células madre similares a
Extracto
Cáncer (CSC) células /cáncer initiaiting (AIC) se definen como una pequeña población de las células cancerosas que tienen la capacidad de auto-renovación, el potencial de diferenciación y alta capacidad iniciadoras del tumor. CSC /CIC de cáncer de ovario se han aislado por la población lado análisis (SP), ensayo ALDEFLUOR y utilizando marcadores de superficie celular. Sin embargo, estos enfoques no son marcadores definitivos para CSC /CIC, y es necesario refinar los métodos más recientes para identificar más altamente purificadas CSC /CIC. En este estudio, se analizaron células SP y aldehído brillante células dehidrogenasa (ALDH
Br) a partir de células de cáncer de ovario. Tanto las células SP y ALDH
Br células del tumor mayor exhibido iniciadoras de capacidad y un mayor nivel de expresión de un marcador de células madre,
región determinante del sexo Y-cuadro 2 (Sox2)
, que los de la población principal (MP ) y las células ALDH
Baja células, respectivamente. Se analizaron un SP y ALDH
Br superposición de la población (SP /ALDH
Br), y el SP /población ALDH
Br presentó mayores capacidad iniciadoras del tumor que el de células SP o
células Br ALDH , lo que permite la iniciación del tumor con tan sólo 10
2 células. Por otra parte, SP /ALDH
Br población mostró una mayor capacidad de formación de esferas, la resistencia a cisplatino, la capacidad de diferenciación de los adipocitos y la expresión de
Sox2
que las de SP /ALDH
Bajo, MP /ALDH
Br y MP /ALDH
Baja células. Gen desmontables de Sox2 suprime el tumor a la iniciación de las células de cáncer de ovario. Un SP /ALDH población
Br se detectó en varias células de cáncer ginecológico con proporciones de 0,1% para las células de adenocarcinoma endometrioide HEC-1 al 1% de las células de adenocarcinoma mucinoso de ovario de MCAS. En su conjunto, el uso de la SP y ALDH población superposición
Br es un enfoque prometedor para aislar altamente purificadas CSC /CIC y Sox2 podría ser un marcador funcional novedoso para ováricos CSC /CIC
Visto:. Yasuda K , Torigoe T, Morita R, Kuroda T, Takahashi A, Matsuzaki J, et al. (2013) ováricos cáncer de células madre se enriquecen en Side Población y aldehído deshidrogenasa brillante superposición de Población. PLoS ONE 8 (8): e68187. doi: 10.1371 /journal.pone.0068187
Editor: Shannon M. Hawkins, Baylor College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 17 de diciembre de 2012; Aceptado: 28-may de 2013; Publicado: 13 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Yasuda et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas-en-Ayudas a la Investigación Científica del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón (subvención Nos. 16209013, 17016061 y 15659097) para la práctica de Investigación de Aplicaciones de la Agencia de Ciencia y Tecnología de Japón, y para Investigación del cáncer (15-17 y 19-14) del Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar de Japón, Cancer Research Fund Ono (NS) y la Fundación de Ciencias de Takeda (YH). Este trabajo fue apoyado en parte por el Fondo Nacional de Investigación y Desarrollo del Centro del Cáncer (23-A-44). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción las células madre similares a
cáncer (CSC) /células iniciadoras del cáncer (AIC) se definen como pequeña población de células cancerosas que tienen las propiedades de alta capacidad que inician el tumor, capacidad de auto-renovación y capacidad de diferenciación [1] - [3]. Además, CSC /CICs se demuestra que son resistentes a las terapias convencionales para el cáncer, incluyendo la quimioterapia y la radioterapia; Por lo tanto, los CAC /CIC son responsables de la recaída del cáncer después del tratamiento [4], [5]. Varios métodos han sido descritos para identificar células madre cancerosas /CICs, incluyendo el aislamiento por la expresión marcador de superficie celular CSC /CIC-específica (por ejemplo, CD44, CD133, CD166), la detección de la población lateral (SP) fenotipo de células por Hoechst 33342 exclusión y detección de aldehído deshidrogenasa 1 actividad (ALDH1) en el ensayo ALDEFLUOR [6]. Sin embargo, la expresión de marcadores de superficie celular, células SP y la expresión de ALDH1 no están relacionados con la capacidad de iniciación de tumor en algunos informes [7] - [9]. Por tanto, estas observaciones sugieren que estos marcadores de células madre (marcadores de la superficie celular, células SP y ALDH1) no son funcionales y no necesario para el mantenimiento de células madre cancerosas /CIC. Estos marcadores pueden no definen altos CSC /CIC tumorigénicas, y estos marcadores son únicamente los marcadores sustitutos para CSC /CIC. Por lo tanto, se espera marcador no sustituto funcional que es esencial para el mantenimiento de los CAC /CIC.
