Extracto
glutaminasa Un trabajo reciente ha puesto de relieve (GLS) como un jugador clave en el metabolismo de las células cancerosas, proporcionando glutamina derivado de carbono y nitrógeno a las vías que apoyan la proliferación. Existe un interés significativo en la orientación de GLS para la terapia del cáncer, aunque el gen no se sabe que está mutado o amplificado en tumores. Como resultado, se necesita identificación de marcadores tratables que predicen GLS dependencia para la traducción de los inhibidores de GLS a la clínica. En este documento se valida un inhibidor de molécula pequeña de GLS y muestran que las células de cáncer de pulmón de células no pequeñas marcadas por la baja de E-cadherina y alta expresión de vimentina, características de un fenotipo mesenquimal, son particularmente sensibles a la inhibición de la enzima. Además, las células de cáncer de pulmón inducidas a sufrir transición epitelial a mesenquimal (EMT) adquieren sensibilidad al inhibidor de GLS. Estudios metabólicos sugieren que las células mesenquimales tienen una capacidad reducida para la fosforilación oxidativa y una mayor susceptibilidad al estrés oxidativo, haciéndolos incapaces de hacer frente a las perturbaciones inducidas por la inhibición de GLS. Estos hallazgos aclaran dependencias metabólicas selectiva de las células mesenquimales de cáncer de pulmón y sugieren nuevas vías como objetivos potenciales de este tipo de cáncer agresivo
Visto:. Ulanet DB, Couto K, Jha A, Choe S, Wang A, Woo HK, et al. (2014) Las células mesenquimales fenotipo predispone a cáncer de pulmón a la alteración de la proliferación y el estrés redox en respuesta a la inhibición glutaminasa. PLoS ONE 9 (12): e115144. doi: 10.1371 /journal.pone.0115144
Editor: Pier Giorgio Petronini, Universidad de Parma, Italia |
Recibido: 16 Julio, 2014; Aceptado: 19 Noviembre 2014; Publicado: December 12, 2014
Derechos de Autor © 2014 Ulanet et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Todo el trabajo fue financiado por Agios farmacéuticos. Los proveedores de fondos, a través de sus empleados, que son los autores de este manuscrito, tuvieron un papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, y la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores son todos empleados de Agios productos farmacéuticos. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
Se ha apreciado desde hace 60 años que la glutamina (Gln) es un aminoácido condicionalmente esencial para el crecimiento de las células cancerosas en cultivo [1]. La glutamina es el más abundante de circulación de aminoácidos en los seres humanos a una concentración de ~ 500 M en el suero, y muchos estudios indican que Gln es una fuente principal de carbono y nitrógeno para las células tumorales [2], [3]. Una enzima en particular, glutaminasa, se localiza en la mitocondria y parece ser crítica para la entrada de carbono glutamina en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA) en muchas células cancerosas [4], [5]. La glutamina se convierte en glutamato y amoníaco por la glutaminasa, y el carbono glutamato se transportó a continuación en el ciclo de TCA a través de la conversión a alfa-cetoglutarato (α-KG) por varias enzimas diferentes, incluyendo glutamato deshidrogenasa y diversas aminotransferasas. Mamíferos llevan dos genes que codifican la glutaminasa mitocondrial,
GLS1 gratis (o KGA) y
GLS2 gratis (o LGA), los cuales fueron identificados inicialmente en riñón normal y el hígado, respectivamente [6]. La
GLS1
gen produce dos empalme predominante variantes que codifica GLS1 canónica (también conocido como KGA) y GAC, sin embargo las funciones diferenciales de estas dos variantes no son bien entendidos [7].
Varios elegante estudios han ilustrado la contribución de carbono derivado de Gln en el ciclo de TCA a través de glutaminolysis [8], [9].
GLS1
expresión también ha sido identificado como un objetivo del oncogen myc [10] y se ha implicado como un efector de la transformación mediada por Rho en líneas celulares de cáncer de mama [11]. La interferencia con la actividad de GLS través de la manipulación, ya sea genética o farmacológica ha sido demostrada por un número de grupos de afectar negativamente el crecimiento de las líneas de selección de células de cáncer [11] - [13]. Sobre la base de la totalidad de los datos publicados sobre la importancia de Gln y glutaminasa en el cáncer, GLS se ha destacado como una diana terapéutica potencial para indicaciones oncológicas [14]. Por lo que sabemos
GLS1
no está mutado o amplificado en los cánceres humanos. Con el fin de facilitar el uso de los inhibidores de GLS1 en la clínica se requiere una mejor comprensión de los contextos genéticos y fenotípicos que impulsan la dependencia de GLS1.
