Extracto
Antecedentes
El objetivo de este estudio fue evaluar la función biológica en la progresión tumoral y la metástasis del proceso carcinoembrionario moléculas de adhesión celular relacionada con el antígeno (CEACAM) 1, 5 y 6 en el adenocarcinoma pancreático (PDAC).
Diseño Experimental
CEACAM derribar las células fueron establecidos y evaluados in vitro y en un modelo de xenoinjerto de ratón subcutánea e intraperitoneal. expresión de tejidos y suero de pacientes con PDAC se evaluaron por inmunohistoquímica (IHC) y por la enzima ensayos de inmunoabsorción ligados.
Resultados
presencia de metástasis de los ganglios linfáticos se correlacionó con CEACAM 5 y 6 expresión (determinado por IHC) y la recurrencia tumoral en exclusiva con CEACAM 6. Los pacientes con CEACAM 5 y 6 expresión mostró un sistema operativo reducido significativamente en los análisis de Kaplan-Meier de supervivencia. Los valores séricos elevados CEACAM6 mostraron una correlación con metástasis a distancia y. El análisis de supervivencia reveló una supervivencia prolongada en los pacientes con CEACAM 1 valores séricos bajos. En capacidad de proliferación y migración in vitro se incrementaron en CEACAM derribar células PDAC, sin embargo, los ratones inoculados con CEACAM derribar las células mostraron una supervivencia global prolongada (OS). El número de metástasis pulmonar espontánea se incrementó en el grupo de tumbar CEACAM.
Conclusión
Los efectos mediados por la expresión CEACAM en PDAC son complejas, aunque la sobreexpresión se correlaciona con el crecimiento tumoral agresivo loco-regional . Sin embargo, la pérdida de CEACAM puede ser considerado como una parte de la transición epitelial-mesenquimal y es por lo tanto de más importancia en el proceso de metástasis a distancia
Visto:. Gebauer F, Wicklein D, Horst J, Sundermann P, Maar H, Streichert T, et al. (2014) Cell relacionada con el antígeno carcinoembrionario moléculas de adhesión (CEACAM) 1, 5 y 6 como biomarcadores en cáncer de páncreas. PLoS ONE 9 (11): e113023. doi: 10.1371 /journal.pone.0113023
Editor: Aamir Ahmad, Escuela de Medicina de la Universidad Estatal de Wayne, Estados Unidos de América
Recibido: 22 Julio, 2014; Aceptado: 20 Octubre 2014; Publicado: 19 Noviembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Gebauer y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
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Financiación:.. Los autores no tienen ningún soporte o financiación reportar
Conflicto de intereses:. Los autores declaran que no existen intereses en competencia
Introducción
En los últimos años, el pronóstico de los pacientes que sufren un adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) no ha mejorado significativamente [1], [2]. La mayoría de los pacientes se presentan con etapas avanzadas del tumor que hacen imposible un tratamiento curativo. La resección quirúrgica completa, seguida de quimioterapia adyuvante es hoy en día el estándar de oro en la terapia del PDAC. Sin embargo, incluso en los pacientes después de la resección quirúrgica del tumor completa, la supervivencia global sigue siendo pobre, con una mediana de supervivencia de 20-24 meses [3] - [5]. el crecimiento del tumor loco-regional agresivo además de metástasis a distancia y peritoneal temprana y un alto grado de quimiorresistencia hacer PDAC uno de los tumores gastrointestinales más letales [6].
Hoy en día, ni suero fiable ni marcadores de tejido predicción de la clínica evolución de los pacientes después del diagnóstico de PDAC están disponibles. Por otra parte, las interacciones moleculares del tumor con el anfitrión y los factores locales que permiten PDAC para mostrar una progresión tan agresiva son poco conocidos. Por lo tanto, hay una necesidad imperiosa de un mejor entendimiento de la biología del tumor con respecto a los mecanismos de invasión local del tumor y la recurrencia.