El cáncer de ovario es uno de los principales tumores malignos y causa la muerte de más de un millón de personas en el mundo cada año [10 ]. Además, la mayoría de los pacientes tienen episodios de ascitis miserables, especialmente en etapas avanzadas. Para mejorar el tratamiento clínico de cáncer de ovario, la investigación de células madre del cáncer de ovario se ha convertido en un tema reciente. marcador de superficie celular CD44, las células y SP ALDH
células Br se han reportado como marcadores de células madre para neoplasias ginecológicas utilizando líneas de células OVCAR3, HEC-1 y otras líneas y muestras primacía [11] - [14], y CSC /CIC la investigación puede mejorar el resultado de pacientes con cáncer de ovario avanzado.
para mejorar los métodos para el aislamiento de alta pureza de ovario CSC /CIC, analizamos la combinación de marcadores conocidos CSC /CIC de ovario. Se analizaron líneas celulares de cáncer de ovario en un análisis de SP y el ensayo ALDEFLUOR y encontramos que las células SP y ALDH
Br células fueron mayores que los de tumorigénico principal población de células (MP) y ALDH
Baja células, respectivamente. Se encontró que la población superposición de células SP y células ALDH
Br (SP /ALDH
Br) fueron más altamente tumorigénicas. Y hemos encontrado que
Sox2
se expresó en un SP /población ALDH
Br en el nivel más alto, y gen desmontables de
Sox2
abrogó el tumor a la iniciación de las células de cáncer de ovario. Por lo tanto, Sox2 podría ser un marcador funcional novedoso para ováricos CSC /CIC y SP /ALDH
Br población es la población más adecuado para el análisis de ovario CSC /CIC que las células SP o células ALDH
Br.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
los ratones fueron mantenidos y experimentaron con arreglo a las directrices de y después de la aprobación del Comité de Sapporo Escuela de Medicina de la Universidad de Medicina, Centro de Experimentación Animal con el número de permiso 08-006. Cualquier animal encontró poco saludable o enfermo fueron sacrificados sin demora. estudio de la tinción inmunohistoquímica fue aprobado por las Juntas de Revisión Institucional (IRB) de Sapporo Medical University Hospital. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes de acuerdo con las directrices de la Declaración de Helsinki.
Líneas celulares y cultivo
líneas celulares de ovario humano (MCAS, HTBoA, OVCAR3, OVSAHO) y de endometrio humano células (HEC-1) de carcinoma se obtuvieron de ATCC (Manassas, VA, EE.UU.). MCAS y las células HEC-1 se mantuvieron en medio Mínimo Esencial (MEM) (Life Technologies, Grand Island, NY, EE.UU.). HTBoA células y OVCAR3 se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.). células OVSAHO se mantuvieron en medio RPMI 1640 (Sigma-Aldrich). Cada línea celular fue suplementado con FBS al 10% y se cultivaron en un 5% humidificado de CO
2 incubadora a 37 ° C.
Población lateral (SP) de ensayo
Población lateral (SP) se realizó un análisis como se ha descrito previamente con algunas modificaciones [15], [16]. Hoechst 33342 (Lonza, Walkersville, MD, EE.UU.) se utilizó colorante a la concentración de 2,5 o 5,0 mg /ml en la presencia o ausencia de verapamil (50 mM; Sigma-Aldrich) como un inhibidor del transportador ABC. Las células se incubaron a 37 ° C durante 60 min o 90 min con agitación continua. Un millón de células teñidas se analizaron mediante FACS Aria II (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.). El colorante Hoechst 33342 fue excitado en 357 nm y su fluorescencia se analizó utilizando dos longitudes de onda (azul, 402-446 nm; rojo, 650-670 nm).
ensayo ALDEFLUOR
aldehído deshidrogenasa actividad (ALDH) se detectó usando un kit de ensayo ALDEFLUOR (StemCell Technologies) de acuerdo con el protocolo del fabricante [17]. Las células se tiñeron por BODIPY-aminoacetaldehído (BAAA) a 1,5 mM y se incubaron durante 30 min a 37 ° C. Un inhibidor de la ALDH1, benzaldehído dietilamino (DEAB), en exceso molar a10 veces se utilizó como control negativo. Un millón de células teñidas se analizaron por FACS Aria II. Se detectaron las células que expresan ALDH1 brillantemente fluorescentes (ALDH1
Br) en el canal de fluorescencia verde (520-540 nm).