En este estudio se valida la actividad basada en células en blanco de una publicado inhibidor GLS1, BPTES (bis-2- (5-fenilacetamido-1,2,4-tiadiazol-2-il) sulfuro de etilo) [15], mostrando que actúa específicamente a través de un mecanismo dependiente de GLS1 para inducir anti-proliferativa y perturbaciones metabólicas en las células. Utilizamos BPTES como un compuesto de herramienta validada para detectar un panel de líneas de cáncer de pulmón y de identificar un subconjunto de líneas que muestran la dependencia de GLS y expresar marcadores característicos de un fenotipo mesenquimal. TGF-β mediada por la inducción de la EMT células a la inhibición GLS sensibilizada y se asocia con una alteración de la capacidad respiratoria mitocondrial y una mayor sensibilidad al estrés oxidativo. Estos resultados apuntan a un papel selectivo para GLS en las células NSCLC mesenquimales, que utilizan GLS para proporcionar una fuente de carbono para la fosforilación oxidativa y para mantener el equilibrio redox necesario para la proliferación celular.
Resultados
Línea celular pantalla del panel y la validación de BPTES como un compuesto de herramienta
Para obtener una perspectiva de los determinantes /fenotípicas genéticos de la dependencia GLS, que exhibió un panel de líneas de células con el inhibidor publicada GLS1 BPTES [15]. Nos centramos específicamente en un tipo de tumor, el cáncer de pulmón, debido a la gran cantidad de modelos de líneas celulares establecidas disponibles. De las 62 líneas pulmonares seleccionadas para el análisis utilizando BPTES, 44 han sido clasificadas como NSCLC (S1 S2 en la tabla de archivos). tasas de crecimiento relativo (mu_
BPTES /mu_
DMSO) se calcularon después del tratamiento de drogas con el fin de comparar mejor sensibilidad en relación con BPTES entre las líneas celulares que variaban en el tiempo de duplicación. Aproximadamente el 30% de estas 62 líneas exhibió una sensibilidad significativa a BPTES como se define por & gt; 40% de reducción en la tasa de crecimiento (Fig 1A, S1 Tabla en S2 del archivo.). El grado de sensibilidad a la BPTES era muy variada, con la muerte celular evidentes en algunas líneas celulares (μ
BPTES /μ
DMSO & lt; 0; por ejemplo, A427) y una falta casi completa de la respuesta en otros (por ejemplo, NCI H1563). Desde CellTiter-Glo (CTG), que mide los niveles de ATP, se utilizó como un método rápido, sustituto para la detección de número de células después del tratamiento BPTES, se validó que los efectos de la inhibición de la glutaminasa en los niveles de ATP celular se una lectura representativa del número de células. Evaluación del número de células por el contenido de ADN (Syto60) demostró un efecto comparable de tratamiento BPTES sobre la proliferación celular como se indica por CTG en el punto final 72 hr (S1 Figura S1 en File).
Sensibilidad
(A) de un panel de líneas de NSCLC a la inhibición del crecimiento de 10 micras BPTES en un ensayo de proliferación de 72 hr. Las tasas de crecimiento (MU) representan gráficamente en relación con el control de DMSO para cada línea celular (mu /max). (B, C) células A427 parentales o células que expresan de forma estable un control de vector vacío (Con), de tipo salvaje GAC (GAC), o una enzima GAC BPTES resistente (GAC-BR) fueron tratados con las concentraciones indicadas de BPTES (A ) o el análogo inactivo BPTES, AGX-4769 (C), en un ensayo de proliferación de 72 hr. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes con media y desviación estándar indicadas. (D, E) Medición de isotopomer etiqueta
13C (5) Glu (D) o
13C (4) Asp (E) a partir de células tratadas durante 4 h con BPTES o con análogo inactivo AGX-4769. Los resultados son la media de tres réplicas con la desviación estándar indicada. p-valores calculados a partir de test t de Student,
* (3 × 10
-8),
** (10
-9),
#(10
-7 ),
## (2 × 10
-6).