Carcioembryonic moléculas de adhesión celular relacionada con el antígeno (CEACAMs) son miembros de la glicosilfosfatidilinositol (GPI ) inmunoglobulina -vinculada (Ig) superfamilia [7]. Hay más de 17 genes que pertenecen a esta familia, con sus productos de genes integrados principalmente en la membrana celular. Dentro de la familia CEACAM los subtipos CEACAM son estructuralmente similares y expresada fisiológicamente en la superficie apical de numerosos tipos de células, por ejemplo, células endoteliales y hematopoyéticas, así como células epiteliales de diferentes órganos. Dependiendo del tipo de célula y el subtipo CEACAM, el efecto de transmisión después de la unión de un cierto pareja varía, incluyendo la regulación de la adhesión celular, la supresión de tumores, la angiogénesis, la activación de leucocitos y otras células inmuno-reactiva, y la regulación del ciclo celular [8] - [11]. El gen CEACAM 5, su producto, también conocida como códigos CD66e para el antígeno carcioembryonic (CEA) y se ha convertido en uno de los miembros más conocidos de la Ig superfamilia ya que tiene un papel importante en la rutina clínica como marcador tumoral para varios entidades de tumores incluyendo tumores malignos gastrointestinales y respiratorias [12]. Sin embargo, debido a la falta de sensibilidad y especificidad su valor predictivo por sí sola es todavía poco satisfactoria [13] - [16]. Los subtipos CEACAM 1 y 6 se describen a ser insuficiente o sobreexpresado en varias entidades tumorales como el cáncer de pulmón, cáncer de colon y melanoma [17] - [23]. Aunque la sobreexpresión es un hecho probado, incluso algunos estudios reportan una disminución en la expresión de ciertas entidades tumorales en etapas diferentes de tumores.
Curiosamente, los estudios recientes han encontrado CEACAM 1 y 6 de expresión en PDAC primaria correlacionado con una supervivencia global del paciente acortada [24 ], [25]. Los principios biológicos por qué la expresión CEACAM medie la progresión del tumor no se entienden completamente. Por lo tanto, se analizaron los efectos de CEACAM 1, 5 y 6 in vitro y establecimos un modelo de ratón con xenoinjerto para investigar el papel funcional de la expresión CEACAM en PDAC. Para evaluar si la expresión de CEACAM tiene un impacto en la progresión del tumor en pacientes, se combinaron suero y el análisis inmunohistoquímico para moléculas CEACAM 1, 5 y 6 para analizar si existe una correlación de la expresión CECACM con los datos clínico-pathologcial de pacientes con PDAC.
material y Métodos
línea celular y CEACAM derriban
La línea celular de adenocarcinoma pancreático humano Paca 5061 se estableció a partir de un tumor primario. características detalladas de establecimiento y cultivo de la línea celular se han descrito anteriormente [26]. Brevemente, se obtuvieron células de un paciente con un PDAC que se sometieron a resección quirúrgica en el Departamento de General, visceral y Cirugía Torácica de la Universidad del Centro Médico de Hamburgo-Eppendorf. La clasificación final del tumor según la UICC 7
ª ed. reveló una pT3, N1, L1, V1, R0, G2 PDAC de la cabeza del páncreas.
CEACAM tumbar variantes fueron llevados a cabo por la interferencia shRNA como se describe anteriormente [27]. Los oligonucleótidos fueron clonados en un vector Psiren-RetroQ y transfectadas por agentes de transfección Fugene (Roche Diagnostics, Hilden, Alemania) con las células tumorales. La selección de derribar los clones se realizó mediante la expresión de una quimio-resistencia puromicina (Clontech, Saint-Germain-en-Laye, Francia) y citómetro de flujo (FACS-LSR Fortessa, BD Bioscience, San José, EE.UU.). Sólo las células con derribo de & gt; 90%, como se determinó por citometría de flujo, se utilizaron para la in vitro e in vivo. Se detectaron anticuerpos no conjugados contra CEACAM 1, 5 y 6 y el ratón biotinilado correspondiente IgM o IgM de rata de control de isotipo (Dako, Glostrup, Dinamarca) con anticuerpo de cabra anti-Ig de ratón-APC (BD Biosciences). Las células fueron analizadas utilizando un citómetro de CyFlow (Partek, Münster, Alemania) con una adición posterior de AlexaFluor488 estreptavidina conjugada (Invitrogen) antes de la tinción.
vitro caracterización de CEACAM derribar células
En La proliferación celular se evaluó usando el ensayo de XTT colorimétrico (Roche Diagnostics, Basilea, Suiza) según las instrucciones del fabricante. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a 3000 células /pocillo. Después de 48 h para permitir la adherencia de las células, las células se incubaron con sustratos colorimétricos. cambios colorimétricos se midieron en un espectrofotómetro de múltiples pocillos (MR5000 Multiplate Reader, Dynatech, Denkendorf, Alemania).