SP y ALDEFLUOR de doble tinción
Las células se tiñeron por Hoechst 33342 y se teñirán con BAAA. Un millón de células SP y ALDEFLUOR-duales-teñidas se analizaron mediante FACS Aria II. Las células se dividieron en tres grupos de acuerdo a la intensidad de ALDH (ALDH
Br (ALDH brillante), ALDH
Mid (medio ALDH), ALDH
Baja (ALDH bajo)), luego se analizaron mediante el ensayo de SP.
tinción inmunohistoquímica
La tinción inmunohistoquímica utilizando secciones incluidas en parafina fijadas con formalina de tejidos de carcinoma de ovario resecado quirúrgicamente se llevó a cabo como se describe anteriormente [18]. anticuerpo de ratón anti-ALDH1 se utilizó a una dilución de 250 veces. Anti-ABCG2 anticuerpo policlonal de conejo (Sigma-Aldrich) se utilizó a 5 mg /ml. de cabra marcado con peroxidasa anti-anticuerpo policlonal de conejo (Nichirei, Tokio, Japón) se utilizó como el protocolo del fabricante y se visualizaron por DAB. Alcalina de cabra marcado con fosfatasa anti-ratón de anticuerpo policlonal (Nichirei) se utilizó como el protocolo del fabricante y se visualizaron por New fucsina (Nichirei). Membrana tinción marrón fue juzgado como tinción positiva para ABCG2, y la tinción con rojo citoplasma fue juzgada como la tinción positiva para ALDH1.
trasplante de xenoinjerto
Se recogieron células clasificadas y se resuspendieron en concentraciones de 10
2-10
4 células por 50 l de PBS y luego se mezcla con 50 l de Matrigel (BD Biosciences). La mezcla de células matrigel se inyectó en el espacio subcutáneo de diabética /severa inmune-deficiencia no obesos combinado ratones 6 semanas de edad (NOD /SCID) (NOD.CB17-Prdkcscid /J, Charles River Laboratory, Yokohama, Japón) bajo anestesia. El crecimiento tumoral se controló semanalmente, y el volumen del tumor se calculó XY
2/2 (X = eje largo, Y = eje corto).
Esfera formación de ensayo
ensayo de formación de colonias esférica se ha realizado mediante CSC completa Recombinan Medio (Cell Systems Corporation, Kirkland, WA, EE.UU.). SP /ALDH
Br, SP /ALDH
Bajo, MP /ALDH
Br y MP /ALDH
Baja células se sembraron a 10
3 células por pocillo en 6 pocillos ultra baja placas de unión (Corning Inc., Corning, NY, 14831) y se cultivaron durante 10 días. La morfología de las células se evaluó y se tomaron fotografías con un microscopio de luz todos los días. grupos de células redondas mayores de 100 micras fueron juzgados como esferas.
viabilidad de las células de ensayo
Para el ensayo de viabilidad celular, SP /ALDH
Br, SP /ALDH
Bajo, MP /se aislaron ALDH
Br y MP /ALDH
Baja células. Entonces, las células se colocaron en placas a 1000 células por placa de 96 pocillos para 1 día y luego se trataron con cisplatino durante 3 días bajo varias concentraciones. Posteriormente, la viabilidad celular se investigó utilizando el Sistema de Premix WST-1 Ensayo de proliferación celular (Takara Bio Inc., Otsu, Japón) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
adipocito diferenciación ensayo
Para los adipocitos ensayo de diferenciación, SP /ALDH
Br, SP /ALDH
se aislaron, MP /ALDH
Br y MP /ALDH
Baja células bajos. Las células se sembraron a 10000 células por placa de 24 pocillos, y se cultivaron en suero reducido RPMI:DMEM (01:01) que contenía 0,5 mM de ácido trans-retinoico (Sigma-Aldrich) y 50 nM de insulina (Sigma-Aldrich) durante 2 días, seguido de la adición de medio de diferenciación adiposo que contiene 170 nM de insulina, 2 nM de triyodotironina y rosiglitazona 0,5 mM [19]. Las células se mantuvieron en el medio durante 5 días y se detectó la acumulación de lípidos neutrales en 4% de formaldehído células fijadas usando el aceite rojo O (Sigma-Aldrich) tinción. Se observó tinción de lípidos utilizando el microscopio y se contaron las células teñidas de lípidos.