con el fin de confirmar que los efectos de BPTES sobre las células están en el objetivo, hemos diseñado las células A427 a una sobreexpresión de ADNc que codifica una resistente BPTES GAC mutado previamente descrito, llamado GAC-BR (F318A y F322A) y se evaluó el efecto de BPTES sobre el crecimiento celular de estas células en comparación con células que sobreexpresan de tipo salvaje GAC (GAC-WT) o un vector vacío. GAC-BR es incapaz de unirse BPTES pero mantiene la actividad catalítica [16]. La sobreexpresión de GAC-BR rindió las células A427 resistentes a los efectos inhibidores del crecimiento de BPTES (Fig. 1B) mientras que las células que expresan el vector vacío o GAC-WT conservaron la sensibilidad significativa a BPTES. El efecto modestamente romo de BPTES en el crecimiento de la GAC-WT en comparación con las líneas que expresan vector paterno o vacíos es probablemente debido al aumento en la expresión ~2x GAC en este modelo. También usamos este sistema para hacer frente a los efectos sobre la diana de BPTES en la modulación de la síntesis de novo de glutamato y aspartato de la glutamina. S2 Figura (en S1 File) pone de manifiesto el flujo de carbono a partir de glutamina a glutamato y TCA aguas abajo intermedios como se ha descrito [8], [9]. La sobreexpresión de GAC-BR, pero no GAC-WT, mejoró el bloque inducida BPTES en glutamina fluya hacia el glutamato y el aspartato (Fig. 1D, E). La restauración incompleta de
13C (5) niveles de aspartato pueden reflejar la sensibilidad particular de este metabolito a la inhibición de GLS, tal vez debido a la aportación de carbono y nitrógeno de la glutamina en aspartato biosíntesis y /o debido a los efectos de la inhibición de la la actividad GLS1 endógeno. Un análogo BPTES bioquímicamente inactivo, AGX-4769, con una modificación conservadora (Figura S1 S3 en archivos), fue utilizado para tratar las mismas líneas celulares y no tuvo efectos sobre la proliferación o aguas abajo metabolitos (Fig. 1C-E). Estos datos indican que los efectos de BPTES sobre la proliferación y la modulación de los metabolitos intermedios, se ha debido a la inhibición de GLS1 y no debido a efectos fuera de la meta.
Como otro medio de validar la utilidad de BPTES como un compuesto de herramientas a la pantalla para la dependencia de GLS, se realizó siRNA mediada desmontables de GLS1 (total o GAC específicamente) en un subconjunto de 6 de las líneas de NSCLC del panel. Todas las 3 líneas que eran sensibles a BPTES también fueron sensibles a GLS KD, mientras que el 3 que no fueron sensibles a BPTES eran menos /no sensibles (Figura S4 en S1 Archivo). Mientras KD de CAG solo resultó en la inhibición del crecimiento sustancial en las líneas sensibles BPTES, KD del total de GLS1 dio lugar a un deterioro aún más profundo que indica que ambas isoformas de GLS1 (KGA y GAC) contribuyen al crecimiento /viabilidad de estas células.
GLS1 la dependencia en el CPNM con un mesenquimal (EMT) fenotipo
sobre la base de la gama de sensibilidad BPTES observado a través de las líneas celulares 62 (Fig. 1), se realizaron búsquedas de marcadores transcripcionales que asocian con la sensibilidad o resistencia utilizando un conjunto de datos a disposición del público desde el Instituto Broad (https://array.nci.nih.gov/caarray/project/golub-00327). Es de destacar que ninguno de GLS1 ni ARNm GLS2 niveles de expresión correlacionada con la sensibilidad. Los 200 mejores sondas que muestran la mayor correlación significativa con la sensibilidad fueron luego sometidos a análisis de vías GeneGo (http://portal.genego.com/cgi/data_manager.cgi). Observamos que no hay caminos relacionados con el metabolismo se asociaron fuertemente con BPTES capacidad de respuesta, lo que indica que las diferencias intrínsecas en el metabolismo entre las células sensibles y resistentes no se reflejan en líneas generales a nivel de transcripción (Tabla S2 en File_S2). Curiosamente, 4 de las 25 vías estaban relacionados con la EMT (filas 1, 15, 23, 25; Fig. 2A). las vías de respuesta inmune también fueron altamente representados en este análisis. Si bien se optó por centrarse nuestras investigaciones sobre la relación entre la EMT y la dependencia GLS1, es notable que un vínculo entre la actividad de la glutaminasa NF-KB y se ha demostrado por otros [11], [17].
