Extracto
Uno de los desafíos en el tratamiento de pacientes con cáncer colorrectal es que estos tumores muestran resistencia a la radiación. Los microARN (miRNA) participan en actividades biológicas esenciales, incluyendo la quimio-resistencia y radioresistance. Varios estudios han indicado que los miARN jugó un papel importante en la sensibilización de la respuesta celular a la radiación (IR) ionizante. En este estudio, encontramos que el miR-124 fue significativamente las reguladas tanto en líneas celulares derivadas de CRC y CRC muestras clínicas en comparación con los tejidos colorrectales no tumorales adyacentes, miR-124 podría sensibilizar a las células de cáncer colorrectal humano a la IR
In Opiniones y vitro
in vivo
. Se identificaron PRRX1, un nuevo inductor de EMT y el regulador stemness como objetivo directo novela de miR-124 mediante el uso de algoritmos de predicción de destino y ensayo de luciferasa. PRRX1 caída podría sensibilizar a las células CRC a IR similar a los efectos causados por el miR-124. La sobreexpresión de PRRX1 en líneas celulares-miR-124 sobreexpresados forma estable podría rescatar a los efectos del mejoramiento radiosensibilidad interpuesto por el miR-124. Teniendo en cuenta estas observaciones, hemos ilustrado que el miR-124 podría aumentar la radiosensibilidad de las células CRC mediante el bloqueo de la expresión de PRRX1, lo que indica el miR-124 podría actuar como una gran diana terapéutica para pacientes con CRC
Cita.: Zhang Y, Zheng L, Huang J, Gao F, Lin X, Él L, et al. (2014) células de cáncer colorrectal miR-124 Radiosensitizes humano por la orientación PRRX1. PLoS ONE 9 (4): e93917. doi: 10.1371 /journal.pone.0093917
Editor: Alfons Navarro, Universidad de Barcelona, España |
Recibido: 3 Enero, 2014; Aceptado: 11 de marzo de 2014; Publicado: 4 Abril 2014
Derechos de Autor © 2014 Zhang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencia Natural de China (subvención Nº 81272507). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es la tercera causa principal de muerte por cáncer [1]. los casos de CCR son tratados a través de la resección quirúrgica ya que es la única técnica curativa que está disponible hasta la fecha. Sin embargo, el cáncer colorrectal se asocia con una elevada mortalidad ya que aproximadamente el 30% de los pacientes son diagnosticados cuando este cáncer se ha alcanzado una etapa avanzada. Estos pacientes albergan una enfermedad localmente avanzado, no resecable, no metastásico que se denomina como "el cáncer colorrectal localmente avanzado." Estos pacientes recibieron quimiorradioterapia. Sin embargo, debido a la capacidad inherente de cáncer colorrectal para convertirse en quimioresistente y resistente a la radiación (RR), la terapia de modalidad combinada no ha logrado mejorar los resultados universalmente. Es difícil tratar a pacientes con cáncer colorrectal localmente avanzado debido a que estas células de cáncer muestran resistencia a la terapia de radiación. Esta es una de las cuestiones más difíciles en el tratamiento del cáncer colorrectal. Por lo tanto, tenemos que dilucidar los mecanismos moleculares que subyacen sensibilidad a la radiación o la resistencia, ya que en última instancia nos ayude a mejorar los resultados terapéuticos.
Estudios previos han confirmado una asociación entre radioresistance y la expresión de los genes que inducen el puesto de control de daños en el ADN la respuesta y la capacidad de reparación del ADN aumento [2] - [4]. Aunque estos descubrimientos han mejorado la comprensión de los mecanismos moleculares que influyen en la radiosensibilidad celular, los mecanismos detallados por el cual se regula este proceso no se conoce hasta la fecha.