Las diferencias en la migración celular se evaluó mediante FluoroBlok Migración de ensayo (BD Bioscience, San José, EE.UU.) con 24 así 8 micras de poro insertos de tamaño. Las células se tripsinizaron y se re-suspendieron en RPMI1640 libre de suero (Invitrogen, Darmstadt, Alemania) en una concentración de 300.000 células /ml. 400 l de suspensión celular se añadió a la cámara apical y RPMI1640 800 l con se añadió a la cámara inferior de suero de ternera fetal 10% (FCS, Invitrogen). El ensayo se incubó durante 24 h en condiciones estándar de cultivo celular.
Después de la eliminación del atrayente quimioterapia de la cámara inferior, la visualización de células migradas se realizó mediante la adición de 500 l bien de tampón /HBSS con calceína AM (Invitrogen) 4 mg /ml en el fondo del pozo y de la incubación durante 1 h. Lectura se realizó a 494/517 nm (Ex /Em) sobre un fondo de lectura de fluorescencia lector de placas Genios (Tecan, Männedorf, Swizerland).
experimentos de flujo laminar se realizaron utilizando micro-portaobjetos ibidi VI (ibidi, Munich, Alemania) conectado a una bomba de jeringa (modelo 100 Series; kdScientific, Holliston, MA) y el movimiento de células se observaron con un microscopio invertido (Zeiss, Jena, Alemania; Axiovert 200). Las células tumorales se suspenden en medio de cultivo celular (20 ml, 200 000 células /ml) y micro-portaobjetos se recubrieron con células pulmonares humanas endoteliales microvasculares (HPMEC) (PromoCell, Heidelberg, Alemania). HPMEC se suspendieron en medio de cultivo celular, se siembran en micro-portaobjetos a una concentración de 5 × 10
5 células /ml y 20 l de medio con las células se pipeteó en cada canal de flujo. Cell creció confluentes durante la noche en condiciones estándar. velocidades de cizallamiento aplicadas variaron de 0,05 dyn /cm
2 a 10,0 dyn /cm
2. movimiento de las células fue grabada y analizada en cuanto a la calidad del movimiento (adherencia, laminación y tethering) y la velocidad de rodadura mediante el programa CapImage 8,5 (Dr. Heinrich Zeintl, Heidelberg, Alemania).
Los experimentos con animales
los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices UKCCR para el bienestar de los animales en la neoplasia experimental [28], los locales comité de ética para los experimentos con animales (Behörde für Soziales, Familie, Gesundheit, Verbraucherschutz; Amt für Gesundheit und Verbraucherschutz;. Billstr 80 , D-20539 Hamburgo, Alemania, proyecto Nº G58 /09) y así el encargado del bienestar animal institucional de la Universidad de Medicina-Centro recomendaron y aprobaron el estudio.
En el modelo de tumor subcutáneo, un millón de Paca se inyectaron células tumorales 5061 en la región de la escápula derecha en 8-12 semanas de edad C57BL /6N PFP
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- /- ratones knock-out. Los animales fueron sacrificados cuando los tumores primarios en exceso de 2 cm
3 o ulceradas de la piel de ratones, los ratones fueron sacrificados y terminales narcotizado por cardiocentesis.
Para la evaluación de la influencia de la expresión CEACAM de diseminación peritoneal, se estableció un modelo intraperiteoneal tumor como se describe anteriormente [29]. Brevemente, se inyectaron un millón de células tumorales en el cuadrante abdominal inferior izquierda por vía intraperitoneal en el volumen de suspensión de 200 mL. Evaluación y hora puntos de terminación del experimento se llevó a cabo de acuerdo con un sistema de puntuación previamente establecido. La evaluación de la extensión de crecimiento del tumor intraperitoneal se hizo con un índice modificado peritoneal carcinomatosis (PCI) como se describe anteriormente [30]. En pocas palabras, la cavidad peritoneal está dividido en 9 regiones abdomino-pélvica, dependiendo de la medida del crecimiento del tumor, se asignan puntuaciones entre 0 y 3 puntos (0 puntos: no hay tumor presente; 1 punto: tumor de & lt; 1 mm
3 ; 2 puntos: tumores & gt; 1 y & lt; 3 mm
3; 3 puntos: tumor & gt; 3 mm
3) que conducen a una puntuación PCI de 0 a 27.
la cuantificación de metástasis pulmonar, células tumorales diseminadas (DTC) y CTC por Alu-PCR
Los pulmones izquierdos fueron homogeneizados en un disruptor de la muestra (TissueLyser II, Qiagen, Hilden, Alemania) y se sometieron a ADN de aislamiento (QIAamp DNA Mini Kit, Qiagen). La médula ósea se recoge por lavado del fémur izquierdo con 1 ml de NaCl 0,9%. 200 l de sangre y las suspensiones de médula ósea fueron sometidos a ADN aislamiento usando el QIAamp DNA Blood Mini Kit.
