Extracto
cuentas de metástasis hematógenas para la mayoría de las muertes relacionadas con el cáncer, sin embargo, el mecanismo aún no está claro. Las células tumorales circulantes (CTC) en la sangre pueden emplear diferentes vías para cruzar la barrera endotelial arterial y establecer un nicho metastásico. Varios estudios proporcionan pruebas de que el cáncer de próstata (CaP) la inmovilización de células y rodando sobre el endotelio microvascular a través de interacciones de ligando de selectina E /E-selectina bajo flujo de cizallamiento teóricamente promueven la extravasación y contribuyen al desarrollo de metástasis. Sin embargo, se desconoce si las CTC de pacientes con CaP interactúan con E-selectina expresada en el endotelio, iniciando una ruta para las metástasis tumorales. Aquí mostramos que las CTC provenientes de pacientes con CaP mostró interacciones con E-selectina y E-selectina que expresan las células endoteliales. Para examinar las interacciones de E-selectina mediada de líneas celulares de CaP y CTC derivadas de pacientes con CaP metastásico, hemos utilizado de manera fluorescente marcada con J591-488 anticuerpo anti-antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) monoclonal que se internaliza tras la unión de la superficie celular. Se empleó un dispositivo de flujo microescala que consiste en microtubos de E-selectina-revestido y células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) en la cámara de flujo de placas paralelas que simulan el endotelio vascular. Hemos observado que J591-488 no alteró significativamente el comportamiento de giro en células de CaP en tensiones de corte por debajo de 3 dinas /cm
2. CTC obtenidos a partir de 31 muestras de pacientes con CaP mostraron que la correa de sujeción CTC y estable interactúan con E-selectina y E-selectina expresar HUVECs en la tensión de cizallamiento fisiológica. Curiosamente, las muestras recogidas durante la progresión de la enfermedad demostraron significativamente más interacciones CTC /E-selectina que las muestras durante los tiempos de respuesta terapéutica (
p = 0,016
). El análisis de la expresión de sialil Lewis X (LES
x) en muestras de pacientes mostró que un pequeño subconjunto que comprende 1,9 a 18,8% de CTC posee alta
x expresión LES. Por otra parte, las interacciones E-selectina mediada entre CTC próstata y HUVEC fueron disminuidos en la presencia de anticuerpos neutralizantes anti-E-selectina. CTC-interacciones endoteliales proporcionan una nueva visión de los posibles mecanismos adhesivas de CTC de la próstata como un medio para iniciar la metástasis
Visto:. Gakhar G, Navarro VN, Jurish M, Lee GY, Tagawa ST, Akhtar NH, et al . (2013) células tumorales circulantes de cáncer de próstata Los pacientes Interact con E-selectina en condiciones fisiológicas flujo sanguíneo. PLoS ONE 8 (12): e85143. doi: 10.1371 /journal.pone.0085143
Editor: Kjetil Tasken, Universidad de Oslo, Noruega
Recibido: 27 Agosto, 2013; Aceptado: 23 Noviembre 2013; Publicado: December 27, 2013
Derechos de Autor © 2013 Gakhar et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por un premio de la formación post-doctoral del Departamento de Defensa Programa de Investigación del cáncer de la próstata (W81XWH-12-1-0124, a G. Gakhar); U54CA143876 del Instituto Nacional del Cáncer (a D. M. y M. R. Nanus Rey); David H. Koch Fundación y la Fundación Robert Dow (al N. H. Bander); Fundación Nacional de Ciencia Graduate Research Fellowship (a Y. Geng); del NIH EE.UU. (R01 CA137020-01, a P. Giannakakou); El Charles H. Leach, Fundación II, y el Fondo de Investigación Oncológica McCooey genitourinario Robert H.; de la clínica traslacional Science Center, Centro Nacional para el Avance de Ciencias de transferencia (UL1-TR000457-06, al P. J. Christos). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores han leído la política de la revista y tienen los siguientes conflictos. NHB es un inventor de las patentes relacionadas con el anticuerpo J591 utilizado en este estudio (consulte el archivo Bander_J591Patent el apego). Estas patentes se asignan a Cornell. El Dr. Bander es un consultor para y mantiene la equidad en BZL Biologics, la empresa a la que las patentes fueron autorizados por el CRF para la investigación y el desarrollo. La EM es una co-inventor de la siguiente patente cubre el uso de células endoteliales E4ORF1 (células endoteliales adenovirus que expresa E4ORF1 y sus métodos de uso, la Patente de EE.UU.#8465732). No hay más patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
El desarrollo de metástasis es la hipótesis de iniciar a través de mecanismos similares a las utilizadas por los leucocitos para la adhesión y la transmigración a través del endotelio arterial [1]. La cascada de reclutamiento de leucocitos al endotelio durante la inflamación implica etapas secuenciales que incluyen la inmovilización, laminación, adherencia, y, finalmente, la transmigración. El paso inicial de la inmovilización y de laminación se produce a través de interacciones dinámicas y transitorias entre selectinas expresadas por las células endoteliales (EC) y sus respectivos ligandos presentes en los leucocitos durante el flujo de sangre que causan rotura continua y formación de enlaces de receptor-ligando. Este ciclo conduce al comportamiento de rodadura característica de los leucocitos [2]. En los seres humanos, E-selectina se ha demostrado que es el principal responsable de la rodadura y la inmovilización selectina mediada [3].