Los microARN (miRNA) son una clase de pequeños (
~ 22 nucleótidos
) no codificante moléculas de ARN que regulan la expresión de genes post-transcripcional. Mediante la unión con secuencias parcialmente complementarias de ARN mensajero (ARNm), moléculas de ARNm diana miRNAs para la degradación y /o inhibir la traducción, disminuyendo de ese modo la expresión de proteínas [5]. Varias evidencias experimentales han sugerido que varias enfermedades humanas, incluyendo el cáncer han sido causados debido a la desregulación de miRNAs [6]. Algunos miRNAs modular la expresión de oncogenes conocidos o genes supresores de tumores, mientras que otros funcionan como oncomiRNAs o miRNAs supresores de tumores [7]. Varios miRNAs se han correlacionado con la supervivencia del paciente. Estos miRNAs pueden ser útiles en la predicción y la modificación de los tratamientos contra el cáncer (incluyendo la quimioterapia, la radioterapia y la inmunoterapia) [8], [9]. En los últimos tiempos, hemos descubierto que los miRNAs juegan un papel importante en la respuesta celular a la radiación [10] ionizante -. [13]
miR-124 es un miARN cerebro enriquecida, que es significativamente baja regulado en muchos tumores malignos humanos, incluyendo glioblastoma, carcinoma gástrico, meduloblastoma, carcinoma hepatocelular, y CRC [14] - [22]. Estudios recientes han demostrado que el miR-124 radiosensitizes células de glioma humano apuntando a cdk4 [23]. Sin embargo, la función de miR-124 en radioresistance ha sido poco comprendido hasta la fecha.
PRRX1 es un EMT recientemente identificado (la transición epitelio-mesenquimal) inductor y stemness regulador [24], [25], ambos de que están estrechamente relacionados con radioresistence [26]. Además, la expresión PRRX1 abundante se correlaciona con mal pronóstico y la metástasis en los casos de CCR. Por otra parte, la abundante expresión de PRRX1 también se asoció con pobres resultados clínicos [27]. Estudios recientes también han demostrado que PRRX1 desempeñó un papel fundamental en la regeneración de páncreas y la carcinogénesis [28]. En este estudio, hemos ilustrado que miR-124 mejora la sensibilidad a la radiación, tanto en las células de CRC y los tumores de xenoinjertos humanos. Por otra parte, PRRX1 es una novela, blanco directo de miR-124 que induce resistencia a la irradiación. knockdown PRRX1 podía sensibilizar las células a la radiación ionizante. Además, la sobreexpresión de miR-124 haría que la modulación de la EMT y la expresión de genes relacionados stemness-, ambos de los cuales están estrechamente relacionados con radioresistence. La restauración de PRRX1 podía rescatar a los efectos causados por el miR-124. En este estudio de investigación, hemos ilustrado que el miR-124 sensibilizaron células del cáncer colorrectal a un tratamiento de radiación en cierta medida por la regulación negativa de PRRX1. Estos hallazgos se han descubierto por primera vez, lo que ilustra cómo el miR-124 juega un papel clave en la inducción de resistencia a las células a la radiación ionizante.
Materiales y Métodos
Las muestras de pacientes
CRC muestras clínicas se obtuvieron del hospital Nanfang, Universidad médica del Sur, la ciudad de Guangzhou, china. Los pacientes habían sido sometidos a resección quirúrgica máxima seguida de radioterapia y la quimioterapia. consentimientos informados escritos se obtuvieron de los sujetos que participaron en este estudio. Las muestras de tejido fueron recogidos y utilizados después de obtener la aprobación del Comité de Ética del Hospital Nanfang.
Líneas celulares y Reactivos
líneas celulares de CRC humano, incluyendo las células SW480, SW620 y LOVO fueron adquiridos de la Colección Americana de Cultivos Tipo (Manassas, VA, EE.UU.). HCT-116, LS-174T y HT29 fueron adquiridos de la Biología Celular de Shanghai, Universidad de la Academia China de Ciencias. Las células fueron cultivadas en medio RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) que se complementa con 10% de suero fetal bovino (Gibco, CA, EE.UU.) en una atmósfera húmeda húmeda que contiene 5% de CO
2 a 37 ° C . KIT de anexina V-FITC /7-AAD se adquirió de Beckman Coulter. A PRRX1 ADNc de longitud completa que carecía totalmente la 3'-UTR se adquirió de GeneCopeia (Rockville, MD, EE.UU.) y se subclonó en el vector de expresión pcDNA3.1 eucariota (+) (Invitrogen, EE.UU.). La secuencia pre-miR-124 se amplificó y se clonó en Pcdh-CMV-MCS-EF1-coGFP construye (Sistema Biosciences, California, EE.UU.). Las partículas de virus se cosecharon 48 h después de la transfección de Pcdh-CMV-miR-124 con el plásmido de empaquetamiento pRSV /PREV, pCMV /pVSVG, y pMDLg /pRRE en células 293T utilizando Lipofectamine 2000 reactivo (Invitrogen, EE.UU.). PRRX1 desmontables y control lentivirus se adquirieron de GENECHEM (Shanghai, China). MiR-124 mímica, un control no específica de miR, anti-miR-124, y un control no específico anti-MIR fueron adquiridos de Thermo Scientific Dharmacon (EE.UU.).
