Extracto
Antecedentes
células endoteliales circulantes y micropartículas tienen valor pronóstico en el cáncer, y podría ser predictores de respuesta a la quimioterapia y los tratamientos antiangiogénicos. Hemos investigado el valor pronóstico de las células endoteliales circulantes y micropartículas en pacientes tratados por cáncer avanzado no microcítico de pulmón de células.
Metodología /Principales conclusiones
periféricos muestras de sangre se obtuvieron de 60 pacientes antes de la primera la línea, la quimioterapia basada en platino +/- bevacizumab, y después del tercer ciclo de tratamiento. Muestras de sangre de 60 voluntarios sanos se obtuvieron también como controles. células endoteliales circulantes se midieron mediante una técnica de inmunofluorescencia y microscopía inmunomagnética. micropartículas fosfatidilserina positivos fueron evaluados por citometría de flujo. actividad procoagulante micropartículas mediada se midió por el ensayo de generación de trombina endógena. Resultados: los niveles de pre y post-tratamiento de los marcadores fueron mayores en los pacientes que en los controles (p & lt; 0,0001). Los niveles elevados de micropartículas se asociaron con una mayor supervivencia. los niveles pretratamiento elevados de células endoteliales circulantes se asociaron con una menor supervivencia.
Conclusiones /Importancia
Los niveles circulantes de micropartículas y células endoteliales circulantes se correlacionan con el pronóstico, y podrían ser útiles como marcadores de pronóstico en pacientes con el cáncer no microcítico de pulmón avanzado de células
Visto:. Fleitas T, Martínez-Ventas V, V Vila, regañón E, D Mesado, Martín M, et al. (2012) y células endoteliales circulantes micropartículas como marcadores de pronóstico en avanzado de células no pequeñas cáncer de pulmón. PLoS ONE 7 (10): e47365. doi: 10.1371 /journal.pone.0047365
Editor: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesú, Italia |
Recibido: 20 Abril, 2012; Aceptado: September 11, 2012; Publicado: 15 Octubre 2012
Copyright: © Fleitas et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado en parte por una subvención de la Fundación para la Investigación del hospital Universitario la Fe - Bancaja. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los sectores de actividad siguientes: Roche Pharma, Amgen, Lilly, MSD, y Bayer contribuido económicamente a la compra de reactivos y para la contratación de un técnico de laboratorio, de acuerdo con el procedimiento legal de la Fundación del hospital la Fe de donaciones, sin ningún tipo de interés en los resultados del estudio, y que no participó en ningún otro aspecto en el study.This no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
el cáncer de pulmón es uno de los tumores malignos con la incidencia más alta en todo el mundo. cáncer de pulmón de células pequeñas no (CPNM) representa más del 80% de los casos de cáncer de pulmón, y la mayoría de ellos tienen la enfermedad avanzada o metastásica al momento del diagnóstico [1].
quimioterapia basada en platino es el tratamiento estándar para cáncer de pulmón avanzado. Varios dobletes de platino se utilizan en la actualidad con una eficacia similar, aunque diferentes perfiles de toxicidad [2]. El progreso en la comprensión de la biología del cáncer han impulsado el desarrollo de fármacos contra dianas moleculares específicas, tales como el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y sus receptores (VEGFRs). Algunos agentes citotóxicos y fármacos dirigidos son más seguros o más eficaces en subtipos histológicos específicos, lo que permite tratamientos más personalizados [3]. Bevacizumab, un anticuerpo humanizado contra el VEGF, ha demostrado un aumento modesto en la supervivencia libre de progresión (SLP) y supervivencia global (OS) en el CPNM cuando se combina con quimioterapia. Sin embargo, su uso está restringido a pacientes con histología de células no escamosas [4]. A pesar de estos avances, sólo una fracción de los pacientes se benefician del tratamiento y la mayoría de ellos mueren dentro de los 2 años después del diagnóstico. Por lo tanto, hay una necesidad de biomarcadores que permitan identificar pacientes que tienen más probabilidades de responder al tratamiento.