concentraciones de ADN de todas las muestras se cuantificaron utilizando un espectrofotómetro NanoDrop (Peqlab, Erlangen, Alemania). Como el contenido de detectables Alu-secuencias en el siguiente qPCR habría sido afectada simplemente variando ADN concentraciones, todas las muestras de médula de ADN-Lung-óseos y se normalizaron a 30 ng /l usando tampón AE (Qiagen). Las concentraciones de sangre-DNA eran bastante similares en todas las muestras (aprox. 10 ng /l) y por lo tanto no eran normalizado. qPCR se realizó con establecidos Alu-cebadores específicos de humanos [31]. 2 l ADN total (es decir, 60 ng de pulmón /médula ósea-DNA; 20 ng sangre-DNA) se utilizaron para cada qPCR. Los datos numéricos se determinaron frente a una curva estándar como se describe [32]. Se determinó el límite de detección de señales específicas Alu-secuencia humana para cada tipo de tejido mediante pruebas de ADN a partir de cinco sana (no inyectada) PFP
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- /- ratones de sexo y edad similar. Para cada muestra, los análisis se realizaron en los duplicados y los experimentos independientes por lo menos dos veces.
Pacientes y procedimientos quirúrgicos
Entre 1992 y 2009, todos los pacientes que se sometieron a cirugía mayor de páncreas reseccional en el Departamento de en general, visceral y Cirugía Torácica en el Centro Médico Universitario de Hamburgo-Eppendorf se incluyeron en una base de datos prospectiva, de páncreas. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Cámara de Médicos en Hamburgo, Alemania. consentimiento por escrito para el uso de las muestras con fines de investigación se obtuvo de todos los pacientes antes de la cirugía o la extracción de sangre.
Los pacientes con PDAC de la región de la cabeza de páncreas rutinariamente fueron sometidos a duodenopancreatectomía parcial (PD) o duodenopancreatectomía conservadora del píloro (PPDP ) y los métodos de resección preservación de órganos en los casos de pancreatitis crónica (PC). Sólo los pacientes con resección completa del tumor macroscópico se incluyeron en el análisis final. La mortalidad hospitalaria se definió como la muerte en cualquier momento durante todo el período de hospitalización. La información de seguimiento se obtuvo de consulta externa de nuestra institución, en las oficinas de los médicos generales apropiadas ', o desde el registro regional del cáncer. Cuando la fecha de la muerte no se registró, los pacientes fueron censurados en el último contacto grabado.
Tejido micro gama de construcción y immounohistochemistry
núcleos de tejido se obtuvieron a partir fijado en formol e incluido en parafina (FFPE) bloques de tejido de pacientes con PDAC por anatomía patológica. Se seleccionaron áreas representativas de tumor basado en la tinción con hematoxilina-eosina se realizó
TMA construcción como se describe anteriormente [33] - [35].. Brevemente, 252 cilindros de tejido con un diámetro de 0,6 mm se perforaron a partir de los "donantes" bloques de tejido utilizando un instrumento de precisión semiautomático robótico a medida y se colocaron en un bloque de parafina que contenía los 252 muestras individuales. Dentro de estas muestras, había 142 PDAC, tumores pancreáticos neuroendocrinos 40 (NET), 33 neoplasia papilar mucinosa intraductal (TPMI), y 37 muestras de tejido sano como un control negativo. Los bloques de TMA resultantes se utilizaron para producir secciones de 4 micras que fueron transferidos a un sistema deslizante recubierto con adhesivo (Instrumedics Inc., Hackensack, Nueva Jersey, EE.UU.).
Los protocolos de tinción inmunohistoquímica fueron optimizados en varios benigna y los tejidos malignos en un extenso procedimiento de múltiples etapas que modificó el protocolo de tinción hasta que la tinción selectiva requerida se logró con la posible señal de fondo más bajo (de acuerdo con [36]).