El aislamiento de ARN, transcripción inversa, y cuantitativa en tiempo real PCR
ARN total fue extraído de las células utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, EE.UU.). Para el miR-124, transcripción inversa y QRT-PCR reacciones se llevaron a cabo usando un kit de PCR qSYBR-verde-que contiene (GenePharma, Shanghai, China). U6 snRNA se utilizó como control endógeno. Se amplificó la forma precursora de miR-124. Para la detección de PRRX1 mRNA, cDNA se sintetizó a partir 1 g de ARN total usando el kit de reacción de transcripción inversa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega, EE.UU.). GAPDH humano se amplificó en paralelo como un control interno. Los cebadores se enumeran en el cuadro complementario S1. Todas estas muestras se normalizaron a los controles internos y cambios veces se calcularon a través de la cuantificación relativa (2-ΔΔCt).
análisis de transferencia Western
cantidades iguales de proteína se resolvieron por SDS-PAGE y se transfirieron a de fluoruro de polivinilideno (PVDF) membrana (Millipore, EE.UU.). Las membranas se bloquearon en leche desnatada sin grasa al 5% /TBST [20 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 150 mM, y 0,1% de Tween-20] a temperatura ambiente durante 1 h. A partir de entonces, que se detectaron con anticuerpos primarios a 4 ° C durante la noche. Luego, se transfirieron durante 1 h a temperatura ambiente con la ayuda de un anticuerpo secundario apropiado. A partir de entonces, se utilizaron reactivos de detección de quimioluminiscencia (Amersham Pharmacia Biotech, EE.UU.). Los anticuerpos primarios PRRX1was adquiridos de Abcam (Reino Unido). La caspasa-3, Bcl-2, andγ-H2AX fueron adquiridos de Epitomics (UK). E-cadherina, ZO-1, vimentina, N-cadherina se adquirieron de Becton, Dickinson and Company (EE.UU.). GAPDH se adquirió de BOSTER (China).
Luciferase Assay
La larga duración PRRX1 3'-UTR se amplificó por PCR y se clonó aguas abajo del gen de luciferasa de luciérnaga en el vector pGL3 (Promega , ESTADOS UNIDOS). El vector se denomina de tipo salvaje (wt) 3'-UTR. El Site-Directed Mutagenesis System GeneTailor (Invitrogen, EE.UU.) se utilizó para llevar a cabo la mutagénesis dirigida al sitio del sitio de unión de miR-124 en PRRX1 3'-UTR: el resultante se denomina mutante (MT) 3'-UTR. Estas células fueron transfectadas con plásmidos informadores y se colocan en placas de 96 pocillos. Después de incubar las células durante 48 h, se recogieron las células y se ensayaron utilizando el sistema Dual-Luciferase ensayo de indicador (Promega, Madison, WI) según las instrucciones del fabricante. Las actividades de luciferasa se normalizaron por la actividad β-galactosidasa. Cada experimento se realizó por triplicado.
