de 1 esferoide o 5.000 DU145 células que muestran (panel izquierdo) altamente invasiva y poco significativos fenotipo invasivo (derecha) (5 ×). Los asteriscos indican las fronteras entre los tumores y los tejidos circundantes. (B) transferencias de Western representativo que muestra la expresión de E-cadherina, β-catenina y vimentina en tumores. (C) La tinción inmunohistoquímica con el anticuerpo anti-CD31 de ratón destacando más alta densidad de los vasos en los tumores derivados-esferoide (indicado por asteriscos, panel izquierdo) en comparación con los tumores de células DU145 (derecha). (D) Q-PCR que muestra la expresión de CD31 en tumores de ratón. Ratón B2M se utilizó como control endógeno. Los valores son medias ± SEM de 3 experimentos. *,
p Hotel & lt; 0,05 en relación con los tumores generados a partir de esferoides. (E) IHC con anticuerpos anti-CD56 que muestra mayor densidad de células NE en los tumores generados a partir de esferoide que a partir de células DU145 (20 ×). (F) Q-PCR se presentan CGA nivel de ARNm en tumores. Los resultados se expresan como proporciones entre el gen diana y el control endógeno GAPDH y representan la media ± SEM de 3 experimentos independientes. *,
p Hotel & lt; 0,05 con respecto a los tumores generados a partir de esferoides. (G) Un análisis FACS representativo que muestra la presencia de CD44
+ CD24
- células en los tumores generados a partir de la inyección de 1 esferoide en ratones. Tumores que se originan a partir de la inyección de 5.000 DU145 células mostraron un CD44 comparable
+ CD24
- población de células (datos no presentados)
Los tumores generados a partir de esferoides mostraron también un mayor número significativo de. vasos sanguíneos (
p
& lt; 0,0001), como la supervisión de la tinción con el marcador de células endoteliales CD31 (Figura 3C, izquierda), en comparación con los tumores originados a partir de células DU145 (Figura 3C, derecha). Estos resultados fueron confirmados por el análisis del nivel de expresión CD31 mRNA (Figura 3D) e indican neoangiogénesis activa en los tumores generados a partir de esferoides. Además, el análisis inmunohistoquímico (IHC) mostró un mayor número de células positivas para CD56, un marcador de células NE, en los tumores más invasivos que en los tumores menos invasivos (Figura 3E). Esta observación fue confirmada por tiempo real PCR análisis de CGA, un marcador adicional de células NE (Figura 3F). Además, el análisis FACS de los tumores extirpados y digeridos reveló que ambos tipos de neoplasia contenían una CD44
+ CD24
comparable - población de células (Figura 3G). Estos resultados proporcionan evidencia de que CSC fueron capaces de generar tumores altamente invasivos en ratones desnudos. Sin embargo, la inyección de CSC con células tumorales DU145 diferenciadas (es decir, la inyección de células DU145 no clasificados) dio como resultado el crecimiento de tumores de bajo grado de agresividad.