las secciones se desparafinaron y se secaron durante la noche a 37 ° C . La recuperación del antígeno se llevó a cabo por microondas tratamiento horno en tampón de citrato (pH 6,0) durante 1 min, las secciones fueron entonces rehidratada en solución salina tamponada con Tris (TBS; M Tris-HCl 0,05 a pH 7,6 y 0,15 M NaCl) y se bloquearon con suero de conejo AB (Biotest Diagnostics, Dreirach, Alemania) diluida 1:10 en TBS durante 60 minutos. CEACAM tinción se realizó usando un anticuerpo monoclonal específico CEACAM (CEACAM1 clon 4D1 /C2 IgG2a, en la casa clone (previamente descrito por [37]) a una dilución de 1:200, CEACAM5 clon#2383 IgG1 a una dilución de 1:50 (Señalización celular, Beverly, EE.UU.); CEACAM6 IgG1 clon (9A6), a una dilución de 1:40 [Sigma Aldrich, Hamburgo, Alemania]) durante la noche a 4 ° C. Biotinilado policlonal de conejo secundaria de anticuerpos anti-ratón (Dako, Hamburgo, Alemania) se utilizaron para la unión del anticuerpo primario CEACAM. transistion marcadores (EMT) epitelio-mesénquima eran estudios de inmunohistoquímica también. ZEB 1 (IgG a una dilución de 1:100, policlonal de conejo anti-humano, Atlas anticuerpos, Estocolmo, Suecia), ZEB 2 (IgG a una dilución de 1:100, policlonal de conejo anti-humano, Atlas anticuerpos, Estocolmo, Suecia ), E-cadherina (), pan-citoqueratina ().
los sitios de unión fueron detectados utilizando el ABC-AP-kit (Vector Laboratories Inc., Burlingame, EE.UU.). La actividad fosfatasa alcalina de un complejo biotina-estreptavidina fosfatasa alcalina se visualizó utilizando naftol-AS bisfosfato como sustrato y New hexatozised fucsina se utilizó para el acoplamiento simultáneo. Las secciones se contratiñeron con hemalum de Mayer (Merck, Darmstadt, Alemania).
La intensidad de la tinción (0, 1+, 2+, 3+) y la fracción de células tumorales positivas se anotó para cada punto del tejido como recientemente publicado [34]. Spots sin manchar y con una intensidad de tinción de 1+ en & lt; 70% y 2+ en & lt; 30% de las células tumorales se anotó como CEACAM baja, se les dio las puntuaciones medias para una intensidad de la tinción de 1+ en ≥70%, 2 + en ≥30% o 3+ en & lt; 30% de las células tumorales, y las puntuaciones altas se les dio para una intensidad de tinción de 2+ en ≥70% o 3+ en ≥30% de las células tumorales. El análisis inmunohistoquímico de las secciones se llevó a cabo sin el conocimiento de la identidad de los pacientes o el estado clínico. El análisis inmunohistoquímico y puntuación fueron realizadas por dos investigadores independientes que no tenían conocimiento de la evolución del paciente u otros hallazgos clínicos. En el 95% de las muestras, las evaluaciones de los dos observadores eran idénticos, se volvieron a evaluar las diapositivas restantes, y se tomaron las decisiones de consenso.
El protocolo de tinción fue también utilizado para ratones que crecen los tumores y mostraron similares sensibilidad y especificidad en comparación con la tinción TMA.
ligado a enzimas (ELISA)
para la cuantificación subtipos CEACAM en sangre periférica, las muestras de suero de 46 pacientes caucásicos con PDAC y 47 pacientes caucásicos con CP , que se indica para el tratamiento quirúrgico, se analizaron con un inmunoensayo ligado de enzima (ELISA). Todas las muestras de sangre se obtuvieron directamente antes de la cirugía. Como controles sanos, 50 donantes de bancos de sangre de raza blanca, obtenidos del Instituto de medicina de transfusión (Centro Médico Universitario de Hamburgo-Eppendorf), se incluyeron en el estudio. Preparación de las muestras de suero se llevaron a cabo de acuerdo con un protocolo estandarizado [38]. La mediana de edad fue de 62,4 años en el momento del diagnóstico (rango 36.3-90.4 años, 24 varones [52,2%], 21 mujeres [47,8%]). Los valores séricos de 47 pacientes que se sometieron a cirugía debido a la pancreatitis crónica (mediana de edad al momento del diagnóstico de 47,0 años, rango de 31.1-76.1 años) y 50 muestras de donantes de sangre sanos se utilizaron como controles (25 varones [50%], 25 mujeres [ ,,,0],50%]).