(A ) análisis GeneGo indicando cuatro firmas mesenquimales de alto rango que correlacionan con la sensibilidad BPTES. P-valores se calculan dentro del software GeneGo utilizando la distribución hipergeométrica. (B) Anti-alta correlación entre la E-cadherina baja vimentina niveles de expresión de ARN y la sensibilidad a BPTES. (C) mU /mumax valores representados después de un tratamiento de 72 horas de líneas de NSCLC con 10 mM BPTES. cantidades iguales de proteína de los extractos de línea de células tumorales se sometieron a electroforesis, con el grupo de líneas más sensibles a la izquierda y menos sensibles a la derecha, y la inmunotransferencia de las proteínas indicadas. Histona H3 se utilizó como control de carga. (D) La cuantificación de los niveles medios de proteína GAC en relación con la expresión de proteína PC (+/- SEM) en BPTES sensibles (n = 7), intermedios (n = 7), e insensibles (n = 7) líneas.
P = 0,03
comparación de los niveles de proteína /PC GAC en minúsculas en comparación con las líneas insensibles;
P = 0,06
la comparación sensible a los grupos intermedios (no pareada 2-cola t-test).
Con el fin de identificar marcadores específicos de predicción de la sensibilidad BPTES, que probaron la lista de forma significativa sondas correlacionados desde el análisis anterior de los distintos genes relacionados con la EMT. E-cadherina y vimentina se positiva y negativamente correlacionada con el crecimiento en presencia de BPTES (es decir, falta de sensibilidad a la inhibición GLS), respectivamente (Fig. 2B). Bajo E-cadherina /alta vimentina son marcadores de células que tienen un fenotipo mesenquimal [18] bien definido. Existe una correlación significativa se observó también para varios otros genes modulados típicamente durante EMT, incluyendo claudin4 /7 y ZEB1 (Tabla S3 en File_S2). Después de la pantalla inicial BPTES, un subconjunto de 21 de las líneas de NSCLC se volvió a examinar la sensibilidad BPTES y se analizaron para los niveles de expresión de proteínas de marcadores seleccionados identificados en el análisis de perfiles de transcripción (Fig 2C, D;. Tabla S4 en File_S2). En 6/7 de las principales líneas de NSCLC sensibles, bajo E-cadherina y altos niveles de proteína vimentina se observaron de forma reproducible (Fig. 2C). El grupo de líneas sensibles también se caracterizaron por una relación promedio más alto de los niveles de proteína GAC /piruvato carboxilasa (PC) (Figura 2C, D;.
P
= 0,03). Resultados similares se obtuvieron comparando los niveles totales de GLS1 /PC. Elegimos a centrarse en los niveles GAC ya que esta isoforma predominante en la mayoría de las células cancerosas. los niveles de proteína PC solo fueron significativamente elevados en el insensibles frente a las líneas sensibles (
P
= 0,02) y los niveles de mRNA correlacionados negativamente con la sensibilidad BPTES en el panel más grande de líneas de cáncer de pulmón 60+ apantallados (factor de correlación de Pearson: 0,29 ; Pearson
valor de p
: 0,03). Desde la piruvato carboxilasa puede sustituir a la glutaminasa en la prestación de carbono al ciclo TCA [19], la asociación de relaciones GAC /PC alterados con sensibilidad a la inhibición GLS sugiere la posibilidad de que los modos alternativos de entrada de carbono a la TCA pueden influir en la dependencia GLS.
Curiosamente, las tres líneas de NSCLC que eran más sensibles a BPTES (A427, LXF289, SW1573) toda llevar a la activación de mutaciones en β-catenina (T41A en A427 y LXF289, S33F en SW1573, Tabla S4 en File_S2). señalización /β-catenina Wnt es una de varias vías que han sido implicados en la conducción de EMT [20]. Como resultado, hemos utilizado siRNA mediada desmontables de β-catenina en las células A427 para determinar si la pérdida de daría lugar a un cambio en la sensibilidad a BPTES. Sorprendentemente, desmontables β-catenina dio lugar a una sensibilidad reducida al tratamiento BPTES (Fig. 3A). Curiosamente, la reducción en los niveles de proteína β-catenina fue acompañado por un aumento en los niveles de E-cadherina (Fig. 3B), como se ha descrito previamente en las células de cáncer de vejiga [21]. En ausencia de tratamiento BPTES, β-catenina KD resultó en una modesta. (Disminución del 23%;
P
= 0,02) deterioro en el crecimiento celular (Fig. 3A)
(A) A427 las células fueron transfectadas con la orientación no-(NT) o β-catenina de orientación siRNAs y tratados con las concentraciones indicadas de BPTES (panel izquierdo). Las tasas de crecimiento se normalizaron a las células tratadas DMSO transfectadas con siRNAs NT. El panel derecho representa los efectos de los siRNAs β-catenina en el crecimiento de las células tratadas DMSO. (B) inmunotransferencia de extractos de proteínas de las células A427 recogieron 72 horas después de la transfección. células (C) NCI-H358 se trataron con 25 ng /ml de TGF-ß durante 4 semanas. La inducción de la EMT fue confirmada por la pérdida de E-cadherina y el aumento de la vimentina. EMT fue acompañado por un aumento en GAC en relación con los niveles de proteína PC (resultados representativo de 2 experimentos independientes). los niveles de actina indicados para la normalización de la proteína. células tratadas TGF-ß parentales y 6wk (D) del NCI-H358 fueron tratados por triplicado con BPTES durante 72 horas y el crecimiento celular evaluados por CTG. Los resultados son representativos de 3 experimentos independientes y se representan como tasas de crecimiento promedio (+/- SD) en comparación con las células tratadas DMSO.