clonogénico Ensayo y citometría de flujo
A predeterminado número de células fueron sembradas en placas de cultivo de 6 pocillos. A continuación, se incubaron durante 24 h, lo cual ayudó a establecerse en estas células. Las células se trataron con un intervalo de dosis IR (0, 2, 4, 6 y 8 Gy, Nasatron (Cs-137) irradiador). Después de incubar estas células a 37 ° C durante 14 días, se lavaron dos veces con PBS y se tiñeron con solución de cristal violeta. El número de colonias que contienen ≥50 células se contó bajo un microscopio utilizando la siguiente fórmula: eficiencia en la formación de la placa clon = (número de colonias /número de células inoculadas) x 100%. fracciones de supervivencia (SF) se calcularon mediante la normalización a la eficiencia en placas de grupos de control apropiados. Utilizamos GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA, EE.UU.) para adaptarse a la curva de supervivencia de las células de acuerdo con un modelo estándar lineal-cuadrática (LQ). Después de ello, se obtuvieron los valores de la fracción de supervivencia de un rango de dosis de rayos infrarrojos. Existen varios parámetros importantes en este modelo como SF2 (fracción de supervivencia a 2 Gy), α (un parámetro de roturas en el ADN causados por un choque) y β (un parámetro de roturas en el ADN causado por dos choques).
para detectar la apoptosis de células, se recogieron las células y se tiñeron utilizando 7-AAD y anexina-V-FITC. La citometría de flujo de datos se analizaron usando el software BD FACS V6.1.3 diva (BD Biosciences).
Los estudios en animales
ratones desnudos atímicos (Guangdong Experimental Animal Center) se utilizaron para la implantación del tumor. Estos ratones fueron aproximadamente 4 a 6 semanas de edad. Todos los experimentos con animales estrictamente el Reglamento para la administración de los asuntos que afectan a los animales de experimentación, la directriz nacional chino para experimento con animales, publicado en 1988. En este estudio, todos los procedimientos con animales y su cuidado se aprobaron y se llevan a cabo por la Universidad de Southern Medical institucional Cuidado de Animales y el empleo. Las células se recogieron por tripsinización y se lavaron dos veces con medio libre de suero frío. Después de esto, estas células se resuspendieron en 200 l de medio libre de suero. Para el ensayo de tumores de xenoinjertos, 5 × 10
6 SW480 células se inyectaron por vía subcutánea en la parte posterior de ratones desnudos. Después se detectaron tumores, el tamaño del tumor se midió mediante un pie de rey cada tres días. Para evaluar radioresistance tumor
in vivo
, los tumores se irradiaron con una dosis única de 10 Gy IR 11 días después de la inyección. El volumen del tumor se calculó utilizando la fórmula (a x b2) × 0,5, donde a y b son las dimensiones corta y larga, respectivamente. Los ratones se mataron a 35 días después de la inyección. A continuación, se extrajeron los tumores. Cada grupo contenía 5 ratones. Estos tumores recogidos fueron imágenes inmediatamente después del sacrificio.
Análisis estadístico
Todos los valores se expresan en términos de valores medios ± desviación estándar. Los resultados se analizaron mediante ANOVA o la prueba de la t de Student de dos colas.
P
. & Lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
miR-124 es frecuentemente hacia abajo reguladas en CRC líneas celulares y tejidos
Un panel de líneas celulares de CRC humanos se analizó cuantitativamente para determinar el nivel de expresión de miR-124. En comparación con la mucosa colónica normal agrupado de tres individuos sanos, el nivel de expresión de miR-124 fue menor en las seis líneas celulares de CRC examinados. (Figura 1A)
(A) miR-124 se expresó en niveles significativamente más bajos en seis líneas celulares de CRC en comparación con mucosa colónica normal agrupado de tres individuos sanos. La figura es representativa de tres experimentos con resultados similares **
P
. & Lt; 0,01, *
P Hotel & lt; 0,05. (B) La expresión de miR-124 en los tejidos de CRC y los tejidos normales emparejados se detectó mediante qRT-PCR y se normalizó a la de U6. Los datos se presentan como muestras individuales (n = 24) con la línea que indica el nivel medio.