Efecto del medio condicionado de células DU145 en la diferenciación de CSC
a la vista de todo lo anterior, se determinó la influencia de las células diferenciadas DU145 sobre la selección: CD44
+ CD24
- CSC de próstata
in vitro
. esferoides disecados se cultivaron en DMEM suplementado con FBS (para simular la inyección de esferoides en ratones) o en DMEM suplementado con FBS en el que las células DU145 se cultivaron previamente durante 3 días (medio acondicionado (CM), para simular la inyección de células DU145 mayor en ratones). En ambas condiciones de cultivo, CSC contenida en esferoides crecía en monocapa, pero su proliferación se redujo significativamente cuando se cultivaron durante 20 días en CM (-47%; Figura 4A). La inhibición de la proliferación esferoide se mejoró aún más mediante el aumento de la concentración de CM (datos no mostrados). Además, parece muy evidente que las células cultivadas en FBS que contiene medio eran bastante independiente de las interacciones de célula a célula a medida que crecían principalmente individualmente o en pequeños grupos con forma irregular, y su morfología y patrón de crecimiento fueron similares a los de DU145 las células (Figura 4B, panel izquierdo). Por el contrario, las células en CM estaban apretados entre sí y crecieron islas principalmente como redondeadas (Figura 4B, panel derecho). Curiosamente, después de 20 días y sólo en las placas que contienen medio suplementado con FBS, se observó la aparición de células que presentan la morfología dendrítica-como típico de las células NE (Figura 4B, panel izquierdo y la Figura 4C). La identidad de estas células fue confirmada por la evaluación de la expresión de CD56 en los gránulos citoplasmáticos de células NE (Figura 4C, panel derecho). El análisis de la expresión de marcadores de tallo y células diferenciadas destacó que después de 20 días en FBS que contiene medio, las células muestran niveles de E-cadherina, β-catenina y vimentina comparables a las mostradas por las células DU145 (Figura 4D). Por el contrario, las células cultivadas durante 20 días en CM exhiben niveles de expresión intermedios entre los que se muestran por el control de CSC y las células DU145, pero más cerca de los niveles de CSC. En particular, una reducción en la expresión de E-cadherina y β-catenina y un ligero aumento en el nivel de vimentina con respecto al control esferoides fue evidente (Figura 4D). Es de interés señalar que tanto la alta expresión de moléculas de adhesión y la baja expresión de vimentina indicaron fuertes interacciones célula a célula y la reducción de la motilidad celular, respectivamente, que de acuerdo bien con el crecimiento de las células peculiar como islas. Estos resultados indican que CSC cultivadas en condiciones permisivas fueron capaces de generar células terminalmente diferenciadas, a saber, las células DU145 y NE. Sin embargo, factores difusibles liberadas de las células DU145 impidió la diferenciación de CSC.
(A) La proliferación de CSC contenida en esferoides cultivadas en FBS que contiene medio o en CM a partir de células DU145 se evaluó en diferentes momentos del cultivo. Los datos se muestran como la media ± SEM de 3 experimentos. Los asteriscos indican un efecto inhibidor significativo de CM con respecto a FBS-medio (*,
p
& lt; 0,05). (B) contraste de fase (10 ×) de las células después de 20 días en FBS que contiene medio o en CM que muestra la diferente patrón de crecimiento de las células. En el panel izquierdo, el rectángulo pone de manifiesto la presencia de células NE. (C) El contraste de fases (a la izquierda, 20 ×) y si la tinción (derecha, 40 ×) de las células NE ramificados generados a partir de CSC cultivadas en FBS-medio. En particular, el panel de la derecha muestra la expresión de CD56 en el citoplasma y en los procesos celulares largos. (D) transferencias de Western representativo que muestra los cambios en la expresión de E-cadherina, β-catenina, y vimentina en esferoide CSC crecido en las diferentes condiciones de cultivo con respecto al control esferoides y células DU145. Los niveles de expresión de las 3 proteínas se determinaron por análisis densitométrico de las bandas respectivas y se normalizaron los niveles de beta-actina. Los valores reportados en los histogramas son la media ± SEM de 3 experimentos independientes.
Perfil
La expresión génica de las células DU145 CSC y
Para investigar la respuesta celular implicada en la tumorigénesis, tanto a nivel de la expresión génica y en el nivel pre-mRNA de empalme, se realizó un genoma en su conjunto, el análisis de microarrays de empalme de células sensibles a DU145 y su CSC seleccionado. Las muestras de ARN preparadas a partir de cada población celular se hibridó con Human exón 1,0 ST arrays, lo que permite la definición de los dos patrones de transcripción (análisis a nivel de genes) y eventos de maduración pre-ARNm alternativos (análisis exón nivel). de perfiles de expresión génica de nivel se detectó mediante estadísticas modelo lineal utilizando un método empírico de Bayes para moderar los errores estándar. Para evaluar las modificaciones de la transcripción, se analizaron los cambios de expresión génica en esferoide CSC
vs células DU145
. Para identificar los genes expresados diferencialmente, se aplicó un registro absoluta
2 veces el cambio ≥ +/- 1 y un P-value≤0.05 como puntos de corte. La complejidad del conjunto de datos se redujo mediante la eliminación de los conjuntos de sonda no significativos (los que no expresaron y aquellos que no cambia). De esta manera, más de 400 genes cuyos niveles fueron significativamente diferentes en CSC y se seleccionaron las células DU145. Una lista completa de los genes expresados diferencialmente se encuentra en la Tabla S1.