Numerosos estudios que utilizan líneas celulares tumorales y modelos de ratones sugieren que endotelial (E) -selectin también participa en la adhesión de células tumorales, la migración y el desarrollo de metástasis [4,5].
In vivo
modelos de ratón han mostrado que la E-selectina promueve metástasis [6] y redirige las metástasis en el hígado [7]. Cimetidina, que inhibe la inducción de la expresión de E-selectina, disminuyó significativamente la metástasis hepática de células HT-29 de cáncer de colon en un modelo de ratón atímicos sin afectar el tumor primario [8]. Además, E- y P-selectina ratones deficientes inyectados con 29 HT-células tumorales mostraron una disminución significativa en el número de metástasis de pulmón en comparación con ratones de tipo salvaje [9].
El vínculo entre la E-selectina y la metástasis llevado a muchos estudios que caracterizan los ligandos de selectina en las superficies de células tumorales. ligandos de selectina son glicoproteínas específicas, que se vuelven funcionales después de la modificación posterior a la traducción por glicosiltransferasas y sulfotransferasas. La presencia de sialil-Lewis X (LES
x) y sialil-Lewis un (LES
a), los epítopos de hidratos de carbono de los ligandos de selectina [10,11] se asocia frecuentemente con la progresión del cáncer y de mal pronóstico [12,13 ]. Los estudios también sugieren que el tropismo de células de CaP al hueso se atribuye a las interacciones entre la E-selectina expresan en la médula ósea células endoteliales (EC) y los ligandos E-selectina presente sobre células de CaP [14].
La evidencia que implica el papel de la selectina E y sus ligandos en la metástasis del tumor se derivan de los estudios que utilizan líneas celulares tumorales pero nunca han sido confirmados en las células tumorales (CTC) derivadas de pacientes que circula. Presentamos aquí el uso de
ex vivo
condiciones que CTC aisladas de los hombres con cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC) demostrar las interacciones físicas, la adhesión predominantemente tethering y firme, con superficies de E-selectina-revestido y E-selectina que expresan EC durante el flujo de la sangre fisiológica. Además, las interacciones CTC /E-selectina mostraron una correlación significativa con la respuesta clínica de los pacientes a la terapia. Estas interacciones se disminuyeron en presencia de anticuerpo neutralizante anti-E-selectina. Además, se encontró una expresión variable de LES
x en la CTC, lo que sugiere que es probable que no todos los CTC contribuyen a metástasis.
Materiales y Métodos
Las líneas celulares
PC3, C4-2, LNCaP, MDA PCa 2b (MDA), y KGI son células de ATCC (Manassas, VA, EE.UU. ). CaP líneas celulares PC3, C4-2 y LNCaP se mantuvieron en RPMI suplementado con 10% FBS, y MDA PCa 2b (MDA) se mantuvo en los medios F-12K suplementado con suero de 20% de bovino fetal (FBS), 10 ng /ml EGF, 0,005 mg /ml de insulina, 100 pg /ml de hidrocortisona, 25 ng /ml de toxina de cólera, 45 ácido selenioso nM, y fosfoetanolamina 0,005 mM. KG1 células (línea celular leucémica mieloide aguda) se cultivaron en medio IMDM suplementado con 20% de SFB.