Sox2
mRNA desmontables de siRNA
se realizó Sox2 gen
experimento desmontables el uso de pequeños ARN de interferencia (siRNA). Sox2 siRNA (NM003106) y ARNsi de control negativo se adquirieron de Life Technologies. células MCAS se sembraron en una placa de 24 pocillos, y las transfecciones se llevaron a cabo utilizando Lipofectamine RNAi max (Life Technologies) en Opti-MEM de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cuarenta y ocho horas después, las células se analizaron para la expresión de
Sox2
,
ALDH1A1
y
ABCG2 fotos: por RT-PCR.
Invertir polimerasa de transcripción reacción en cadena (RT-PCR) análisis
knockdown de genes de SOX2 fue confirmada por RT-PCR. Aislamiento de RNA y análisis RT-PCR se realizó como se describió anteriormente [20]. Los ciclos térmicos condiciones fueron de 94 ° C durante 2 min, seguido de 35 ciclos de 15 segundos a 94 ° C, 30 seg a 60 ° C y 30 segundos a 72 ° C. Los pares de cebadores utilizados para el análisis RT-PCR fueron 5'-TGTTAGCTGATGCCGACTTG-3 'y 5'-TTCTTAGCCCGCTCAACACT-3' para
ALDH1A1
con un tamaño esperado del producto de PCR de 154 pares de bases (pb), 5'-CACCTTATTGGCCTCAGGAA 3 'y 5' CCTGCTTGGAAGGCTCTATG-3 'para
ABCG2
con un tamaño esperado del producto de PCR de 206 pb, 5'-CATGATGGAGACGGAGCTGA-3' y 5'-ACCCCGCTCGCCATGCTATT-3 'para
Sox2
con un tamaño de producto de PCR esperado de 410 bps, 5'-GCAGTCAACAGTCGAAGAAGG-3 ', y 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3' y 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 'para
gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH)
con un tamaño de producto esperado de 452 pb.
GAPDH
se utilizó como control interno.
cuantitativa en tiempo real el análisis de PCR (qPCR)
Cuantitativo en tiempo real PCR se realizó a través de ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Sox2 gratis (Hs01053049_s1),
ABCG2 gratis (Hs00184979_m1),
CD44 gratis (Hs01075861_m1),
PROM1 gratis (Hs01009250_m1) y
ABCB1
(Hs00184500_m1) cebadores y sondas fueron diseñados por el fabricante (TaqMan Gene ensayos de expresión; Applied Biosystems). El ciclo térmico se realizó mediante 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos, seguido por 60 ° C durante 1 min. Cada experimento se realizó por triplicado, y se normalizaron a la
GAPDH
gen como un control interno.
Resultados
Los CSC /CIC fueron enriquecidos en células SP
células madre cancerosas de ovario /CIC se han aislado como células SP de células de la línea de cáncer de ovario humanos y ratones [11], [21]. Se analizaron varias líneas celulares Caner ginecológicos incluyendo líneas de células de ovario humano (MCAS, HTBoA, OVCAR3, OVSAHO) y la línea celular de carcinoma endometrial humana (HEC-1) (Figura 1A y Figura S1). células SP se pudieron detectar en todas las células de línea y de la proporción de células SP se varió de 1,2% a 2,6%. Dado que no hay ningún informe que describe mucinoso línea celular de adenocarcinoma humano MCAS, de este modo, además se analizó SP células derivadas de MCAS. Los CSC /AIC tienen alta capacidad iniciadoras del tumor [22], de este modo, inyectados números de serie diluido de células SP y MP células en las espaldas de los tres ratones NOD /SCID por vía subcutánea para examinar la capacidad iniciadoras del tumor. En los tres ratones, los tumores se iniciaron con 10
4 SP células, y los tumores se iniciaron con 10
4 células MP en 2 de los 3 ratones. En un ratón, un tumor se inició con 10
3 SP células, mientras que el 10
3 células MP no inició ninguna tumoral (Tabla 1). El tamaño de los tumores derivados de células SP fue significativamente mayor que el de los tumores derivados de células MP (Figura 1B). Los niveles de expresión de marcadores de células madre fueron investigados por qPCR, y las células SP derivadas de células MCAS expresaron niveles más altos de vástago marcadores de células
SOX2
,
CD44
y
PROM1
y el gen transportador ABC
ABCG2
, mientras que
ABCB1
no era (Figura 1C). Estos resultados indican que CSC /CICs fueron enriquecidos en células SP derivadas de células MCAS. Los resultados se reprodujeron en al menos tres experimentos independientes.
