Extracto
Vγ9Vδ2 células son células T citotóxicas que son capaces de reconocer células de carcinoma de ovario epitelial (EOC). Por lo tanto, la transferencia adoptiva basada en células Vγ9Vδ2 es un tratamiento atractivo para EOC. Sin embargo, la ineficiente
ex vivo
expansión después de la estimulación específica de las células Vγ9Vδ2 de algunos pacientes y las relaciones entre las células Vγ9Vδ2 y curso clínico de EOC son cuestiones que aún quedan por aclarar. En este documento, las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de 60 pacientes de EOC se estimularon con pirofosfato bromohidrina (BrHPP) o zoledronato, que son agonistas específicos de células Vγ9Vδ2. Los compuestos diferían en sus eficacias para inducir
ex vivo
expansión Vγ9Vδ2 PBMC, pero 16/60 muestras se mantuvieron de manera ineficiente expandido con ambos estímulos. Curiosamente, las células Vγ9Vδ2 en estos PBMCs-baja respuesta que aparecen antes de la expansión (
ex vivo PBMC) una producción alterada de las citoquinas pro-inflamatorias IFN-gamma y TNF-alfa, una disminución de la fracción ingenua y una frecuencia reducida . No se observó evidencia de una participación de CD4
+ CD25
+
Foxp3 + células reguladoras. Es importante destacar que, nuestros datos también demuestran que una frecuencia de células Vγ9Vδ2 de 0,35% o menos en EOC PBMCs se podría utilizar para predecir las respuestas bajas a ambos BrHPP y zoledronato. Por otra parte, nuestra más destacado de datos que dicha deficiencia no se correlaciona con etapas avanzadas de EOC pero se asocia con estados más refractarios a la quimioterapia basada en platino y es un predictor independiente de supervivencia libre de enfermedad después del tratamiento. Estos resultados son los primeros en sugerir una contribución potencial de las células Vγ9Vδ2 a los efectos antitumorales de agentes quimioterapéuticos y refuerzan el interés por las estrategias que podrían aumentar las células Vγ9Vδ2 en pacientes con cáncer
Visto:. Thedrez A, V Lavoué , Dessarthe B, Daniel P, S Henno, Jaffre I, et al. (2013) deficiencia cuantitativa de células de sangre periférica Vγ9Vδ2 es negativo pronóstico de biomarcadores en cáncer de ovario pacientes. PLoS ONE 8 (5): e63322. doi: 10.1371 /journal.pone.0063322
Editor: Eric Vivier, INSERM- CNRS Univ. Méditerranée, Francia |
Recibido: 2 Enero, 2013; Aceptado: April 2, 2013; Publicado: 23 de mayo de 2013
Derechos de Autor © 2013 Thedrez et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de Instituto Nacional del cáncer (INCA) PL2008-034, Cancéropôle Gran Oeste y el apoyo financiero de la Facultad de Medicina de la Universidad de Rennes. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción células
Vγ9Vδ2 humano son un subconjunto predominante de células T delta gamma de sangre periférica que expresan un TCR único con regiones Vγ9-Vδ2. Estas células, que por lo general representan 0,5 a 10% de la piscina linfoide periférico, reaccionan contra diversas células tumorales a través del reconocimiento de derivados isoprenoides fosforilados definido como phosphoantigens [1], [2]. Vγ9Vδ2 células pueden matar directamente a sus objetivos y la liberación de citoquinas pro-inflamatorias que estimulan las células efectoras antitumorales del sistema inmune adaptativo [3]. Debido a estas características, la activación selectiva de estas células podría ser de gran interés en la inmunoterapia del cáncer [4]. Varios compuestos disponibles en la actualidad de grado clínico son capaces de activar las células fuertemente Vγ9Vδ2 y, con IL-2, puede inducir la consecuencia selectiva de estas células
in vitro
y
in vivo
. Estos compuestos son o bien phosphoantigens sintéticos, tales como pirofosfato de bromohidrina (BrHPP, Phosphostim ™), o inhibidores farmacológicos de la vía del mevalonato, tales como los aminobifosfonatos (es decir, zoledronato, Zometa ™). Tales compuestos se han evaluado recientemente en ensayos inmunoterapéuticos pasivos o activos en pacientes con neoplasias hematológicas o tumores sólidos [5] - [14]. Estos tratamientos han sido generalmente bien tolerado y han inducido alentadoras respuestas objetivas en algunos pacientes [12], [15], [16].