células endoteliales circulantes (CEC) son marcadores de daño vascular [5] que pueden tener relevancia clínica en el cáncer [6 ] - [7]. CCA recuento se incrementa en pacientes con cáncer [8] - [9] y se correlaciona con la progresión tumoral [10]. Se ha sugerido que la cuantificación de CECs es útil para la identificación de pacientes que podrían beneficiarse de inhibidores de la angiogénesis y para el seguimiento de la respuesta al tratamiento [11]. En pacientes con cáncer colorrectal avanzado, un alto recuento de CEC línea de base está asociado con una mediana de la SLP más corta [12] - [13]. Sin embargo, en pacientes con cáncer de mama y con NSCLC, un recuento CEC alta línea de base está asociado con un prolongado PFS [11], [14].
micropartículas (MP) son pequeñas vesículas (100 nm-1 M) que brotar directamente de la membrana plasmática [15] - [16]. Ellos son liberados por diferentes células, incluyendo sangre, células endoteliales y células tumorales [16] - [17]. La exposición de fosfatidilserina en la superficie exterior de la membrana es una característica específica de MPs [18]; su presencia aumenta significativamente la actividad procoagulante de MPs estimulando el ensamblaje de los componentes de la cascada de coagulación. Además, las células tumorales generan una elevación de MPs que expresan factor tisular [19] - [21], lo que les confiere un potencial procoagulante [22]. A este respecto, se ha informado de que los niveles de MPs circulantes se correlacionan con la generación de trombina endógena (ETG) [23]. MPs están aumentados en pacientes con cáncer y juegan un papel en el cáncer relacionados con la hipercoagulabilidad [20] - [21], [24] - [26]. Además, la emisión de microvesículas, como exosomas y MPs, tiene importantes papeles patológicos en la progresión del tumor, lo que facilita la liberación y la propagación de las células cancerosas para generar metástasis [27]. Parlamentarios recuperados de la sangre periférica de pacientes con cáncer pueden proporcionar información relevante respecto al pronóstico y respuesta al tratamiento.
El objetivo de este estudio fue evaluar los CEC, los parlamentarios y la actividad procoagulante mediada por MP en pacientes con NSCLC avanzado, antes y después de la quimioterapia estándar, para analizar su valor pronóstico y establecer su posible asociación con la respuesta del tumor.
Materiales y Métodos
Diseño del estudio y pacientes
Este estudio prospectivo incluyó a pacientes consecutivos con CPNM tratados en el Departamento de Oncología médica del hospital Universitario la Fe con quimioterapia de primera línea de dobletes a base de platino. El bevacizumab se añadió al tratamiento cuando esté indicado. Para ser incluidos en el estudio, los pacientes tenían que cumplir con los siguientes requisitos: Edad & gt; 18 años; el estadio IIIB o IV NSCLC confirmado histológicamente; la esperanza de vida ≥12 semanas; Estado del ECOG Performance (PS) ≤2 y renal adecuada, hepática, y la función de la médula ósea.
En escena se determina por el pecho y la tomografía computarizada (TC) abdominal y la tomografía por emisión de protones cuerpo (PET). Tres semanas después del tercer ciclo de tratamiento, evaluación clínica basada en la TC se realizó utilizando los criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos (RECIST) [28]. Después del tratamiento, los pacientes fueron evaluados cada tres meses. biomarcadores sanguíneos se evaluaron al inicio y tres semanas después del tercer ciclo de tratamiento. El grupo de control estaba compuesto por sujetos sanos emparejados en edad y sexo con los pacientes. Los pacientes y los controles previstos consentimiento informado por escrito. Este estudio fue aprobado por el Comité Ético de Investigación Biomédica institucional.
Evaluación de biomarcadores
Las muestras de sangre se obtuvieron por punción de la vena cubital no traumático, y se recogieron en tubos de plástico Vacutainer ™ (BD) con diagnóstico dos anticoagulantes diferentes: K3 EDTA (4,3 mg) para países de Europa central, y citrato de sodio (129 mM) en una proporción de 01:09 (v /v, citrato de sodio /sangre) para MPs y ETG. Las muestras se mantuvieron a 4 ° C y se procesaron entre 2 y 4 horas después de la recogida. las muestras de sangre con citrato se centrifugaron a 1500 xg durante 30 minutos a 4 ° C para obtener el plasma libre de plaquetas, y luego se almacenaron a -80 ° C para permitir la posterior análisis por lotes.