Declaración de Ética y la recogida de muestras de pacientes
En una Junta de Revisión Institucional Colegio Médico Weill Cornell (IRB) protocolo aprobado, 31 muestras de sangre periférica se obtuvieron de pacientes con CRPC y se tomaron 10 muestras de sangre periférica de donantes sanos después del consentimiento informado por escrito. La sangre se obtuvo en cualquiera de los tubos de Ficoll-Paque (7,5 ml de sangre de cada uno) o tubos BD Vacutainer (2,7 ml de sangre cada uno; Becton-Dickinson) que contiene 2,3% de anticoagulante citrato de sodio. Se obtuvo información clínica identificada-de. Determinación del estado del tumor (progresión clínica o la respuesta clínica) se determinó por 2 médicos independientes utilizando los criterios estándar.
marcaje de la superficie con anti-PSMA anticuerpo monoclonal J591
células MDA se tripsinizaron, se centrifugaron, y se incubaron en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) /HEPES 10 mM /2 mM CaCl
2 /0,5% de albúmina de suero humano (tampón I). El anticuerpo monoclonal J591 que reconoce el dominio externo del antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) conjugada con Alexa Fluor-488 (J591-488) se añadió [15] para la MDA y células PC3 (solas y células enriquecidas en la sangre normal y saludable) en 20 g /ml durante 30 min a temperatura ambiente en un rotador, se centrifugó a 1500 rpm durante 5 min, y el sedimento se resuspendió en medio RPMI. células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) aisladas de sangre sano normal por centrifugación a base de densidad de Ficoll se procesaron de manera similar, y se colocan en BD célula-tak (BD Biosciences, San Jose, CA) cubreobjetos recubiertos por cytospin. PBMCs fueron fijadas usando 2% de formaldehído (Tousimis, Rockville, MD) y se tiñeron con anticuerpo CD45 anti-ratón (1: 200, clon 2D1, BD Pharmingen, San Jose, CA), se lavaron con PBS y se incubaron con anticuerpo de cabra anti-ratón de Alexa Fluor (AF) -594 anticuerpo secundario, se lava y se sometieron a contratinción con DAPI.
El enriquecimiento de CTC por anti-CD45 de perlas inmunomagnéticas agotamiento
para enriquecer a los CTC, las PBMC aisladas de la sangre periférica por la densidad de Ficoll centrifugación basado fueron sometidos a selección negativa para los leucocitos utilizando anti-CD45 bolas inmunomagnéticas (Life Technologies, Grand Island, NY). PBMCs se lavaron dos veces con 2% RPMI /4 mM MgCl
2/1 mM CaCl
2 tampón (tampón II) y se incubaron con perlas inmunomagnéticas-CD45 anti-pre-lavado en 1 ml de tampón I de 20 min en un rotador. Después de la incubación, que se añadió 35 ml de tampón y las células se mantuvo en un imán durante 10 min a 4 ° C. Las células se centrifugaron a 400 g durante 12 min y se añadió anticuerpo anti-PSMA J591-488 de 40 min, se centrifugaron y se resuspendieron en tampón I y ensayos de rodadura se realizaron. Para la inmunotinción experimentos, después de anti-CD45 agotamiento inmunomagnética, las células se resuspendieron en 500 l de medio RPMI 2% y cytospun en portaobjetos de vidrio cargados positivamente (Thermo Scientific, Asheville, NC). Las láminas fueron almacenados a -20 ° C para su posterior inmunotinción.
basado en el flujo de microtubos de ensayo
En pocas palabras, estéril 50 cm de longitud de los tubos microrenathane 'D' 300 micras (Braintree Scientific, MA) se incubaron con 10 mg /ml de solución de proteína-G durante 1,5 h, seguido de un 2 h de incubación con 10 mg /IgG e-selectina humana recombinante ml [16] (R & amp; D Systems, Minneapolis, MN) y se bloquearon con 5% de leche durante 1 h. Todas las incubaciones se realizaron a temperatura ambiente. Los tubos de control o bien no eran incubadas con E-selectina o se incubaron con 10 mg /IgG L-selectina humana recombinante ml (R & amp; D Systems, Minneapolis, MN). microtubos recubiertas se montan en un microscopio invertido equipado con una cámara Zeiss AxioCam MRM. Una bomba de jeringa (KDS 230, CITI Life Science, Woodland Hills, CA) se utilizó para controlar la tensión de cizallamiento de la suspensión celular. Una concentración conocida de 1 x 10
6 no marcado o etiquetado J591-488 células MDA diluido en tampón I se perfundió sobre la superficie a una tensión de cizalla de 0,5 dinas /cm
2 de 3 min después de lo cual las células se sometieron a perfusión en esfuerzos de corte que van desde 0,5-8 dinas /cm