Además, se analizó el nivel de expresión de miR-124 en muestras de CRC y los tejidos normales emparejados. De acuerdo con los datos obtenidos a partir de líneas celulares de CRC, el nivel medio de expresión de miR-124 fue significativamente menor en el CCR specimenscampared a los tejidos normales adyacentes (figura 1B) guía
miR-124 sensibiliza a las células del cáncer colorrectal para el tratamiento de radiación
El ensayo de supervivencia de la colonia se considera como un estándar canónica para determinar la radiosensibilidad [29]. Por lo tanto, hemos tratado de explorar los efectos de miR-124 en la supervivencia de la colonia de células CRC en presencia de radiación ionizante. Los resultados del ensayo clonogénico confirmaron que la sobreexpresión de miR-124 eran mucho más sensibles a los infrarrojos que sus homólogos (Figura 2a y el cuadro complementario S2). Es un hecho bien documentado que la capacidad de anti-apoptosis de las células cancerosas se asocia estrechamente con radioresistance. Además, se midió la apoptosis inducida por IR en las células de CRC que se transfectaron con el miR-124 imita o control de MIR. Hemos encontrado que cuando combinación con IR, la sobreexpresión de miR-124 mejora de forma significativa la apoptosis de las células en las células de CRC que en los controles (figura 2b). Además, se observó que el tratamiento miR-124 solo puede disminuir Bcl-2, y el efecto era mucho más fuerte cuando se combina con terapia de radiación. Por otro lado, la caspasa-3 y la fosforilación de la histona H2AX (γ-H2AX) [30], un indicador de la respuesta celular al daño del ADN aumentó cuando las células se trataron con miR-124 solo o sometidos a un tratamiento combinado de MIR -124 y radioterapia (Fig.2C). En conjunto, estas observaciones ilustran un efecto sinérgico entre miR-124 restauración y IR.
(A) LOVO y SW480 células establemente sobre-expresión de miR-124 fueron tratados con 0, 2, 4, 6, o 8 Gy de IR. fracciones de supervivencia se calcularon como se describe en la Figura 2A. Los resultados se presentan como la SD medio de los valores obtenidos en 3 experimentos independientes. La significación estadística de las diferencias entre los grupos se calculó usando pruebas t de Student. * P & lt; 0,05. (B) Ensayo de apoptosis que muestra la inducción de apoptosis después de miR-124 sobre-expresión, en particular combinación con la radiación en líneas celulares sobreexpresados-miR-124 LOVO y SW480. * P & lt; 0,05. (C) de transferencia de western Representante para el efecto de miR-124 sobre-expresión o /y de la radiación (4Gy) sobre la expresión de genes relacionados con daño de la apoptosis y de ADN (caspasa-3, Bcl-2 andγ-H2AX).
PRRX1 es un objetivo directo de miR-124
Se realizó un análisis bioinformático utilizando TargetScan y PicTar y predijo que el miR-124 se pueden orientar a PRRX1 región 3'UTR. De hecho, no era perfecto apareamiento de bases entre la secuencia madura semilla de miR-124 y el 3'UTR del ARNm PRRX1, y estas secuencias de semillas se conserva a través de las especies (figura 3A). Para determinar si el 3'UTR de PRRX1 mRNA es un objetivo funcional de miR-214 en las células de CRC, la secuencia diana de PRRX1 3'UTR (wt 3'UTR) o la secuencia mutante (MT 3'UTR) se clonaron en una vector informador de luciferasa (Fig.3E). Posteriormente, las células HEK293 se transfectaron con el vector de peso o 3'UTR MT y miR-124 imita. Los resultados mostraron una disminución significativa de la actividad de luciferasa en comparación con el control de los genes miARN (Fig.3E, carriles 2 y 3; P & lt; 0,05). La actividad de vector MT 3'UTR no se vio afectada por una transfección simultánea con miR-124 (Fig.3E, carriles 7 y 8) de .¿Qué más, la cotransfección con anti-miR124 y peso vector 3'UTR en células HEK293 llevado a una aumento de la actividad de luciferasa (Fig.3E, carriles 4 y 5; P & lt; 0,05). PRRX1 expresión fue detectado por QRT-PCR y Western Blot después de la modulación de la expresión de miR-124 (figura 3B, 3C, 3D). Tomados en conjunto, todos estos resultados indican claramente que PRRX1 es un objetivo de miR-124 en células CRC.