EMT inducida por TGF en células NCI-H358 NSCLC conduce a la dependencia GLS1
con el fin de comprender mejor la contribución de mesenquimales frente fenotipo epitelial a GLS dependencia, se trataron las células NCI-H358, que son fenotípicamente epitelial (alta e-cadherina /baja vimentina) y que presentan una sensibilidad moderada a BPTES (fig. 2C), con TGF para inducir la EMT. Como se ha informado [22], TGF desplaza la línea NCI-H358 a un fenotipo mesenquimal como se demuestra por una disminución de la E-cadherina y vimentina elevada (Fig. 3C). En particular, los niveles de proteína GAC también se vieron afectadas durante esta transición, con un incremento de 2 veces en los niveles de proteína en la variante mesenquimales (Fig. 3C). En contraste, los niveles de PC se redujeron ligeramente (disminución 1,4x) en EMT, resultando en un aumento de la relación GAC /PC (Fig. 3C). Curiosamente, concomitante con el aumento en la expresión GAC, los niveles de la isoforma expresada KGA menos prominente disminuyó (~ 40%) tras la EMT. La regulación y la función diferencial de potencial de las diferentes isoformas GLS1 sigue siendo poco clara. De acuerdo con el modelo que predice carácter mesenquimales GLS1 dependencia, las células mesenquimales NCI-H358 tratadas con TGF mostraron una mayor sensibilidad a la significativamente BPTES en relación con las células no tratadas (Fig. 3D). La línea tratado con TGF tenía una tasa de crecimiento reducida 1,5-2 veces en comparación con la línea parental, aunque desde el panel más grande de líneas proyectadas, no había correlación entre la tasa de crecimiento y la sensibilidad a BPTES. Estos datos, combinados con el análisis de expresión del panel de línea celular, sostiene firmemente que las células de cáncer de pulmón mesenquimales están predispuestos a la dependencia de GLS1.
Desde glutaminasa sirve como un regulador clave de la entrada de carbono a la glutamina TCA, se preguntó si la inhibición de GLS1 afecta diferencialmente la fosforilación oxidativa (fosforilación oxidativa) en el epitelio mesenquimal en comparación con la línea (NCI-H358_M). el consumo de oxígeno mitocondrial se midió en tiempo real después del tratamiento BPTES. Al inicio del estudio, O
2 tasa de consumo (OCR) no fue significativamente diferente entre las dos líneas (Figura S5A en S1 Archivo). Después de 2 h de tratamiento con BPTES, OCR se redujo comparable en las líneas epiteliales y mesenquimales en comparación con las células tratadas DMSO (Fig 4A;. S5B figura en S1 File). En particular, con el aumento de tratamiento post-BPTES tiempo, el OCR en la línea parental se recuperó lentamente, mientras que OCR continuó disminuyendo con el tiempo en las células NCI-H358_M (Fig. 4A, S5B figura en S1 File). La disminución de OCR no era un reflejo de la disminución del número de células en este punto de tiempo temprano (20 hr) (Figura S5C en S1 Archivo). Para confirmar que este efecto de la inhibición de GLS no es exclusivo de las células NCI-H358 se realizó el mismo experimento en un par adicional de sensibilidad (NCI-H1703) y las células insensibles (NCI-H1563). La inhibición de la O
2 el consumo era muy selectivo para la línea GLS1 dependiente del NCI-H1703 (Fig. 4B) lo que sugiere que el deterioro de la fosforilación oxidativa es un componente de los efectos antiproliferativos inducida por la inhibición de GLS.