2. Videos se registraron durante 30 segundos a 10 lugares al azar a lo largo de la longitud de cada microtubo.
Para la medición de las interacciones de CTC pacientes con E-selectina, PBMCs obtenidas a partir de 21 muestras de pacientes CRPC después de la depleción anti-CD45 y seis muestras de pacientes sin el agotamiento anti-CD45 se marcaron con J591-488 con altibajos durante la E-selectina microtubos recubiertas de 0,6 dinas /cm
2. J591-488 etiquetado CTC se visualizaron utilizando 488 nm de longitud de onda del láser. Una serie de vídeos continuos 45 seg se registraron usando Axiovision módulo de lapso de tiempo (Carl Zeiss, Thornwood, NY). Todos los tubos y puntas de pipeta se pre-recubiertas con albúmina de suero humano 0,5% para bloquear la unión no específica de las CTC.
análisis de flujo laminar para la interacción de células endoteliales CTC-
Para las interacciones CTC-endoteliales, se utilizó una cámara de flujo de placas paralelas [17]. HUVECs (un regalo del Dr. Shahin Rafii) se cultivaron en medios M199, 1 M Hepes, 20% de FBS, 5 mg /ml de heparina, factor de crecimiento celular 100 mg /ml endotelial, y L-glutamina. HUVECs transduced-E4ORF1 y se mantuvieron como se ha descrito anteriormente [18]. células MDA o CTC derivados de cuatro pacientes CRPC fueron perfundidos sobre monocapas confluentes de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVECs) cultivadas en un 35 x 10 mm placas de cultivo de tejidos (Corning Inc., Corning, NY). HUVECs fueron estimulados primero con 50 ng /ml de IL-1β (Peprotech, Rocky Hill, NJ) durante 4 h. HUVECs IL-1ß estimulada tratados con 30 mg /ml neutralizantes anti-E-selectina (68-5H11, BD Pharmingen, CA) durante 1 hora a 37 ° C incubadora, no estimulado HUVEC, y ICAM-1 anticuerpo humano anti-ratón ( Clone bbig-I1,#BBA3 sistemas de I + D y) se utilizaron como controles. células MDA o CTC se volvieron a suspender en tampón I y perfundidos en la cámara de flujo de placas paralelas sobre las HUVEC. balanceo de células MDA se evaluó a los diferentes esfuerzos de corte que van desde 0,5-4 dinas /cm
2 que realizan tres experimentos independientes. Para rodar las mediciones en las CTC derivadas de pacientes con CaP, las células enriquecidas por anti-CD45 depleción inmunomagnética y etiquetados con anti-PSMA J591-488, fueron perfundidos sobre las HUVEC en 0,6 dinas /cm
2 estrés de cizalla. Como se indica en los resultados, un subconjunto de rodadura experimentos de ensayo también se llevaron a cabo utilizando tecnologías BioFlux microfluidos (Fluxion Biosciences, San Francisco, CA).
Análisis fuera de línea de E-selectina mediada por interacciones
células "Rolling" se definieron como cualquier traducción de células a lo largo de la superficie del tubo durante más de dos segundos a una velocidad de menos de 50% de la hidrodinámica velocidad de flujo libre de una célula que no interactúan cerca de la pared del tubo [19]. velocidad de rodadura se cuantificó mediante el registro de la cantidad de tiempo (t) requerido para una célula de laminación para moverse a través de una distancia conocida (D). Rodando velocidad v = d /t.
Para evaluar las interacciones de las CTC derivados de pacientes con E-selectina, CTC se clasificaron en tres clases: 1) CTC adhesión estable (es decir, pegado a la superficie durante más de cinco segundos); 2) Rodamientos /Tethering CTC (es decir, la inmovilización se refiere a los CTC que se adhieren a la superficie, luego separe en menos de cinco segundos y vuelva a conectar de nuevo); y 3) CTC no adherentes (CTC que no ruedan /correa de sujeción o se adhieren a la superficie).