(A) Las secuencias de unión predichos para el miR-124 dentro de la 3'UTR PRRX1 humano. secuencias de semillas están resaltados y subrayados. (B), (C) y la expresión PRRX1 (D) se determinó en células de cáncer colorrectal de manera estable sobreexpresa-miR-124 y las células transfectadas con inhibidores de miR-124, o antimiR-con por PCR en tiempo real y análisis de transferencia Western. Se utilizó ANOVA y la t de Student pruebas para determinar la significación estadística de las diferencias entre los grupos. * P & lt; 0,05. (E) Luciferase ensayos de actividad usando un indicador de luciferasa con el tipo salvaje o 3'UTRs PRRX1 humanos mutantes se realizaron después de co-transfección de miR-124 imita o inhibidores en las células HEK293. Y MT 3'UTR tiene una forma significativa en comparación con el peso aumentará 3'UTR.The gráfico de barras mostró la media ± SD de tres experimentos de transfección independientes. * P & lt;. 0,05
se establecieron PRRX1 Derribo Confiere radiosensibilidad en líneas celulares de CRC
Las líneas celulares estables con shRNA -PRRX1. La expresión de la proteína PRRX1 en estas células se verificó mediante análisis de transferencia Western de los lisados celulares con anticuerpos específicos (Fig. 4A). ensayo de supervivencia de la colonia se llevó a cabo posteriormente. Se encontró que las fracciones supervivientes, PRRX1-silenciado de colonias celulares disminuyeron mucho más significativamente en comparación con el grupo control cuando se irradiaron en diferentes dosis de IR (Fig. 4B y el cuadro complementario S3). ensayo de apoptosis mostró que el silenciamiento PRRX1 combinada con radiación resultó en mucho más apoptosis que en los casos en que se utilizó solamente un único tratamiento (figura 4c), lo que indica un efecto sinérgico. Western blot mostró que cuando se combinan con radiación, el silenciamiento PRRX1 causó una baja regulación significativa del nivel de Bcl-2, pero una sobre regulación de la caspasa-3 de expresión andγ-H2AX (Fig. 4D).
(A ) blot analizado occidental eficiencia interferencias PRRX1 en LOVO y las células SW480 (B) la cuantificación del número formado a partir de células de CRC que fueron establemente infectadas con lentivirus vector vacío (control de shRNA) y lentivirus PRRX1-shRNA (PRRX1 shRNA) o sin infección lentiviral ( sin tratar). (C) El ensayo de Anexina-V de la apoptosis de las células PRRX1 desmontables en comparación con las células de control * p & lt;. 0.05. (E) western blot Representante para el efecto de la caída PRRX1 y /o radiación (4Gy) en las expresiones de los genes relacionados con la apoptosis (caspasa-3, Bcl-2 andγ-H2AX).
expresión forzada Restaura PRRX1 de los efectos de miR-124 en la radiosensibilidad
Para dilucidar si el efecto de miR-124 en la radiosensibilidad estaba mediada por la represión de PRRX1, pcDNA3.1-PRRX1 se transfectó en células sobreexpresados-miR-124. PRRX1 expresión se verificó mediante western blot (Figura 5A). Los resultados mostraron que PRRX1could rescatar a los efectos de miR-124. ensayo clonogénico y apoptosis de las células sugieren que la expresión ectópica de PRRX1 redujo significativamente radiosensibilidad inducida por el miR-124 (Figura 5B y complementario TableS4, Figure.5C). El análisis de transferencia Western también PRRX1 indicado podría restaurar la expresión de la caspasa-3 y Bcl-2, que fue provocada por miR-124 (Fig.5D). Estas observaciones indican que el miR-124 células sensibilizadas a IR por la regulación negativa de la expresión de PRRX1.
(A) expresión PRRX1 se detectó por Western blot después de la transfección de pcDNA3.1-PRRX1 sobreexpresados en las células-miR-124. (B) Las células fueron seguidos por un tratamiento tal como se describe en la Figura 2A. fracciones de supervivencia se calcularon para cada grupo. Los resultados se presentan como la media ± SD de los valores obtenidos en 3 experimentos independientes. Se utilizaron pruebas de ANOVA o la t de Student para determinar la significación estadística de las diferencias entre los grupos. La significación estadística (*
P Hotel & lt; 0,05) se indica vs LV-con y grupo de miR-124. (C) western blot Representante para el efecto de la restauración PRRX1 y /o radiación (4Gy) en las expresiones de los genes relacionados con la apoptosis (caspasa-3, Bcl-2 andγ-H2AX).