Para la detección de CEACAM 1 y CEACAM 5 en el suero, de 96 pocillos placas de microtitulación flexibles (Costar 9019, EE.UU.) se recubrieron con 50 l por pocillo de 2 mg /ml de anticuerpos monoclonales ratón de anticuerpos de captura (clon 283324 y 843130, IgG1 de ratón, R & amp; D Systems, USA) durante la noche a 4 ° C. Los pocillos se bloquearon con 3% w /v albúmina de suero bovino (BSA; Fracción V, 98% de pureza, Sigma Aldrich, Alemania) en PBS /T (solución salina tamponada con fosfato, pH 7,3, que contiene 0,05% v /v Tween) durante 45 min a temperatura ambiente y después se incubaron durante 1 h con suero humano diluido 1:50 en PBS a temperatura ambiente. Después de cinco lavados con PBS /T, se detectó proteína unida con 1 o 5 de biotina conjugada con anticuerpo policlonal-CEACAM contra (CEACAM 1 IgG de cabra, clon 842284; CEACAM 5 ovejas IgG, clon 843131Goat IgG, R & amp; D Systems, USA), respectivamente, seguido por la peroxidasa conjugada con estreptavidina utilizando TMB (3,3 ', 5,5 "-tetramethylbenzidine) como sustrato. La reacción de color se detuvo por adición de 10 mM H
2SO
4 y se analizaron a 450 nm usando un lector de ELISA (Dynatech MR 5000, EE.UU.). CEACAM humana recombinante 1 y 5 proteínas (R & amp; D Systems) sirvieron como patrón interno para el ensayo
CEACAM 6 se determinó mediante un ELISA directo revestimiento de suero del paciente 50 l en una dilución 1:50 durante la noche a. 4 ° C en la placa de 96 pocillos. Los pocillos se bloquearon con 3% de albúmina de suero bovino (BSA; Fracción V, 98% de pureza, Sigma Aldrich) en PBS /T (solución salina tamponada con fosfato, pH 7,3, que contiene 0,05% v /v Tween) durante 45 minutos a temperatura ambiente y luego se incubaron durante 1 h con el anticuerpo de detección anti-CEACAM 6 (IgG1 de ratón, clon 843 158, R & amp; D Systems). La reacción de color se detuvo por adición de 10 mM H
2SO
4 y se analizó a 450 nm. Para asegurarse de que el inmunoensayo era adecuado para medir muestras clínicas de suero, se examinaron reproducibilidad y linealidad (de acuerdo con [39]).
El análisis estadístico
Para el análisis estadístico de exploración de los grupos de pacientes individuales, se utilizó ya sea una prueba de chi-cuadrado de dos caras o una prueba exacta de Fisher. Las variables cuantitativas se pusieron a prueba, ya sea por medio del Estudiante
t-test
o medianas de la prueba de Wilcoxon. Prueba para la distribución normal de las variables cuantitativas se realizó mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov-Test. Se utilizó el análisis de Kaplan-Meier (log-rank test) de la enfermedad y el análisis de libre-la supervivencia global excluyendo la mortalidad hospitalaria. Todas las variables que alcanzaron un valor de p ≤0.05 se incluyeron en un modelo de regresión de Cox multivariado. El nivel de corte de la cuantificación CEACAM suero se determinó mediante el uso de la Youden-índice y como se describe anteriormente [33], [40].
Resultados
in vitro características de CEACAM derriban PDAC células
Como se analizó mediante citometría de flujo, la expresión basal CEACAM estaba presente en las células tumorales. los niveles de superficie de los subtipos CEACAM 1, 5 y 6 se redujeron a & lt; 5% en comparación con la expresión en células de control CEACAM (Figura 1A). La proliferación y migración aumentaron en las células derribar CEACAM en comparación con las células de control (Figura 1B y C), pero CEACAM caída no afectan a la adhesión en el endotelio estimulada (HPMEC) (Figura 1D y E).
( UN). La expresión basal CEACAM variarse dependiendo del subtipo de CEACAM, se encontraron niveles más altos de CEACAM 1, intermedio para CEACAM 6 y los niveles más bajos de CEACAM 5. Como se ve en la proliferación (B) y los ensayos de migración (C), CEACAM derribar células mostraron un mayor proliferativa y potencial migrative en comparación con las células control. Las diferencias en la adhesión sobre las células endoteliales estimuladas (TNFa) no eran detectables entre kd CEACAM y células de control. Ni el número medio (D), ni el tiempo medio de adhesión a las células endoteliales fue diferente (E). xenoinjertos de tumores murinos fueron altamente positivos para CEACAM 1, 5 y 6. La tinción inmunohistoquímica en las células de control mostraron ausencia completa de expresión en CEACAM inmunohistoquímica en derribar las células (F).