tinción de inmunofluorescencia de marcadores de superficie celular
De acuerdo con el enriquecimiento de PBMCs de pacientes con CaP, células aisladas se adjunta a los portaobjetos de vidrio por citospina, fijados en formaldehído al 2% (Tousimis, Rockville, MD) durante 20 minutos, y se lavaron 3 veces con PBS. Las células fueron bloqueadas con 2% de BSA durante 1 h, y se incubaron con anticuerpos primarios de rata anti-sLe
x (1:10, HECA-452, BD Pharmingen, San Jose, CA) o policlonal de conejo anti-CXCR4 (1: 100, Novus Productos Biológicos, Littleton, CO) mAb durante 1 h, y se incubaron con Abs secundario (de cabra AF594 anti-rata y de cabra anti-conejo DyLight 405) durante 1 h, se incubaron en AF-488 y AF-647 anticuerpos primarios conjugados para anti-PSMA (humanizada) y anti-EpCAM (ratón, clon 9C4, BD Biosciences), respectivamente, y montados en una coverslide con Mowiol recién preparada (Calbiochem, Billerica, MA). Todas las incubaciones se realizaron a temperatura ambiente, seguido por 3X lavar con PBS más 0,5% de BSA. Para la tinción de inmunofluorescencia, MDA, PC3, KG1cells, y PBMCs obtenidas de donantes sanos normales se utilizaron como controles negativos y positivos para proteínas diferentes. Las células de control se sembraron en cubreobjetos recubiertos BD Cell-Tak y se procesan de manera similar a las muestras de pacientes. La cuantificación del LES
x expresión de datos se obtuvo utilizando Metamorph
TM software (MDS Analytical Technologies, Sunnyvale, CA) y la medición de la intensidad de fluorescencia media (MFI) por píxel [20]. La intensidad de fondo, determinado por la selección de una zona carente de CTC, se restó de estos valores para cada imagen. Para estas mediciones, Z-pilas de las imágenes adquiridas fueron utilizados, tomado por LSM 700 Zeiss Observer.Z1 (Carl Zeiss, MicroImaging Inc, Thornwood, NY).
Western blot y mediante inmunofluorescencia de la expresión de E-selectina en HUVECs
Tanto 1 ° y E4ORF1 HUVEC se estimularon con IL-1β durante 4 h. Después de la estimulación de IL-1β, tanto sin estimular y células estimuladas se lavaron tres veces con PBS enfriado en hielo. Las células se resuspendieron en tampón de lisis (NaCl 150 mM, 10 mM Tris HCL, pH = 7,5, EDTA 5 mM) que contiene la tableta de cóctel inhibidor de proteasa (1 comprimido /10 ml de tampón de lisis; Roche). Las concentraciones de proteínas de lisado de células se determinaron por el método de Bradford. El lisado celular se diluyó en tampón de muestra reductor 6X (12% w /v de SDS, 0,06% w /v azul de bromofenol, 47% v /v de glicerol, 0,5 M Tris, pH = 6,8, llevar el volumen a 10 ml con agua destilada) y se separaron en 10% de gel de SDS-PAGE. proteínas resueltas se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (Bio-Rad, Inc., Hercules, CA) y se bloquearon en 5% de leche durante 1 h a temperatura ambiente. Membrana se cortó y después se incubó con el ratón anti-E-selectina (1: 500, 68-5H11, BD Pharmingen, San Jose, CA) y el ratón anti-β-actina (1: 10.000, Sigma Aldrich) durante la noche a 4 ° DO. La inmunorreactividad se visualizó mediante el sistema de imágenes de infrarrojos Odyssey LI-COR (LI-COR Biosciences). Por inmunofluorescencia, tanto 1 ° y E4ORF1 HUVECs fueron estimuladas con IL-1β durante 4 h y las dos HUVECs no estimuladas y estimuladas IL-1ß-se fijaron, se permeabilizaron con 0,1% Triton-X 100, y a inmunotinción con el anticuerpo monoclonal anti-E-selectina de ratón (2,5 mg /ml, 68-5H11, BD Pharmingen, San Jose, CA) durante la noche a 4 ° C. HUVECs fueron teñidas con Alexa Fluor de cabra anti-ratón 488 nm de anticuerpos (1: 500, Molecular Probes) durante 1 h a temperatura ambiente. Las HUVEC se lavaron y contratinción con DAPI.
Análisis estadístico
Las estadísticas descriptivas son presentados con histogramas que muestran la desviación media + estándar (SD). Las medias se compararon mediante la prueba t de dos muestras con la calculadora varianza apropiado. Los diagramas de caja se hicieron y se realizó la prueba de suma de rangos de Wilcoxon no paramétrica para comparar las distribuciones (es decir, mediana, rango) entre los grupos. Un mínimo de tres experimentos independientes se realizaron con líneas de células de cáncer. Se realizó la prueba exacta de Fisher para evaluar la relación entre el estado de la interacción CTC /E-selectina paciente y el estado de progresión clínica. Un valor de p
& lt; 0,05
fue considerado estadísticamente significativo en todos los análisis. Todos los análisis se realizaron en STATA versión 10.0 (StataCorp, College Station, TX).