PRRX1 ectópico invierte la expresión de la EMT y relacionadas con los genes en líneas celulares stemness sobreexpresados-miR-124 establemente
en estudios recientes de la investigación, se encontró que PRRX1 induce EMT y promueve el fenotipo stemness en líneas celulares de CRC [27]. En estudios recientes de la investigación, se ha informado de que EMT se asocia con células madre de cáncer. Además, la pérdida de E-cadherina y la posterior EMT promovidos radioresistance en células tumorales humanas [31] - [33]. Estudios recientes han relacionado el fenotipo de las células tumorales CSC para someterse a EMT, que ilustra la compleja relación entre la EMT y los CAC [34] - [40]. Nos preguntamos si el miR-124 produce este efecto mediante la regulación negativa PRRX1.Thereafter, transfectadas pcDNA3.1-PRRX1 en líneas celulares de CRC sobreexpresados-miR-124 y SW480 LOVO. Western blot mostró que PRRX1 podría revertir la expresión de genes relacionados con la EMT y stemness-causado por la sobreexpresión de miR-124 (Figura 6).
Western blot se analizaron los genes relacionados con la EMT-como la E-cadherina, ZO -1, vimentina y N-cadherina y los genes relacionados stemness-como ABCG2, Sox2 y Oct4 en las células transfectadas-MIR-124 y las células cotransfectadas miR-124-PRRX1 en comparación con el grupo control. Los datos sugirieron la sobre-expresión de miR-124 podría regular negativamente la vimentina, N-cadherina, ABCG2, Sox2 y Oct4 expresión y hasta de regular la E-cadherina, ZO-1 de expresión, mientras que la sobre expresión de PRRX1 podría rescatar a este efecto.
en vivo xenoinjertos de tumores radiosensibilidad Ensayo
para determinar si el miR-124 sensibiliza a los tumores IR
in vivo
, que irradia el área del tumor sola vez usando una dosis de 10 Gy 11 días después de la inyección. A pesar de recibir la misma dosis de radiación (d11,10Gy) (figura 7A, 7B), el tamaño de xenoinjertos derivados de las células sobreexpresados-miR-124 eran mucho más pequeñas que la derivada de las células tratadas de control. Estos resultados indicaron que el miR-124 provocó un
in vivo
sensibilización de los tumores a la radiación.
(A) El exceso de expresión de miR-124 xenoinjertos tumorales SW480 sensibilizados a IR in vivo. tamaños de los tumores se midieron con el calibrador y la irradiación se entregó a los tumores área en el undécimo día (IR: 10 Gy, d11). (B) Las curvas de volumen de xenoinjertos generados por LV-con, LV-miR-124, LV-con + Radiación, LV-miR-124 + Radiación. (
p Hotel & lt; 0,05).
Discusión
En la gestión clínica CRC, un radioresistance adquirida e intrínseca es un obstáculo difícil. Tenemos que llevar a cabo más estudios de investigación para hacer frente a este problema desafiante. La adquisición de radioresistance es un proceso complicado, que implica la sobreexpresión de las proteínas de reparación del ADN [41], [42], la activación aberrante de múltiples vías de señalización [43] - [45], la angiogénesis [46], [47], las células madre del cáncer [48], y la autofagia [49], [50]. Varios estudios anteriores han demostrado que los miRNAs están estrechamente relacionados con la radiosensibilidad del tumor. Esto es porque miRNAs tienen la capacidad de aumentar y disminuir la radiosensibilidad de los tumores [8], [23], [51] - [54]. Dado que miRNAs tienen la capacidad de regular varios procesos oncogénicos tales como la capacidad de respuesta a la terapia, hay que explorar el papel de miRNAs en resistencia a la radiación. La resistencia a la IR ha contribuido a los problemas de tratamiento de los pacientes que sufren de CRC. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen sensibilidad a la radiación y la resistencia sigue siendo un ejercicio importante.