Cuantificación de Total de micropartículas
Las muestras de plasma que contienen suspensiones MP se analizaron por citometría de flujo. conjugados de anexina V-FITC se utilizaron para detectar la fosfatidilserina accesible en las membranas de MP. Ten l de muestras de plasma congeladas se diluyeron en 500 l de tampón HEPES que contiene mM CaCl 2,5
2 (pH 7,4). Las muestras se incubaron a continuación durante 60 minutos a 4 ° C en la oscuridad con 1 l de FITC-anexina V (TACS AnnexinV, Trevigen Inc). La adquisición de los eventos se cuantificó en un citómetro EPICS XL- (Beckman Coulter) a alta velocidad de flujo de 2 minutos durante el cual se analizaron 325 l de esta suspensión. perlas fluorescentes estándar de diferentes diámetros se utilizaron para la calibración de tamaño (0,5-3,0 micras, Megamix, BioCytex) y para establecer la puerta de detección de MP en un diámetro 0,5-1 micras, siguiendo una pauta de consenso en la medición MP [29]. El tamaño de MPs correlacionada con dispersión hacia adelante (FS) y su granularidad con parámetros de dispersión lateral (SS). La FS-canales leídos, SS y la fluorescencia se fijaron en la ganancia logarítmica. Para limitar el ruido de fondo del polvo y cristales, todos los tampones de dilución fueron filtradas utilizando filtros de 0,22 micras (Millipore). Para diferenciar MPs de eventos debido al ruido, MPs fueron identificados como partículas & gt; 0,5 y & lt; 1,0 mm de diámetro, y se tiñeron positivamente para la suspensión Anexina V. MP en el plasma se preparó sin calcio como un control negativo. El número de miembros del Parlamento FITC-anexina V positivas se calculó y se expresó como eventos por microlitro de plasma.
Mediciones la generación de trombina
ETG ensayos se llevaron a cabo para evaluar la capacidad de generación de trombina in vitro de plasma mediante el uso de la Trombograma automatizado calibrado (CAT, Thrombinoscope BV). Ochenta l de muestras de plasma congeladas fueron dispensadas en placas de microtitulación de fondo redondo de 96 pocillos (Greiner Bio-One, ref650061, EE.UU.). Cada muestra requiere dos pocillos. Twenty l de calibrador de trombina estándar (TS20.00 trombina calibrador, Thrombinoscope BV) se añadieron a un pocillo, y se añadieron 20 l de sustrato de trombina fluorogénico con calcio (Fluka TS50.00 Kit Thrombinoscope BV) a ambos pozos para iniciar ETG con continuo comparación con el reactivo de trombina calibrador. actividad de la trombina se midió como la fluorescencia en un lector de Fluoroskan Ascenso fluorímetro (Thermo Labsystems) equipado con un conjunto 390/460 filtro. No se añadieron factor tisular exógena o fosfolípidos. curvas de generación de trombina se calcularon utilizando el software Thrombinoscope y los resultados se expresaron como pico de trombina (nM) (altura de la curva).
Cuantificación de células endoteliales circulantes
El aislamiento y la cuantificación de los países de Europa central eran realizado en la sangre entera por una técnica inmunomagnética, siguiendo un protocolo de consenso [30]. CEC se aislaron a partir de sangre entera a 4 ° C con PanMouse M450 Dynabeads (Dynal, Oslo, Noruega) recubiertas con sEndo1 (Biocytex, Marsella, Francia), un anticuerpo monoclonal dirigido contra el antígeno CD146 endotelial. Para evitar la unión no específica de los leucocitos a CD146 perlas recubiertas, las células se incubaron después del aislamiento inmunomagnética con FITC marcado con Ulex europaeus lectina-1, (UEA1) (Sigma Aldrich, Inc) durante 1 h en la oscuridad, lo que confirma la naturaleza endotelial de las células aisladas. Las muestras se lavaron y se suspendieron en tampón, y las células contados bajo microscopía de fluorescencia utilizando una cámara de Nageotte. células nucleadas & gt; 10 micras de longitud, con más de cinco bolas inmunomagnéticas adjuntos y tinción positiva UEA1 fueron considerados como países de Europa central. Los conglomerados se contaron como una célula. El número de CECs se expresó como células por ml de sangre. La reproducibilidad se puso a prueba mediante la realización de seis repeticiones de diez muestras diferentes.