Para el control de la presencia de la CEACAM derribar en los tumores murinos crecido, se realizó tinción IHC de CEACAM 1, 5 y 6 y, como se muestra en la Figura 1F, los niveles de derribar eran estables y todavía presente en los tumores que crecen en los ratones.
modelo de xenoinjerto para el análisis funcional de CEACAMs en PDAC
para responder a la pregunta de si los miembros de la familia CEACAM tienen un efecto funcional en la formación de tumores, el crecimiento y la metástasis, un experimento de xenoinjertos de tumores humanos con células PDAC (con y sin CEACAM desmontables ) en la PFP
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- se llevó a cabo ratones. Después de la inyección de células tumorales subcutánea, los ratones inoculados con CEACAM derriban las células mostraron una supervivencia global significativamente prolongado hasta alcanzar los criterios de terminación (mediana de supervivencia 144 d) si se compara con Paca 5061 de control (mediana de supervivencia 104 d; p = 0,014) y de tipo salvaje PACA 5061 (mediana de supervivencia 79 d; P = 0,01) (Figura 2A). El tamaño del tumor y el peso en el momento de la muerte no difirieron significativamente entre los grupos (datos no presentados).
intraperitoneal, no se observaron diferencias en el índice de carcinomatosis peritoneal (ICP) en el momento de la escarificación (80 días después de inyección). CEACAM derribar mostró más copias de ADN de ADN humano en el pulmón izquierdo (P = 0,021) (C) que se correlaciona con una carga metastásica mayor en el pulmón, sin embargo, no se observó ninguna diferencia para las células tumorales circulantes en la sangre (D) .
Mientras que el modelo de xenoinjerto subcutáneo mostró una supervivencia prolongada de los ratones con CEACAM caída, la influencia de la CEACAM tumbar en el modelo de xenoinjerto por vía intraperitoneal no estaba presente. El índice de carcinomatosis peritoneal no fue diferente entre los grupos, que también estuvo representada en las diferencias que faltan en la difusión ya que no hubo diferencias entre el CEACAM derriban y el grupo de control en las células tumorales circulantes en sangre periférica (Figura 2B y D). Sin embargo, en el CEACAM tumbar grupo, encontramos mayores cantidades de ADN humano (que significa significativamente más células PDAC) en los pulmones en comparación con el grupo control (Figura 2C). células PDAC no mostraron afinidad para la difusión a la médula ósea, no se detectó ADN de la célula de tumor humano en cualquiera de los grupos. Marcadores de EMT no mostraron diferencias significativas entre el tipo salvaje y CEACAM derriban los tumores como se determina mediante técnicas de inmunohistoquímica (Figura S1).
inmunohistoquímica CEACAM 1, 5 y 6 de expresión en los pacientes muestras
Fuera de los 142 puntos tumorales, 5 (3,5%) muestra no fueron evaluables en el TMA debido a tejido tumoral que falta o no representativos. Las muestras de tejido de 137 pacientes fueron evaluables por fin y se correlacionó con los datos clínico-patológica. Los pacientes tenían entre 33.1-85.0 años (media 63,5 años). Había 82 pacientes varones (59,9%) y 55 mujeres (40,1%).
CEACAM 1 expresión se encontró en el 62,8% de todas las muestras de tumor (n = 86), CEACAM 5 en 87 pacientes (63,5%) , se observó CEACAM 6 expresión en 99 pacientes (72,3%). La mayoría de los tumores mostró una tinción homogénea dentro de cada muestra, aunque en una minoría de las muestras de tumor, se observó un patrón de tinción IHC no homogénea dentro de la zona del tumor. El patrón de expresión de los tres CEACAMs era membranosa y citoplasmática, así (Figura 3). Expresión de CEACAM 5 se asoció con la presencia de CEACAM 6 expresión (P & lt; 0,001). Una correlación entre CEACAM 1 y 5 CEACAM expresión (P = 0,113) o CEACAM 6 no se observó (p = 0,09).
Una correlación con los datos clínico-patológica reveló una asociación significativa con cualquier parámetro para CEACAM 1 excepto una correlación con metástasis a distancia (P = 0,008). CEACAM 5 y 6 expresión se correlacionó con un estado de los ganglios linfáticos positivos (p = 0,017 y P = 0,046, respectivamente) y metástasis a distancia (P & lt; 0,001). (Tabla 1)
El de Kaplan-Meier análisis de supervivencia no mostró correlación entre la expresión CEACAM 1 y el global (SG) o la supervivencia libre de enfermedad (DFS), respectivamente. Los pacientes con un CEACAM positiva 5 y /o 6 expresión tenían un OS acortado y DFS (P = 0,025 y P = 0,007, P = 0,010 y P = 0,030, respectivamente) (Figura 4A-C, Tabla 2). En los pacientes con expresión positiva para las tres proteínas CEACAM se observó ninguna diferencia significativa en la SSE o SG en comparación con aquellos pacientes que fueron negativos para todos los subtipos CEACAM (P = 0,144 y P = 0,742, datos no mostrados).