(a) NCI-H358 epiteliales y mesenquimales líneas o (B) NCI-H1703 (BPTES sensible) y NCI-H1563 células (BPTES minúsculas) fueron tratados con DMSO o 8 M BPTES y la tasa de consumo de oxígeno (OCR) se controló durante un 20 tratamiento hr. Los datos normalizados a OCR en el tiempo cero (100%) y se presentan como valores medios +/- SEM.
P = 0,024
comparando los cambios en el consumo de oxígeno con BPTES en el epitelio mesenquimal vs línea;
P = 0,00017
comparando células NCI-H1703 y H1563-NCI. (C) OCR después del tratamiento con los fármacos indicados para perturbar la respiración mitocondrial. Los datos normalizados a la medida antes de OCR oligomicina tratamiento. (D) La adición de piruvato a los medios de comunicación restaura el deterioro de la respuesta FCCP en la línea mesenquimales. Los valores promedio +/- SEM indicó. Resultados representante de 2-3 experimentos independientes.
El impacto diferencial de BPTES sobre la respiración mitocondrial en la línea de frente mesenquimal epitelial nos llevó a cuestionar si estas líneas pueden diferir de manera más amplia en su capacidad para responder de manera adaptativa a metabólica /mitocondrial estrés. Para explorar esta posibilidad, se realizó un tratamiento secuencial de células con oligomicina (ATP sintasa), FCCP (desacopla la respiración de la síntesis de ATP, permite la evaluación de la respiración máxima), y la rotenona (inhibe la entrada de electrones en el Complejo I) [23]. Sorprendentemente, las células NCI-H358_M eran defectuosas en el aumento de O
2 consumo en respuesta a FCCP, indicativo de una capacidad respiratoria inferior de estas células (Figura 4C;. S5D Figura S1 en el archivo). Recientemente, se demostró que se requiere para la estimulación de piruvato de máxima OCR en células de cáncer de mama [24]. Curiosamente, la suplementación adicional de los medios de comunicación RPMI (que contiene glucosa 11 mM y glutamina 2 mM) con piruvato 2 mM en presencia de inhibidores mitocondriales restauró la capacidad de las células NCI-H358_M para responder a FCCP con un aumento del OCR (Fig. 4D) , lo que indica que estas células pueden ser incapaces de utilizar eficazmente materiales endógenos de piruvato /otras fuentes de carbono alternativa para alimentar adecuadamente su capacidad respiratoria de reserva. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la transición a un estado mesenquimales puede resultar en un deterioro de la capacidad para responder de manera adaptativa a la inhibición de GLS y potencialmente a otros tipos de estrés mitocondrial.
A continuación se probó si las fuentes alternativas de carbono también podrían rescatar a la alteración el crecimiento de las células NCI-H358_M después del tratamiento BPTES. La adición de cualquiera de piruvato de sodio o un análogo permeable celular de α-KG, dimetil-2-oxoglutarato (m-αKG), al medio de crecimiento dio como resultado un rescate de la proliferación a ~85-90% de la observada en las células tratadas con vehículo, en comparación a ~ 45% de succinato de dimetilo (Fig. 5). A diferencia de αKG y piruvato, succinato a nuestro conocimiento no se ha informado que tienen propiedades anti-oxidantes. Desde el glutamato derivado de glutamina puede alimentar en el glutatión (GSH) ruta biosintética y contribuir a mantener el equilibrio redox [25] (así como alimentando el TCA a través de la conversión a a-KG) que también examinó el efecto de un derivado permeable celular de GSH éster etílico del glutatión reducido (GSH-MEE), y el antioxidante N-acetilcisteína (NAC) en la inhibición del crecimiento inducida BPTES. Tanto GSH-MEE y NAC sola restauración del crecimiento a ~75-85% la de las células tratadas con vehículo mientras que la combinación de piruvato y NAC restauró la proliferación a cerca de 95% de las células control (Fig. 5). Estos hallazgos sugieren que las alteraciones en tanto el estrés y el ciclo TCA redox anaplerosis contribuyen a los efectos antiproliferativos de la inhibición de GLS en estas células.
células NCI-H358_M fueron tratados con DMSO o 8 M BPTES, por triplicado, en presencia o ausencia de dimetil 2-oxoglutarato (m-α-KG), piruvato de sodio, succinato de dimetilo, éster etílico del glutatión reducido (GSH-MEE), o N-acetilcisteína (NAC) durante 96 horas y el crecimiento celular se midió por CTG. Resultados representativos de 2 experimentos independientes. Los valores representan media de tasa de crecimiento +/- SD respecto a las células tratadas con DMSO solo.