Análisis estadístico
Los resultados se dan como valores medios ± desviación estándar (DE) para las variables continuas y como porcentajes para las variables categóricas. Se utilizó la prueba de Kolmogorov-Smirnov para evaluar si cada parámetro seguía una distribución normal. Se utilizó el análisis de varianza (ANOVA) con el Bonferroni análisis post hoc para evaluar las diferencias de nivel de marcador entre los tipos de muestras (control, los casos de pre-tratamiento y post-tratamiento de los casos). correlación bivariada se realizó mediante la prueba de correlación de Spearman el. SG y SLP se analizaron mediante el método de Kaplan-Meyer, y las curvas de supervivencia de los subgrupos se compararon mediante la prueba de log-rank. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el programa informático SPSS, versión 15.0 para Windows (SPSS Inc., Chicago, Illinois, EE.UU.). los valores & lt probabilidad; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
Características de los pacientes, tratamientos y Resultado
Entre enero de 2009 y septiembre de 2010, sesenta pacientes y sujetos sanos fueron sesenta. incluido. La Tabla 1 resume las características clínicas del grupo de estudio. Tratamientos recibidos por los pacientes se describen en la Tabla 2. La más notable toxicidad relacionada con el tratamiento fue hematológica, con un 15% de grado 3-4 neutropenia febril, y dos muertes por esta causa (ambos pacientes recibieron cisplatino + docetaxel). Sólo 2 pacientes presentaron eventos trombóticos durante el tratamiento: un paciente con tromboembolismo pulmonar, y un paciente con trombosis venosa profunda (ambos pacientes recibieron cisplatino + docetaxel). Dos pacientes presentaron con hemorragia pulmonar grave, uno de ellos relacionado con bevacizumab. En cuanto a la eficacia, más de la mitad de los pacientes presentó una respuesta objetiva (58,3%). La mediana de fibras discontinuas de poliéster fue de 10 meses (IC 95%, 7,9 a 12 meses) y la mediana de SG fue de 11 meses (IC del 95%, 8,8 a 13,1 meses). Sólo 36 pacientes estaban vivos en el momento previsto para la segunda extracción de sangre.
circulante marcador Niveles y Análisis de correlación
Los niveles de CEC, los parlamentarios y ETG en pacientes y controles se muestran en la Tabla 3. Los niveles medios de países de Europa central y parlamentarios fueron significativamente mayores (P & gt; 0,0001) en los pacientes en comparación con los controles. Sin embargo, no se observaron diferencias significativas entre los niveles de pre y post-tratamiento de los CEC y parlamentarios. Los niveles de ETG fueron significativamente superiores en los pacientes, sólo en muestras de pre-tratamiento (P & lt; 0,01) guía empresas
Las correlaciones entre los niveles de marcadores circulantes mostraron que los niveles de MP correlacionaron positivamente con los niveles ETG, tanto antes (Spearman r. = 0.60, P & lt; 0,001) y después del tratamiento (Spearman r = 0.68, P & lt;. 0.001)
marcadores circulantes y el resultado clínico
El análisis de las asociaciones entre los marcadores circulantes y los resultados clínicos mostraron MPS basales niveles & gt; 3.278 MP /l (correspondiente a la 99
percentil en los controles) se asociaron con mejores PFS (15 frente a 9 meses, p = 0,04) y SO (16 frente a 10 meses, p = 0,04) . Dicha asociación no se encontró para países de Europa central o ETG (Tabla 4). Por otra parte, los niveles basales de CECs & gt; 152 células /ml (correspondiente a la 75
percentil en pacientes) se asociaron con un OS peor (16 meses frente a 9 meses respectivamente; Log Rank 4,3; p = 0,04) (Figura 1 )
el límite superior de referencia se calculó como valores de CEC & gt; 152 células /ml (correspondiente a los
percentil del grupo de pacientes) CEC 75:.. las células endoteliales circulantes
Discusión
los resultados del presente estudio muestran que la CCA, los niveles de MP, y ETG se encuentra elevado en los pacientes con NSCLC en comparación con los controles sanos. La quimioterapia no cambió los niveles de estos marcadores. También hemos encontrado una asociación entre altos niveles de MP, tanto antes como después del tratamiento, y la supervivencia. Por otra parte, hemos observado una asociación entre los niveles de pretratamiento de países de Europa central y la supervivencia.