Resultados
Etiquetado de las células tumorales de próstata con anticuerpos anti-PSMA J591-488
Para CTC de estudio aislados de pacientes con CRPC, tomamos ventaja del hecho de que & gt; 90% de células de CaP expresan PSMA en su superficie celular [21,22], y se utiliza mAbJ591-488, que reconoce un dominio externo de PSMA y es rápidamente internalizado tras la unión a PSMA de superficie celular, para identificar CaP CTC [15,23] .. se añadieron células MDA células que expresan PSMA y PC-3 (control negativo PSMA) por separado a la sangre normal y saludable, y la mezcla se incubó con mAbJ591- 488. Después de la incubación, se recogió la capa de PBMC que contiene células cancerosas. Como era de esperar (Figura 1A), las células que expresan PSMA MDA internalizados mAbJ591-488 y eran fácilmente visibles bajo microscopía de fluorescencia, mientras que mAbJ591-488 no se unió a las células PC3 (Figura 1B). experimentos con muestras enriquecidas de sangre con MDA y PC3 se llevaron a cabo seis veces usando diferentes sangre de donantes sanos. No PSMA expresión se detectó en los alrededores de los leucocitos que se identificaron mediante inmunotinción con el anticuerpo anti-CD45 (Figura 1C). expresión PSMA también no se observó en las células PC3 mezcladas con sangre (datos no mostrados). Estos resultados sugieren que mAbJ591-488 puede etiquetar específicamente células de CaP y por lo tanto puede ser utilizada para etiquetar CaP CTC.
Las células cancerosas se sembraron ya sea solo (A, B) o en presencia de PBMCs saludables derivados de donantes (C ). Las células se marcaron con anticuerpo J591-488 (verde) a temperatura ambiente, después se fijaron y se inmunotiñeron para CD45 (rojo) y DAPI (azul). A) Las células MDA son positivos para la expresión de PSMA. B) las células PC3 son negativos y, por lo tanto, carecen de la expresión de PSMA. C) Derecho subfigura muestra la expresión específica de PSMA por células MDA mientras que las células sanguíneas expresan CD45. PBMCs aisladas de donantes sanos normales se mezclaron con células MDA y se procesaron como en A, las células cancerosas MDA B. PSMA-positivas son clara y específicamente representado (flecha blanca) entre leucocitos CD45 que expresan (puntas de flecha) en la mezcla.
Verde = PSMA, Rojo = CD45 y azul = DAPI
.
de adhesión E-selectina dependiente de marcado y anti-PSMA etiquetado J591-488 células tumorales de próstata
Durante una respuesta inflamatoria, los leucocitos se adhieren al endotelio vascular por las interacciones entre la adhesión moléculas presentes en el lado luminal del endotelio vascular y los ligandos complementarios presentes en los leucocitos. Estas interacciones dan como resultado la transitoria, la adhesión dinámica (laminación) de las células a la pared vascular [2]. Balanceo se observa debido a la rotura continua y formación de enlaces ligando-receptor en el extremo posterior de la célula y el borde frontal de la celda, respectivamente. Para investigar si las interacciones E-selectina-dependiente se producen en CTC de próstata, se utilizó primero MDA, PC3, líneas celulares LNCaP y C4-2 CaP para evaluar su comportamiento de giro en la presencia de superficies de microtubos E-selectina-revestido. Fuera de las cuatro líneas celulares de CaP estudiados, sólo se detectó un comportamiento robusto de rodadura en las células MDA (datos no mostrados), consistente con estudios previos [24,25].