(C.A). CEACAM 1 en pacientes positivos mostró una mediana de SG de 17,0 meses (14.0-20.1 meses), 1 CEACAM negativos 23.0 meses (9.5-36.5 meses, P = .279). OS de CEACAM 5 pacientes positivos fue de 16,0 meses (12.8-19.2 meses) frente a 22,0 meses (4.1-47.9 meses) (p = 0,025). CEACAM 6 pacientes positivos mostró una SG de 14,0 meses (7.9-20.0) vs. 22,0 meses (5.6-38.4 meses, P = .010). Las curvas de supervivencia para la correlación entre la supervivencia global y la expresión de suero CEACAM (D-F). CEACAM 1 en pacientes positivos mostró una SG de 11,8 meses (2.4-25.2) vs. 18,3 meses (10.0-26.2 meses, P = .022). La mediana de SG para los pacientes positivos para CEACAM 5 fue de 15,7 meses (2.4-32.3 meses) frente a 18,6 meses (8.7-28.6 meses, P = 0,651), y la mediana de SG en pacientes con CEACAM 6 positividad fue de 18,8 meses (9.5-28.1 meses ) vs. 12,8 meses (3.3-22.3 meses, P = .187). Diagramas de caja para CEACAM 1 de expresión en suero (G), CEACAM 5 (H) y CEACAM 6 (I) compararon adenocarcinoma pancreático ductal (PDAC), pancreática crónica (CP) y los donantes de sangre sanos (BD). curva de funcionamiento del receptor (ROC) para la expresión de suero CEACAM (J).
CEACAM 1, 5 y 6 en
sérica
1 CEACAM valores en PDAC no eran elevados en comparación con pacientes con parálisis cerebral, pero fueron más altos en comparación con BD (PDAC mediana de 33,0 mg /l, rango de 3,3 a 136,7 g /l; CP mediana de 23,1 mg /l, rango de 1,8 a 110,1; BD mediana de 16,1 mg /l, rango de 7,8 a 36,5 mg /l; P = 0,059 y P & lt; 0,001, respectivamente). Se encontraron resultados similares para CEACAM 5: Los valores de suero fueron superiores en el grupo de PDAC comparación con BD, pero no para CP (PDAC mediana 8,5 g /l, rango de 0,7 a 75,2 ng /ml; CP mediana 4,8 g /l, rango de 0,7- 24,0; BD mediana 1,9 g /l, rango de 0,2 a 9,2 g /l; p = 0,122 y P = 0,002, respectivamente). Los pacientes con PDAC mostraron expresión sérica elevada CEACAM 6 en comparación tanto, CP y BD (PDAC mediana de 2,90 mg /l, rango de 1,34 a 5,46 mg /l; CP mediana de 2,25 mg /l, rango de 0,77 a 5,15; BD mediana de 2,34 mg /l , rango de 1,25 a 6,99 g /l; p = 0,06 y P = 0,029, respectivamente). En ninguno de los análisis realizados, una diferencia significativa entre el CP y BD era detectable (Figura 2G-I).
se realizaron curvas se utilizaron para establecer la relación sensibilidad-especificidad para CEACAM 1, 5 y 6. los valores óptimos de corte se determinaron mediante el cálculo Youdens-Index. El área bajo la curva (AUC) para CEACAM 1 era 0,711 (valor de corte 184,1 g /l), por CEACAM 5 0,689 (valor de corte 1,95 g /l) y para CEACAM 6 0.664 (punto de corte valor 3,58 g /l) (Figura 2J) La sensibilidad de CEACAM 1 en la detección de PDAC fue 53,5% con una especificidad de 54,7% correspondiente. Para CEACAM 5, la sensibilidad es 79,1% con una especificidad del 44,2%. La sensibilidad de CEACAM 6 era 47,0% con una especificidad del 82,6%. El AUC para una combinación de los tres CEACAMs no mostró mejoría en comparación con la determinación de cada uno de los solos CEACAMs (AUC 0,680, los datos no presentados).
Para una correlación entre los valores séricos CEACAM con los datos clínico-patológicas, los valores séricos fueron divididos en un nivel bajo (& lt; 75
percentil) y un grupo de alto nivel (≥75
percentil). Alta CEACAM 6 valores con presencia de metástasis a distancia (P = 0,009) y la clasificación (P = 0,019) (Tabla 1).