Nuestros resultados muestran una asociación entre la alta pre- y post-tratamiento de los niveles parlamentarios y mayor supervivencia. Para nuestro conocimiento, este es el primer estudio que muestra una asociación de este tipo en pacientes con NSCLC. Existe un creciente interés en la caracterización de los parlamentarios y, en su papel potencial como biomarcadores en diferentes enfermedades [31]. En pacientes con cáncer de próstata resistente a la castración, los altos niveles MP derivados de las plaquetas estaban asociados con una corta supervivencia [32]. Un estudio realizado en pacientes con síndrome de dificultad respiratoria mostró una correlación positiva entre los niveles altos de parlamentarios derivadas de leucocitos y la supervivencia [33]. Los resultados de un estudio experimental con un modelo de carcinoma de pulmón murino de Lewis, demostraron que MPs de linfocitos derivados ejercen efectos antiangiogénicos y proapoptóticos que llevaron a la inhibición del crecimiento tumoral mediante la reducción de los niveles de VEGF [34]. A pesar de que tenemos los parlamentarios no se caracterizan por su origen celular, estos resultados podrían proporcionar y explicación para la asociación positiva entre los niveles de MP y de supervivencia que hemos encontrado en el presente estudio.
Se observó una fuerte correlación entre los niveles de MP y ETG. Este hallazgo está de acuerdo con los datos anteriores, lo que indica que la presencia de MPs en plasma afecta significativamente ETG en tanto normal [35] y las condiciones patológicas [23], [36]. El aumento del número de parlamentarios que circulan y su correlación con altos niveles ETG observada en nuestro estudio corrobora el papel de ETG en hipercoagulabilidad cáncer, como se informó anteriormente [29] - [33]. Además, como se ha demostrado recientemente, la medición de la ETG puede identificar a los pacientes con cáncer de alto riesgo de tromboembolismo venoso [37].
Hemos observado una asociación entre niveles elevados de pretratamiento de países de Europa central y pobre supervivencia. No hay datos concluyentes sobre el valor pronóstico de los CEC en el cáncer. La mayoría de los estudios coinciden en que los altos niveles de países de Europa central están asociados con un mal pronóstico [10], [12] - [13]. resultados controvertidos Sin embargo, otros estudios han proporcionado [11], [14]. Beerepoot et al. [10] estudiaron los niveles de CECs viables en pacientes con varios tipos de cáncer; se encontraron con que cuenta la CCA fueron mayores en pacientes que en sujetos sanos, y que la quimioterapia aumentaron el número de la CCA. Estos autores definen CECs como CD146 +, con la tinción adicional con CalceinAM para cuantificar las células viables; no hay otros marcadores, tales como UEA1, se utilizaron para confirmar la naturaleza endotelial de las células. El estudio realizado por Kawaishi et al. [14] encontraron una asociación entre el aumento de los niveles de pre-tratamiento de los PECO y de buen pronóstico en pacientes con NSCLC. En este estudio, el CD146 endotelial marcador, el marcador de ADN DAPI, y las CD105 marcador de activación se utilizaron para seleccionar CECs, junto con CD45 para descartar las células hematopoyéticas. Por el contrario, en pacientes con carcinoma colorrectal tratados con quimioterapia y bevacizumab, Ronzoni et al. [12] encontraron recuentos CCA reposo a ser menor en los pacientes que lograron una respuesta radiológica en comparación con los pacientes que no alcanzaron la respuesta. El estudio de Matsusaka y col. [13], mostró que los pacientes con niveles de pre-tratamiento de CXCR4 positiva CEC & gt; 20% de las células mononucleares tenían una peor SSA y la SG. Estos resultados son consistentes con los obtenidos en nuestro estudio, donde los altos niveles de CEC se asociaron con un mal sistema operativo. Dada la variedad de técnicas utilizadas para la cuantificación de las células endoteliales, se necesitan esfuerzos para identificar los fenotipos celulares más adecuados para cada situación clínica y para explicar las controversias actuales.
Nuestros resultados proporcionan nuevos datos sobre el valor pronóstico de los parlamentarios y CEC en pacientes con NSCLC. El papel de los parlamentarios y los países de Europa central como posibles marcadores biológicos en pacientes con CPNM, tratados con quimioterapia convencional o terapias dirigidas, deben estudiarse, ya que una mejor comprensión de su papel puede abrir nuevas perspectivas en los campos de diagnóstico y tratamiento.
Reconocimientos
los autores desean agradecer a Rafael Rosell y Stefano Indraccolo por sus valiosos comentarios sobre el manuscrito. También agradecen a Josefa Llorens, Ursula Salinas y Adela Mañez por su asistencia técnica.