El anticuerpo monoclonal J591 se internaliza tras la unión de la superficie celular que sugiere que la ACP CTC puede ser etiquetado
ex vivo y estudiado las interacciones CTC-endoteliales. Sin embargo, para descartar la posibilidad de que J591-488 unión y la internalización altera el comportamiento de rodadura, etiquetamos células MDA con J591-488 y se comparó el comportamiento de rodadura con células MDA no marcados en esfuerzos de corte que van desde 0,5-8 dinas /cm
2 . La velocidad media de rodadura de las células MDA no marcados y marcados con J591-488 a 0,5 dinas /cm
2 fue de 5,27 + 1,28 m /seg y 5,23 + 1,85 m /seg (Figura 2, p = 0,88, NS). Sí observamos una pequeña pero estadísticamente significativa diferencia en la media rodando velocidades de marcado frente J591-488 etiquetado células MDA en 3 (7,04 + 1,15 vs 6,33 + 1,22 m /seg,
p & lt; 0,005
) y 8 ( 17.81 + 14.38 + 3,51 vs 1,83 m /seg,
p & lt; 0,0005
) dyn /cm
2 estrés de cizalla. Por lo tanto, sobre la base de nuestros resultados y estudios previos, hemos llevado a cabo experimentos en el 0,6 dinas /cm
2, un esfuerzo cortante fisiológico aplicado ampliamente para medir el comportamiento de rodadura [17]. Además, se ha demostrado que las células de tumor de balanceo y de sujeción a esfuerzos de corte inferiores (
& lt; 3 din /cm
2) [26]. Estos datos sugieren que las CTC se pueden marcar con J591-488 y que el marcaje fluorescente de los CTC no afecta al comportamiento de rodadura a esfuerzos de corte más bajas. Es de destacar, que no detectó ningún comportamiento de giro ya sea en ausencia de E-selectina en cualquier esfuerzo de corte examinado o en presencia de la proteína L-selectina recombinante humana (datos no mostrados), lo que sugiere que se requiere E-selectina a liar comportamiento. Videos S1 y S2 muestran el comportamiento de giro de las células MDA no marcados y marcados con J591-488
. células
MDA se marcaron con mAb J591-488 para PSMA. Después del marcaje, 10
6 J591-488 células MDA marcadas fueron perfundidos a las 0,5, 1, 3, 5 y 8 dinas /cm
2 estrés de cizalla. Del mismo modo las células MDA no marcados también se sometieron a perfusión a través microtubos recubierto E-selectina. Diez videos fueron tomadas en diferentes longitudes de la microtubo para cada tensión de cizallamiento. velocidad de rodadura se midió por tanto no marcado y anti-PSMA etiquetado J591-488 células MDA. La figura no muestra diferencias significativas en la velocidad de rodadura entre sin marcar y anti-PSMA etiquetado J591-488 células MDA en la tensión de cizallamiento que va desde 0,5 hasta 1 dyn /cm
2. Las velocidades medias de rodadura en 0,5 dinas /cm
2 fueron 5.27+ 1.38 y 5.23 + 1.85 m /seg en el marcado y J591-488 etiquetados células MDA, respectivamente. En tensiones de cizallamiento más altas, se observó una diferencia significativa entre las dos categorías de células MDA. Histograma muestra los resultados de tres experimentos separados combinados juntos. UnL = células MDA no marcados, Lab = J591-488 etiquetado células MDA. Los datos se representan como la media + SD.
E-selectina interacciones mediadas por CTC derivadas de pacientes con cáncer de próstata
A continuación se determinó si las CTC deriva de pacientes con CaP interactuarían con E- selectina similares a las células MDA CaP. PBMCs de ~ 6 ml (5.4-7.5) de sangre entera se obtuvieron de 17 pacientes individuales (27 muestras de sangre) con CaP metastásico, y se incubaron con mAb J591-488. Después de etiquetado, 21 muestras se sometieron a agotamiento anti-CD45; mientras que en 6 muestras, no se realizó el agotamiento anti-CD45. En primer lugar, encontramos seis muestras de pacientes sin el agotamiento anti-CD45. Posteriormente, para evitar los leucocitos contaminantes que podrían disminuir la posibilidad de CTC interactuar con la superficie, se empleó el agotamiento anti-CD45 para enriquecer la población CTC. La tasa de recuperación de esta técnica fue 60 a 70% usando PSMA que expresa células de CaP (datos no mostrados). Cada muestra del paciente se perfundió sobre superficies microtubos E-selectina recubierto en 0,6 dyn /cm
2 la generación de una tasa de cizallamiento de 60
-s, que está dentro del intervalo de la tasa de cizallamiento fisiológico en vénulas postcapilares [27 ]. CaP CTC marcado con mAb J591-488 se identificaron en 23 muestras, y la mediana del número de CTC detectadas mediante análisis de vídeo en línea tenía nueve años (rango 0-270) (Tabla 1). Nueve de 23 (39,1%) y 10/23 (43,5%) de las muestras de pacientes mostraron balanceo /tethering y adhesión estable, respectivamente. Las interacciones mediadas por E-selectina se observan en las CTC próstata componen en su mayor adherencia y anclaje estable con muy pocas CTC que muestran un comportamiento de giro. Cuando se evaluó el estado clínico en el momento de la recogida y procesamiento de la muestra, se observó que las CTC de las muestras de pacientes que experimentaron una respuesta clínica fueron significativamente menos propensos a tener interacciones E-selectina mediada por comparación con los CTC de progresar clínicamente los pacientes (Tabla 1; 0.0 % vs. 61,9%, respectivamente,
p = 0,016
). Anti-CD45 agotamiento no tuvo un efecto sobre las interacciones E-selectina dependiente de la CTC (Tabla 1, muestra 1, 13, 17, 21, 22, 25); si bien, no podemos descartar por completo la posibilidad de que algunos CTC se perdieron durante el proceso de agotamiento anti-CD45. Vídeo S3 muestra un video de una muestra de un paciente que demuestra la interacción de las CTC con E-selectina. Estos resultados proporcionan evidencia física directa de que las CTC próstata que expresan PSMA interactuar con E-selectina y sugieren que las CTC próstata poseen ligando E-selectina (s) (ESL) en sus superficies celulares.