A. La detección de células SP a partir de células del MCAS. células de adenocarcinoma mucinoso de ovario MCAS se tiñeron con Hoechst 33342 y se analizaron. El porcentaje representa la proporción de células SP. B. iniciación del tumor de células derivadas de células SP MCAS. 10
3 y 10
4 SP y las células derivadas de células MP MCAS se inocularon por vía subcutánea en las espaldas de los ratones NOD /SCID, y el crecimiento del tumor se midió semanalmente. Los datos representan la media ± SD. Las diferencias entre SP y MP células fueron examinados para la significación estadística mediante la prueba t de Student. * Los valores de p. C. qPCR de marcadores CSC /CIC en células MCAS SP y MP. Los datos representan la media ± SD. Los asteriscos indican diferencias significativas. * P & lt; 0,05. t-test.
CSC /CIC se enriquecen en ALDH
Br células
CSC /CIC podría ser aislado como ALDH
Br células de la ALDEFLUOR ensayo [23]. Por lo tanto, hemos examinado si los CAC /CIC se puede aislar con éxito por el ensayo ALDEFLUOR. MCAS, HTBoA, OVCAR3, OVSAHO y las células HEC-1 se analizaron mediante el ensayo ALDEFLUOR y nos pareció que la relación de ALDH
Br células fue del 8,1% al 11,3% (Figura 2A y Figura S1). ALDH
Br y células ALDH
Baja células derivadas de MCAS se clasifican y se inyectan en las espaldas de los cinco ratones NOD /SCID para examinar la capacidad iniciadoras del tumor. En los cinco ratones, los tumores se iniciaron con 10
4 ALDH
Br células, mientras que los tumores se iniciaron con 10
4 ALDH
Baja células en sólo 2 de los 5 ratones (Tabla 1). El tamaño de los tumores derivados de ALDH
células Br fue significativamente mayor que el de los tumores derivados de ALDH
Baja células (Figura 2B). Los niveles de expresión de marcadores de células madre fueron investigados por qPCR. células ALDH
Br derivadas de células del MCAS expresaron niveles más altos de la madre marcadores de células
Sox2
,
CD44
y
PROM1
, ALDH1A1, y el gen transportador ABC
ABCG2
y
ABCB1 gratis (Figura 1C). Estos resultados indican que CSC /CIC también fueron enriquecidos en ALDH
br células derivadas de células del MCAS. Los resultados se reprodujeron en al menos tres experimentos independientes.
A. La detección de células ALDH
Br a partir de células del MCAS. células de adenocarcinoma mucinoso de ovario MCAS se tiñeron con BAAA y analizados. El porcentaje representa la proporción de ALDH
Br células. Inhibidor indican inhibidor ALDH1 (dietilamino benzaldehído (DEAB)). B. iniciación del tumor de ALDH
Br células derivadas de células del MCAS. 10
4 ALDH
Br y ALDH
Baja células derivadas de células del MCAS se inocularon por vía subcutánea en las espaldas de los ratones NOD /SCID, y el crecimiento del tumor se midió semanalmente. Los datos representan la media ± SD. Las diferencias entre ALDH
Br y ALDH
Baja células se examinaron para determinar la significación estadística mediante la prueba t de Student. * Los valores de p. C. qPCR de marcadores CSC /CIC en células MCAS SP y MP. Los datos representan la media ± SD. Los asteriscos indican diferencias significativas. * P & lt; 0,05. t-test.
SP y ALDEFLUOR doble análisis
células SP y ALDH
Br células muestran un mayor flujo de salida de colorante Hoechst 33342 y más alto nivel de expresión de dehidrogenasa de aldehído, que son diferentes fenotipos, y células madre hematopoyéticas se aislaron como un SP y la población ALDH
Br en un estudio anterior [24]. Por ello, investigó la población superposición de células SP y células ALDH
Br. Después de la tinción de las células con Hoechst 33342 MCAS colorante, las células se lavaron y después se tiñeron con reactivo ALDEFLUOR y analizado. En este experimento, la proporción de células SP fue del 5,3% y el ratio de ALDH
Br células fue del 14,4%. 7,1% de ALDH
Br células mostró población SP, y el 6,9% de ALDH
mediados de células mostraron población SP, y sólo el 3,7% de ALDH
Baja células mostraron población SP (Figura 3A). células ALDH
Br exhibieron superposición parcial, y sólo el 1,0% del total de células (7,1% de la población 14,4%) expresaron tanto SP fenotipo celular y ALDH
fenotipo Br (Figura 3A).