En este estudio, encontramos que el miR-124 se downregulated en ambas líneas celulares derivadas de CRC y CRC muestras clínicas en comparación con los tejidos normales. Para hacerse una idea de la función de miR-124, se realizó
in vitro
experimentos y estudios de xenoinjertos humanos. Estos estudios de investigación han puesto de manifiesto que la sobreexpresión de miR-124 podría radiosensibilizar células CRC y miR-124 caída inducida por la resistencia celular a la radiación.
Se identificaron PRRX1 era un objetivo directo de miR-124 mediante el ensayo de luciferasa. Para revelar aún más las funciones de PRRX1 en radiosensibilidad celular, hemos construido líneas celulares PRRX1-knockdown estables LOVO y SW480 y encontramos que PRRX1 knockdown sensibilidad celular inducida a la irradiación de una manera que es similar al efecto inducido por la sobreexpresión de miR-124. Por otra parte, PRRX1 regulación rescató a los efectos de miR-124-sobreexpresión de la radiosensibilidad de las células. Estos resultados indican que el efecto de miR-124 en la sensibilidad celular a la radiación está mediada en parte por la represión de la expresión de PRRX1. Como se informó anteriormente, PRRX1 inducida EMT y mejora las propiedades de auto-renovarse. Nuestros resultados sugieren que la sobre regulación de miR-124 aumenta la expresión de marcadores epiteliales como E-cadherina y ZO-1, mientras que simultáneamente disminuye la expresión de marcadores mesenquimales tales como N-cadherina y vimentina. Por otra parte, la sobre regulación de miR-124 dio lugar a una regulación a la baja simultánea en la expresión de genes relacionados con la troncalidad, a saber, ABCG2, Sox2, Oct4 y. Además, la sobreexpresión de PRRX1 podía rescatar el efecto de miR-124 en EMT por derivados alteraciones genéticas. En los últimos tiempos, se ha informado de que EMT se asoció con las células madre de cáncer. Por otra parte, las células sometidas a EMT mostraron una mayor radioresistance en células tumorales humanas [26], [31] - [33] Teniendo en cuenta estas observaciones, inferimos que miR-124 podría radiosensibilizar células CRC por PRRX1 regulación negativa, que se asocia con EMT y cáncer las células madre. Sin embargo, todas estas observaciones deben ser investigados y verificados a través de más trabajo de investigación ulterior. Hemos investigado el papel de miR-124 en la regulación de la radiosensibilidad, lo que puede afectar significativamente la biología del cáncer y la terapia del cáncer. Sobre la base de estas observaciones, la hipótesis de que la regulación a la baja de PRRX1 invierte EMT y al mismo tiempo debilita las propiedades de auto-renovación de las células, los cuales están estrechamente relacionados con radioresistence.
En conclusión, nos proporcionan pruebas de que el miR-124 sensibiliza a las células de CRC a un tratamiento de radiación mediante la inhibición de PRRX1. Esto indica que miR-124 es un biomarcador pronóstico /predictivo atractiva, que puede ser utilizado en el diagnóstico de casos de CCR. Por otra parte, hemos desarrollado un nuevo enfoque para la sensibilización de los cánceres radioresistant por la orientación de miR-124.
Apoyo a la Información sobre Table S1.
Los cebadores para el miR-124 y cuantificación PRRX1
doi: 10.1371. /journal.pone.0093917.s001 gratis (DOC) sobre Table S2. parámetros
Radiosensibilidad después de la sobreexpresión de miR-124
doi: 10.1371. /journal.pone.0093917.s002 gratis (DOC)
cuadro S3. parámetros
Radiosensibilidad después de caída PRRX1
doi: 10.1371. /journal.pone.0093917.s003 gratis (DOC) sobre Table S4. parámetros
Radiosensibilidad después de la sobreexpresión de PRRX1 en líneas celulares sobreexpresados-miR-124
doi: 10.1371. /journal.pone.0093917.s004 gratis (DOC)