Los valores P
que comparan el tratamiento DMSO vs BPTES con las diversas condiciones de rescate:
P = 0,0001
(sin rescate),
P
= 0,04 (m-α-KG),
P = 0,001
(piruvato 2 mM),
P = 0,0003
(m-succinato),
P = 0,01
(GSH-MEE),
P
= 0,003 (NAC),
P = 0,06
(piruvato + NAC).
con el fin de dilucidar el mecanismo subyacente a la sensibilidad diferencial de la epiteliales y mesenquimales NCI H358 células a GLS inhibición, se realizó un análisis del metabolismo de estas células, el examen de los patrones de glutamina y glucosa (Glc) utilización (Glc etiquetado esquemática representada en S6 figura (en S1 de archivos) y los efectos de la inhibición de GLS. en primer lugar confirmó que BPTES fue la inhibición comparable GLS en ambas de las líneas mediante el control
13C (5) Gln y
13C (5) niveles de Glu por LCMS en las células alimentadas con uniformemente marcado
13C-Gln (U
13C-Gln). Con
13C (5) Glu /
13C (5) los niveles de Gln como una lectura para la actividad de GLS, que demostraron una inhibición eficaz (97%) de la actividad de GLS en tanto epitelial y mesenquimal líneas (Fig. 6A; Figura S7 en S1 File). Estos datos indican que la gran mayoría de la conversión de Gln a Glu en estas líneas celulares es catalizada por GLS1 y no GLS2 u otras enzimas que utilizan Gln. Una hipótesis para explicar la potencial sensibilidad diferencial de las dos líneas fue que las células mesenquimales pueden utilizar preferentemente glutamina para alimentar el TCA. Sorprendentemente, una alimentación de 4 hr de células con U-
13C-Gln demostró contribución sustancial de glutamina para piscinas de citrato, tanto en el epitelio (63%) y mesenquimales (49%) de la línea (Fig. 6B). En consonancia con la contribución destacada de glutamina para piscinas citrato, un 20 hr BPTES tratamiento redujo los niveles totales de metabolitos TCA, incluyendo α-KG y citrato (Fig.6C; S7 Figura S1 en el archivo). Se observó poco o ningún efecto de la droga en el número de células dentro de este tiempo de tratamiento BPTES en estos (S5C figura en S1 de archivos) y otras líneas celulares sometidas a prueba (S1 Figura S1 en File). A pesar del hecho de que la glutamina contribuyó más prominente a las piscinas de citrato en el epitelial en comparación con la línea mesenquimal (Fig. 6B), los niveles de citrato cayeron más dramáticamente y a inferior (61%) los niveles totales en el BPTES células tratadas NCI-H358_M. Tomados en conjunto con el aumento de la caída de la O
2 consumo por BPTES en el mesenquimales en comparación con la línea epitelial, estos datos sugieren un deterioro potencial en la capacidad de la línea mesenquimales para adaptarse a un bloque de flujo de Gln en el TCA, tal vez debido a una capacidad diferencial de usar fuentes de carbono alternativas en esta configuración.
NCI-H358 epitelial (e) y las líneas mesenquimales (M) se trataron con DMSO o 8 M BPTES durante 20 horas. Las células eran o no marcado o U
13C-Glc o U
etiquetas 13C-Gln se incluyeron desde hace 4 horas de tratamiento contra las drogas y los niveles de metabolitos centrales de carbono se midieron mediante LCMS. (A) La inhibición de la actividad de GLS por BPTES. (B) Porcentaje de piscina citrato que es ya sea sin etiqueta o con un contenido de carbono derivado de U-
(células tratadas DMSO) 13C-Gln. (C) metabolito TCA y tamaños de agrupación de glutatión +/- BPTES. Los datos se recogieron triplicado o cuadruplicado de 3 experimentos independientes (por α-KG y citrato) y representa los niveles como media +/- SD en relación con NCI-H358 DMSO células tratadas; Los valores se normalizaron para el número de células;
P *
= 1 × 10
-5; ** 4 × 10
-6; *** 9 × 10
-8 porcentajes (D) Citrato de isotopomer
13 C (6) -Glc células marcadas tratados +/- BPTES. *
P = 0,001
, **
P = 0,002
comparando% de citrato m + 2 en DMSO o BPTES tratada E frente a las células M, respectivamente. (E) Las alteraciones en las proporciones relativas de DHAP y 3PG niveles en células EVSM +/- BPTES.