A. Resumen de SP y ALDEFLUOR dual ensayo. MCAS células se tiñeron por Hoechst 33342 y se teñirán con BAAA y analizado. Las células se dividieron en tres grupos de acuerdo a la intensidad de ALDH (ALDH
Br (ALDH brillante), ALDH
Mid (medio ALDH), ALDH
Baja (ALDH bajo)), luego se analizaron mediante el ensayo de SP. La relación de ALDH
células Br era 14,4%, y la proporción de células SP era 5,3%. Las proporciones de células SP en ALDH
células Br, ALDH
células de mediana y ALDH
Baja células fueron del 7,1%, 6,9% y 3,7%, respectivamente. La proporción de SP /células ALDH
Br en células totales fue de 1,0%. B. iniciación del tumor de SP /ALDH
Br, SP y ALDH células
Br. 10
2 y 10
3 SP /ALDH
Br, SP y ALDH
células Br derivadas de células MCAS se inocularon por vía subcutánea en las espaldas de los ratones NOD /SCID, y el crecimiento del tumor se midió semanalmente. Los datos representan la media ± SD. Las diferencias entre SP /ALDH
Br y células SP o células ALDH
Br se examinaron para determinar la significación estadística mediante la prueba t de Student. * Los valores de p. Dagas indican los ratones de la muerte debido a un tumor. C. Tinción inmunohistoquímica de ABCG2 y ALDH1. tejidos de carcinoma de ovario estaba manchada por el anticuerpo anti-ABCG2 y el anticuerpo anti-ALDH1. tinción de la membrana de color marrón indica ABCG2 y tinción rosa citoplasma indica ALDH1. El asterisco indica buque, y las flechas indican ABCG2 y las células de carcinoma de ovario de doble positivas ALDH1. Ampliación, × 400.
SP y células ALDH br
tienen una alta capacidad iniciadoras del tumor
El tumor de iniciación de la capacidad de SP y ALDH
Br (SP /células ALDH
Br) se examinó mediante la inyección de 10
3 y 10
2 células, respectivamente, en ratones NOD /SCID. Sorprendentemente, los tumores se iniciaron con 10
ALDH células SP 3 /BR y con tan sólo 10
2 SP /células ALDH
Br en todos los ratones (Tabla 1). Además, los tumores derivados de SP /ALDH
células Br mostraron un crecimiento significativamente más rápido que el de los tumores derivados de células SP y células ALDH
Br (Figura 3B). Estos resultados indican que la ALDH /sup>
Se realizó la tinción inmunohistoquímica para detectar /SP población ALDH
Br en tejido de carcinoma de ovario humano primario. Se utilizó anticuerpo anti-ABCG2 para detectar células SP, ya que se sabe que las células SP para expresar un mayor nivel de ABCG2. Como se muestra en la Figura 3C, las células de cáncer de ovario positiva (ABCG2-positivos y ALDH1-positivo) Dual fueron detectables en tejido de carcinoma de ovario. Curiosamente, existen algunas células doble positivas junto a los vasos, podrían estar indicando /existen células madre cancerosas ováricas CICs en el nicho vascular. Se detectaron células SP /ALDH
Br también de otras células de ovario seroso línea de adenocarcinoma (OVSAHO, OVCAR3 y HTBoA) y una línea de células de endometrio (HEC-1), y las proporciones de SP /ALDH
células Br eran 0,1 % al 0,8% (Figura S1).
SP /ALDH
Br células madre tienen fenotipos celulares
el SP /ALDH población
Br se comparó con otras poblaciones de la esfera ensayo de formación. SP /ALDH
Br, SP /ALDH
Bajo, MP /ALDH
Br y MP /ALDH
Se aislaron células de baja a partir de células del MCAS y se cultivaron en una condición de ultra bajo de unión para la esfera formando ensayo. células SP /ALDH
Br exhibieron una mayor eficiencia de formación de esferas que la de MP /ALDH
Br células y MP /ALDH
Baja células (Figura 4A). La diferencia entre SP /ALDH
Br células y /ALDH
Baja células SP no fue significativa; Sin embargo, las células SP /ALDH
Br tienden a tener una mayor eficiencia de formación de esferas que la de SP /ALDH
Baja células.