cáncer de ovario epitelial (EOC) es el quinto cáncer más frecuente en las mujeres y causa más muertes que cualquier otro cáncer ginecológico. La mayoría de los pacientes EOC son diagnosticados en una etapa avanzada. En la actualidad, todos los pacientes se someten a procedimientos quirúrgicos, y el 90% de los pacientes también reciben una quimioterapia basada en platino. Sin embargo, la tasa de supervivencia a 5 años se mantiene por debajo del 40%. Por lo tanto, el aumento de los conocimientos sobre el papel de la vigilancia inmunológica en EOC ha llevado a la exploración de estrategias terapéuticas innovadoras que se dirigen al sistema inmunológico [17]. Recientemente, nuestro grupo ha demostrado que
in vitro
phosphoantigen-expandido Vγ9Vδ2 células de pacientes con EOC exhiben alta actividad citolítica contra las células tumorales autólogas ováricos frescas, proporcionando así un racional para la transferencia adoptiva Vγ9Vδ2 basado en células en pacientes EOC [18] . Sin embargo, las relaciones entre las células y la progresión Vγ9Vδ2 o resultados clínicos de EOC permanecen sin explorar. Además, existen algunas preocupaciones acerca de la eficacia de las expansiones de células Vγ9Vδ2 con protocolos convencionales que se basan en el
ex vivo
estimulación de las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) con una dosis única de BrHPP o condiciones zoledronato y la cultura que requieren IL-2. Estos protocolos son apropiados para las células de donantes sanos [19], [20]. Sin embargo, no pudieron ampliar de manera eficiente las células Vγ9Vδ2 de algunos pacientes EOC [18], similar a lo observado en otros tipos de cáncer [12], [14], [20] - [22]. Queda por ver si estas fallas en algunos pacientes EOC están relacionados con diferencias intrínsecas en las células Vγ9Vδ2 o se deben a diferencias en otros parámetros ambientales. La comprensión de estas diferencias podría ayudar a optimizar futuros ensayos clínicos de terapias Vγ9Vδ2 transferencia adoptiva basados en células en EOC
En este estudio, se determinó lo siguiente en una cohorte de 60 pacientes EOC:. Los parámetros asociados a la ineficiente BrHPP- y expansiones de células Vγ9Vδ2 zoledronate inducida y la posibilidad de una asociación entre la presencia de células Vγ9Vδ2 y el curso clínico de la EOC. Nos informan de que PBMCs que fueron ineficiente expandido con BrHPP y con zoledronato tienen antes de la expansión (
ex vivo
PBMCs) frecuencias reducidas de células Vγ9Vδ2 y que estas células muestran alteraciones en su fenotipo y funcionalidad. Además, revelamos que una frecuencia de células Vγ9Vδ2 de 0,35% o menos en
ex vivo
EOC PBMCs predice bajas respuestas a ambos protocolos de estimulación basada en el zoledronato y BrHPP- y que tal deficiencia celular está relacionada con la clínica progresión y recurrencia de EOC después de un tratamiento a base de quimioterapia.
resultados
Las expansiones de Vγ9Vδ2 CMSP en respuesta a BrHPP y zoledronato son más bajos en pacientes EOC que en donantes sanos
en primer lugar, se compararon las expansiones de PBMC de 60 pacientes EOC (EOC PBMCs) y de 13 mujeres donantes sanos después de una estimulación específica de células Vγ9Vδ2 con una sola dosis de fármacos BrHPP o zoledronato (Zol), que eran relevantes para los protocolos de ensayos clínicos, y un cultivo durante dos semanas en presencia de IL-2 (Fig. 1). La mediana de la frecuencia de las células expandidas Vγ9Vδ2 en PBMC (Fig. 1A) y la mediana del número de células expandidas Vγ9Vδ2 (fig. 1B) fueron significativamente inferiores en los pacientes EOC que en los donantes a los 14 días después de la estimulación, ya sea con o BrHPP Zol. Estos datos confirman que las respuestas de PBMC Vγ9Vδ2 a ambos protocolos de estimulación se redujo significativamente en los pacientes EOC.
Vδ2
+ CD3
+ frecuencias celulares entre células expandidas (A) y Vδ2
+ números CD3
+ de células generadas a partir de 1 × 10
6 PBMC (B) se midieron a los 14 días después de BrHPP (▴) o zoledronato (Zol) (▪) la estimulación. Los resultados de n = 60 PBMCs de pacientes y n = 13 se muestran las PBMC de los donantes.