Análisis de los genes seleccionados
Se analizaron los genes expresados diferencialmente por sus funciones moleculares y celulares y vías asociadas utilizando el análisis Ingenuity Pathways software (IPA 7.0, Ingenuity Systems). El análisis de IPA identificado más de 70 clases funcionales, y entre ellos, se seleccionaron las 8 clases más consistentes que se encuentran enriquecidos dentro del conjunto de genes expresados diferencialmente (es decir, cáncer, movimiento celular, el crecimiento celular y la proliferación, la morfología celular, la muerte celular, celular desarrollo, ciclo celular, la señalización de célula a célula y la interacción; Figura 5A) que se adapta para caracterizar células CSC y DU145. Se combinaron los genes de las 8 clases funcionales seleccionados, la detección de 22 genes comunes, considerando a las conexiones funcionales. Estos se separaron a continuación en función de su localización celular. Curiosamente, un análisis más detallado de los genes sub-seleccionados mostró que 17 de los 22 productos de genes se localizan en la membrana plasmática o se secretan en el espacio extracelular (Figura 5B), el fortalecimiento de nuestros hallazgos anteriores que muestran la importancia de las interacciones entre el CSC y la microambiente. Aunque los genes seleccionados codifican proteínas con una amplia variedad de funciones, 4 grupos principales podrían ser identificados: 1) factores pro-angiogénicos angiopoyetina 2 (ANGPT2), factor de crecimiento vascular endotelial C (VEGFC) e inductor angiogénico rico en cisteína 61 (CYR61) se encontraron las reguladas en el CSC con respecto a las células DU145; 2) Los genes que codifican para moléculas de adhesión E-cadherina (CDH1), la integrina beta 6 (ITGB6) y la unión plakoglobina (JUP) se expresaron en más de CSC de acuerdo con el paralelo baja regulación de la proteína caveolas (CAV1); 3) los genes supresores de tumores lipocalina 2 (LCN2), dipeptidil peptidasa-4 (DPP-4), la proteína de unión al factor de crecimiento insulínico tipo 3 (IGFBP3), tiorredoxina interacción de proteínas (TXNIP) y Kruppel como factor de 4 (KLF4) fueron hasta reguladas en el CSC; 4) factores difusibles pertinentes en el mantenimiento de nicho de células madre tales como el factor de crecimiento epidérmico (EGF), proteína morfogenética ósea 4 (BMP4) y factor de crecimiento transformante beta 2 (TGFB2) también se expresaron de manera diferente en CSC y las células DU145. Digno de mención, 19 de los 22 genes que hemos identificado no fueron descritos anteriormente que se expresa de manera anormal en la próstata CSC. Estos datos confirman que las interacciones con el microambiente tienen un papel crucial en el control del fenotipo de CSC y sugieren un número limitado de genes cuya relevancia en la señalización CSC tendrá que ser investigado. Además, la mayoría de los 22 genes seleccionados podrían ser nuevos marcadores de próstata CSC.