A. ensayo de formación de Esfera. Los números de colonias de cuatro fracciones (SP /ALDH
Br, SP /ALDH
Bajo, MP /ALDH
Br y MP /ALDH
Menor) se evaluaron en el día 7. Los datos representan la media ± DAKOTA DEL SUR. Se examinaron las diferencias de significación estadística mediante la prueba t de Student. * Los valores de p. Imágenes representativas de las esferas se muestran (× 100). B. Adipocito ensayo de diferenciación. Las células se cultivaron bajo existencia de ácido trans-retinoico seguido por medio de diferenciación de adipocitos. Se contaron los adipocitos Oli Red O-positivos. Los datos representan la media ± SD. Se examinaron las diferencias de significación estadística mediante la prueba t de Student. * Los valores de p. Imágenes representativas de Oil Red O-tinción se muestran (× 200). Teñidos de rojo indican la diferenciación de adipocitos.
Los CSC /CIC se han descrito para tener pluripotencia [25], de este modo, analizamos la capacidad de diferenciación de los adipocitos de la SP /ALDH
Br células (Figura 4B). SP aislada /ALDH
Br, SP /ALDH
Bajo, MPALDH
Br y MP /ALDH
Bajo población se cultivaron en un estado de diferenciación adypocyte. SP /ALDH
células Br derivadas de células del MCAS revelaron mayor capacidad de diferenciación de los adipocitos en comparación con SP /ALDH
Bajo, MP /ALDH
Br y MP /ALDH
Baja células derivadas de células del MCAS.
CSC /CIC son resistentes a la quimioterapia [4], de este modo, analizamos resistencia a los medicamentos de la SP /ALDH
Br células. Desde el cisplatino es un medicamento clave para la quimioterapia de carcinoma de ovario, se utilizó el cisplatino. SP aislada /ALDH
Br, SP /ALDH
Bajo, MPALDH
Br y MP /ALDH
Bajo población se cultivaron en una existencia de cisplatino. SP /células ALDH
Br significativamente mayor resistencia a cisplatino en comparación con SP /ALDH
Baja células, MP /ALDH
Br células y MP /ALDH
Baja células. Y, MP /ALDH
Baja células mostraron mayor sensibilidad al cisplatino (Figura 5A).
A. ensayo de viabilidad celular. Las células se cultivaron bajo existencia de cisplatino diluido en serie. Las células viables fueron analizados por WST-1 kit. El eje Y indica la viabilidad de las células. Los datos representan la media ± SD. Se examinaron las diferencias de significación estadística mediante la prueba t de Student. * Los valores de p. B. Análisis de la qPCR. La expresión de marcadores de células madre se examinó utilizando SP /ALDH
Br, SP /ALDH
, MP /ALDH
Br y MP /ALDH
Baja células Bajos. Los datos representan la media ± SD. Los asteriscos indican diferencias significativas. * P & lt; 0,05. t-test. C.
Sox2
caída suprimir las expresiones de
ALDH1A1
y
ABCG2
.
Sox2
ARNm fue atropellado por siRNA. Dos días después de la transfección de siRNA Sox2, las expresiones de
ALDH1A1
y
ABCG2
fueron investigados por RT-PCR.
GAPDH
se utilizó como control interno. Control de siRNA (si-Cont) las células transfectadas se utilizaron como control negativo. D. Sox2 derribar a suprimir el tumor-iniciación.
Sox2
ARNm fue atropellado por siRNA. Diez mil si-SOX2 y controlar siRNA células transfectadas (si-Cont) se inocularon por vía subcutánea en las espaldas de los ratones NOD /SCID, y el crecimiento del tumor se midió semanalmente. Los datos representan la media ± SD. Las diferencias fueron examinados para la significación estadística mediante la prueba t de Student. * P valores.
Para analizar las características moleculares de SP /ALDH
Br población, se realizó qPCR (Figura 5B).
ABCG2
ARNm se expresó preferentemente en SP /ALDH
Br y células SP /ALDH
Baja células.
ALDH1A1
se expresó en SP /ALDH
Br células y células MP /ALDH
Br. Estos perfiles de expresión son consistentes con el hecho de que el fenotipo de células SP depende de la expresión de
ABCG2
y el fenotipo de células ALDH
Br depende de la expresión de
ALDH1A1
.