Paciente Nº
muestra No.
Rodamientos, Tethering
adhesión estable
total
Historia clínica en el momento de la recogida de muestras
Respuesta clínica en el momento de la recogida de muestras
1 * 13329Bone y metástasis LN siguientes progresión de docetaxel y terapia de investigación actualmente en el ketoconazol /hydrocortisoneProgression121310Bone y metástasis LN siguientes progresión de docetaxel y terapia de investigación actualmente en el ketoconazol /hydrocortisoneProgression132814270Bone y metástasis LN siguientes progresión de la terapia hormonal, docetaxel, y terapia de investigación actualmente en abiraterona /metástasis prednisoneProgression140072Bone y LN siguientes progresión de docetaxel y abiraterona actualmente en carboplatino /paclitaxelResponding150012Bone y LN metástasis siguiente progresión en docetaxel y abiraterona actualmente en la metástasis de carboplatino /paclitaxelResponding26009Bone y LN tratados previamente con terapia hormonal y docetaxel en metástasis therapyProgression27004Bone y LN en investigación previamente tratados con hormonas terapia y docetaxel en metástasis therapyProgression38035Bone investigación siguientes líneas múltiples de metástasis therapyProgression39009Bone hormonales que siguen varias líneas de tratamiento hormonal en docetaxelResponding410012Bone, LN, metástasis hepáticas y pulmonares previamente tratados con docetaxel y abiraterona actualmente en la metástasis carboplatino /paclitaxelProgression511009LN con la progresión de las metástasis therapyProgression512001LN hormonales con la progresión de La terapia hormonal y docetaxel actualmente en abiraterona /prednisoneResponding6 * 13400166bone metástasis con la progresión de docetaxel y metástasis therapiesProgression614036bone investigación con la progresión de docetaxel, terapias de investigación, y abirateroneProgression7152141bone, LN, colon y vejiga metástasis siguientes therapyProgression716002bone hormonal y de investigación, LN, colon y vejiga metástasis después de la terapia hormonal y en fase de investigación, actualmente en docetaxelResponding8 * 17023bones metástasis tratados previamente con múltiples líneas de metástasis therapyProgression818000bones hormonales tratados previamente con múltiples líneas de tratamiento hormonal, actualmente en metástasis docetaxelResponding919000bone que progresan en therapyProgression10202153LN hormonal y metástasis hepáticas iniciales previamente tratados con docetaxel actualmente en abirateroneProgression11 * 219228bone metástasis previamente tratados con docetaxel, ketoconazol, y therapyProgression12 investigación * 22102LN metástasis tratadas previamente terapia de investigación y docetaxel, actualmente en enzalutamideProgression1323000bone y LN metástasis en leuprolide y bicalutamideProgression14240020bone y pulmones metástasis tratados previamente con therapyProgression15 hormonal * 250010bone, LN, de vejiga y de pulmón metástasis tratados previamente con terapia de investigación y metástasis docetaxelProgression1626000bone y LN tratados previamente con terapia de investigación y docetaxelProgression17271022LN y vejiga metástasis previamente treatd con ketoconazol, docetaxel, terapia de investigación, actualmente en cabazitaxelProgressionTable 1. Las interacciones entre las CTC derivadas de pacientes con CaP metastásico y microtubos de e-selectina-revestido .
superficies LN = ganglios linfáticos; Total significa todos los CTC-J591 marcado;