Los valores P
para la comparación de los niveles de metabolitos +/- 0,1 BPTES: *, ** 0,57,
#0,04,
## 0.07. Resultados representativos de 2 experimentos independientes.
Curiosamente, el control de flujo de glucosa en el TCA utilizando un U-
13C-Glc alimentación (Figura S7 en S1 de archivos), reveló aporte de glucosa al 28% y 37% de la piscina citrato total de en las células epiteliales y mesenquimales, respectivamente; tras el tratamiento BPTES, esta contribución relativa se redujo a 15% en el epitelial y 3% en la línea mesenquimal (Fig 6D;. Figura S7 en S1 File), indicativo de un bloqueo selectivo del flujo de glucosa en el TCA con el tratamiento BPTES en el línea mesenquimales. En consonancia con esta idea, el examen de glucolíticas tamaños de grupos intermedios indicó incremento de DHAP y redujo 3-PG niveles (Figura 6E;. S7 figura en S1 de archivos) con el tratamiento BPTES en la línea mesenquimales, lo que indica un bloqueo en el flujo en este paso de la glucólisis.
Además de las diferencias en los metabolitos implicados en las vías bioenergéticas /biosintética, las células NCI-H358_M habían reducido inferior glutatión (GSH), tanto en la basal y BPTES tratado ajuste en comparación con la variante epitelial (figura 6C.; Figura S7 en S1 File). En 6 líneas de NSCLC adicionales examinados, hubo una tendencia similar entre el grado de caída en las piscinas de GSH con sensibilidad BPTES (S8A figura en S1 de archivos), que nos lleva a investigar los efectos del tratamiento sobre los niveles de ROS BPTES.
Modulación del estrés oxidativo mediante la inhibición GLS en las células NSCLC mesenquimales correlaciona con sensibilidad
para probar si la sensibilidad a la inhibición GLS correlacionado con el aumento del estrés oxidativo en el tratamiento BPTES, que mide los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) utilizando CM-H2DCFDA en epiteliales y mesenquimales par NCI-H358, así como otro par de BPTES sensible (NCI-H1703) /(NCI-H838) líneas insensibles. La línea NCI-H838 se eligió para su examen, ya que, similar a la línea NCI-H358, exhibe pobre sensibilidad a BPTES a pesar de tener una contribución sustancial de Gln a piscinas TCA de carbono (datos no publicados). Mientras que la inhibición GLS consecuencia un aumento de los niveles de ROS en las cuatro líneas ensayadas, las líneas sensibles mostraron una mayor magnitud del aumento de ROS por BPTES (7,4 vs 4,4 veces en la NCI-H358_M en comparación con los padres; 15,9 veces vs 4,6 veces en la NCI -H1703 comparación con las células NCI-H838; la Fig. 7A). Curiosamente, se ha demostrado que el estrés oxidativo puede perjudicar el flujo de hidratos de carbono a través de la glucólisis a través de la inactivación de las enzimas, incluyendo GAPDH [26]. Tomados en conjunto, estos datos sugieren un modelo en el que aumenta la generación de ROS siguiente inhibición GLS en el mesenquimales células sensibiliza a GLS inhibición en parte a través de la inhibición del flujo de glucosa en TCA, lo que resulta en niveles de citrato reducidos y la fosforilación oxidativa (Fig. 7C).
Las células (a) se trataron con BPTES durante 20 horas y los niveles de ROS medidos con el tinte CM-H2DCFDA. Resultados representativos de 3 experimentos independientes; Los datos trazados como los niveles de ROS relativos al tratamiento de DMSO de cada línea celular (media +/- SD);
P = 0,01
comparaba la inducción de ROS por BPTES en los 2 pares de líneas sensibles /insensibles. (B) epiteliales y mesenquimales líneas NCI-H358 fueron tratadas con BSO o H 20
2 en un ensayo de CTG
72 h. Resultados representante de 2-3 experimentos independientes y se representa como media +/- SD. (C) Modelo para la sensibilidad de las células mesenquimales con CPNM a GLS inhibición. La inhibición de la conversión de Gln → Glu por BPTES perjudica el flujo de carbono de Gln en el TCA en ambas líneas.