Sox2
ARNm se expresó en nivel más alto en células /ALDH
Br SP pero no en SP /ALDH
Baja células, MP /ALDH
células Br o MP /ALDH
Baja células (Figura 5B), lo que indica que el SP /población ALDH
Br incluye preferentemente una población de células madre. Desde Sox2 tiene un papel en el mantenimiento de las células madre cancerosas de pulmón /CIC [26], se determinó la relación de
Sox2 Opiniones y expresiones de
ABCG2
y
ALDH1A1
. Las expresiones de
ABCG2
y
ALDH1A1
se redujeron en
Sox2
ARNm derribado células (Figura 5C). Por otra parte, Sox2 derribado células tumorales mostraron menor a la iniciación a la de las células transfectadas con siRNA MCAS de control (Figura 5D). Por lo tanto, estos resultados sugieren que la SP /ALDH población
Br expresan alto nivel de genes de células madre
Sox2
, que puede tener papel en el mantenimiento de los CAC /CIC y las expresiones de
ABCG2
y
ALDH1A1
.
Los niveles de expresión de CD44, un marcador de células madre cancerosas ováricas representante /CIC [27], [28], fue similar en todas las poblaciones (Figura 5B). Por ello, investigó la relación de células SP,
Br células y CD44-positivas (CD44
+) las células ALDH. La proporción de CD44
+ células fue de 8,0%. La relación de SP /CD44
+ población superposición era 0,9%, y la relación de ALDH
Br /CD44
+ superposición población era de 3,3%. Además, la relación de SP /ALDH
Br /CD44
+ población superposición fue 0,4% (Figura 6).
células MCAS se tiñeron por Hoechst 33342 tinte, BAAA y anti-CD44 de anticuerpos, y analizado. Las proporciones de SP, ALDH
Br, CD44
+, SP /ALDH
Br, SP /CD44
+, ALDH
Br /CD44
+ y SP /ALDH
br /CD44
+ células fueron 5,3%, 14,4%, 8,0%, 1,0%, 0,9%, 3,3% y 0,4%, respectivamente.
Discusión
La concepto de los CAC /CIC se propuso hace mucho tiempo [29]. leucemia de células madre se han aislado de las células leucémicas aguda [30], [31], y la primera población CSC /CIC fue aislado de carcinoma de mama con la combinación de CD44 y CD24 expresión [32]. En las siguientes obras, CSC /CIC se aislaron con éxito en varios tumores malignos. Sin embargo, ya que los mecanismos moleculares de las CSC /CIC siguen siendo difíciles de alcanzar, marcadores precisos para los CAC /CIC son todavía desconocidos. Por lo tanto, aún se necesitan mejoras en los métodos para el aislamiento de CSC /CIC.
Se han reportado métodos de combinación con marcadores dobles o triples y con marcadores y ensayo de ALDEFLUOR. Las poblaciones de ALDH
Br y CD44
+ /CD24
- células mostraron superposición parcial, y la ALDH
Br /CD44
+ /CD24
- población mostraron mayor del tumor iniciadoras capacidad que la de la ALDH
Br población o CD44
+ /CD24
- población [17]. La ALDH
Br /CD44
+ de la población y ALDH
Br /CD133
+ población derivada de carcinoma de colon primaria humana exhibió mayor capacidad iniciadoras del tumor que el de ALDH
Br, CD44
+ y CD133
+ poblaciones [33]. Estos hallazgos indican que la expresión de marcadores de CSC /CIC están parcialmente solapadas y que la población solapada es altamente enriquecido con CSC /CIC. De hecho, nuestros resultados también mostraron superposición similar de ALDH
Br células y las células SP, y la población de solapamiento exhibieron mayor capacidad iniciadoras del tumor. En un estudio de cáncer de ovario, células ALDH
Br eran más enriquecidas en CD44
+ células que en uso de las CD133
+ células [23], pero la ALDH
Br y CD44
+ superposición fue parcial. Se identificaron SP /ALDH
Br /CD44
+ población superposición de las células del MCAS (Figura 6). Por lo tanto, el uso de la población de solapamiento de SP /ALDH
Br /CD44
+ células puede ser un mejor enfoque para identificar las poblaciones CSC /CIC.
células madre del glioma se han descrito para diferenciarse en endotelial las células [34]. células madre methotelioma maligno se han descrito para diferenciarse en células endoteliales, células neurales y adipocitos [25].