(A) seleccionada 8 mejores funciones biológicas que se encuentran enriquecidos dentro del conjunto de las transcripciones moduladas en CSC con respecto al total de células DU145 mediante el análisis de microarrays. (B) Los 22 genes desregulados, según lo determinado por el IPA, se posicionan en los diseños subcelulares, y las relaciones están marcadas por flechas: flechas de líneas de trazos llenos y marcan las interacciones directas e indirectas, respectivamente. Los genes en rojo mostraron una mayor expresión en CSC, mientras que los genes en verde se redujeron reguladas. (C) las diferencias en la expresión génica se determinó por análisis de microarrays fueron confirmados por Q-PCR, la elección de 7 genes representativos entre los seleccionados 22. Los resultados se expresan como la relación entre cada gen diana y el control endógeno GAPDH. Expresión en CSC se comparó con lo que se observó en las células DU145 a la que se le asignó arbitrariamente un valor igual a 1. Los valores son medias ± SEM de 3 experimentos. *,
p Hotel & lt; 0,05 en relación con las células DU145
Validación de la expresión génica
Para confirmar las diferencias en la expresión de genes encontrados por el análisis de microarrays, Q-. PCR se realizó durante 7 genes expresados diferencialmente (CDH1, CYR61, DPP4, IGFBP3, ITGB6, LCN2, TGFB2). En todos los casos, las diferencias en los niveles de mRNA fueron confirmados (Figura 5C).
papel de la vía de E-cadherina en la diferenciación de CSC
Q-PCR análisis mostró que la expresión de ARNm de lipocalina 2 y e-cadherina seguido una tendencia similar en el CSC, células DU145 y en CSC crecido durante 20 días en medio que contenía FBS o en CM. En particular, los niveles de ARNm de ambos genes eran muy alta en CSC contenida en esferoides, se redujeron en los CSC cultivadas en CM y fueron significativamente más bajos y comparable en CSC cultivadas en FBS-medio y en las células DU145 (Figura 6). Esta tendencia era de acuerdo con la modulación de la expresión β-catenina observado previamente en las mismas condiciones de cultivo (Figura 4D). En conjunto, estos resultados indican que la vía de E-cadherina fue modulada durante la diferenciación CSC.
Q-PCR que muestra los cambios en los niveles de mRNA de lipocalina-2 y E-cadherina en las células DU145, CSC contenida en esferoides de control, y CSC cultiva durante 20 días en SBF-CM medio o de las células DU145. Los datos representan la media ± SEM de 3 experimentos individuales. Los asteriscos indican una diferencia significativa (*,
p Hotel & lt; 0,05).
Discusión
tumorigenicidad de próstata CSC
CD44
+ CD24
- células aisladas a partir de línea celular de carcinoma de próstata DU145 mediante marcadores de superficie celular fueron capaces de crecer esferoides como no adherentes en medio libre de suero suplementado con factores de crecimiento específicos. Como resultado de esferoides de división de células madre asimétricos fueron enriquecidos en células madre del cáncer (CSC), pero también se celebró un porcentaje de células diferenciadas se acercan a necrosis. Cabe señalar que CSC fueron capaces de someterse a la división asimétrica también
in vivo
porque después de la inyección en ratones, ambos se producen células diferenciadas que constituían la mayor parte del tumor y la auto-renovarse a sí mismos como se demuestra por la presencia de CD44
+ CD24
- células en todos los tumores extirpados
Una notable diferencia en la capacidad tumorigénico se demostró por la diferente incidencia y la latencia de tumores procedentes de esferoide CSC o la inyección de células DU145, con el primero. población de células siendo más tumorigénico. Sugerimos que el retraso en la formación de tumores después de la inyección de 5.000 células DU145 podría atribuirse al número insignificante de CSC que tuvo lugar en las células DU145 inyectados en comparación con la cantidad enriquecida de CSC contenida en cada esferoide. Estos resultados y esta sugerencia se ve confirmado por la inyección de 3 x 10
6 DU145 células, lo que llevó a cabo una mayor cantidad de CSC de 1 esferoide y los tumores generados en sólo 1 semana
.
Es importante destacar que la mayor