BrHPP y zoledronato difieren en sus capacidades para expandir Vγ9Vδ2 PBMCs de pacientes EOC
Teniendo en cuenta nuestra los resultados de los pacientes EOC expansiones PBMC (Fig. 1) y la tasa mínima de pureza que se definió previamente para un producto de terapia basada en células Vγ9Vδ2 [6], [23], se seleccionan el número de células Vγ9Vδ2 ampliada de 2 × 10
6 celdas (generados a partir de 1 × 10
6 CMSP) (véase la leyenda de la tabla 1 para más detalles) y la frecuencia de células Vγ9Vδ2 del 70% entre las células expandidas como valores de corte para distinguir expansiones eficientes (≥2 × 10
6 células y ≥70%) de expansiones ineficientes (& lt; 2 × 10
6 células o & lt; 70%). Cuatro grupos estadísticamente distintas de las muestras fueron así identificados en nuestras condiciones experimentales (Tabla 1): La PBMCs que responden (R) que se expanden de manera eficiente con ambos estímulos (53%); los BrHPP-bajos-responder PBMC (Br-LR) que se expandieron única manera eficiente con Zol (13%); los Zol-bajo-responder PBMCs (Zol-LR) que se expandieron solamente de manera eficiente con BrHPP (7%); y las PBMCs-baja respuesta (LR) que se ampliaron de manera ineficiente, independientemente del estímulo aplicado (27%). Estos datos ponen de manifiesto las distintas habilidades de BrHPP- convencional y protocolos basados en zoledronato para expandir de manera eficiente Vγ9Vδ2 PBMCs de pacientes EOC.
Las capacidades de células Vγ9Vδ2 a proliferar y para producir el citoquinas pro-inflamatorias IFN γ y TNF-α se reducen en LR EOC PBMCs
para investigar los parámetros asociados con el estado de baja respuesta de Vγ9Vδ2 PBMC tanto BrHPP- y protocolos de estimulación basada en el zoledronato, los análisis comparativos se limitaban a la LR y los grupos R.
En primer lugar, comparamos las veces los aumentos de Vγ9Vδ2 PBMCs 14 días después de la estimulación o BrHPP Zol (Fig. 2A y 2B). Los aumentos de plegado fueron significativamente más bajos en los PBMCs LR que en las PBMCs de I después del tratamiento con agonista (Fig. 2A). El aumento pliegue celular inducida por Vγ9Vδ2 BrHPP media fue de 812 [352 a 2333] para el grupo R y sólo 132 [74-609] para el grupo LR (Fig. 2A). Se observó una tendencia similar en las células tratadas con Zol, con pliegue mediana de aumentos de 712 [339-1854] para el grupo R y 403 [140-872] para el grupo LR (Fig. 2B). La producción de las citoquinas pro-inflamatorias IFN-gamma y TNF-a células byVγ9Vδ2 en LR y R EOC PBMC antes de la expansión (
ex vivo PBMC) se trató también con la tinción intracelular. Los experimentos se realizaron mediante la estimulación de
ex vivo PBMC con BrHPP o PMA /ionomicina. Debido a unos cantidades de PBMC en muestras procedentes de pacientes, zoledronato se ha omitido de los siguientes ensayos de activación. Se encontró que las producciones de TNF-α y IFN-γ a reducirse significativamente en LR PBMCs en comparación con R PBMCs (Fig. 2C y 2D). Es importante destacar que, las dosis de BrHPP que fueron saturando para R PBMCs no pudieron restaurar las respuestas IFN-gamma y TNF-a en LR PBMCs (Fig. S1). En conjunto, estos resultados demuestran un perfil funcional alterada de las células Vγ9Vδ2 en LR EOC PBMCs.
A, B) Vδ2
+ CD3
+ plegado celular aumenta en LR (n = 16) y R (n = 32) PBMCs EOC a los 14 días después de BrHPP (A) o la estimulación Zol (B). C) Los porcentajes de IFN-γ
+ células en el Vδ2
+ CD3
+ células miden a 5 h después de la estimulación de los
ex vivo
LR (n = 10) y R ( n = 10) con PBMCs BrHPP (3 M) o PMA /ionomicina (PMA /iono). D) Los porcentajes de IFN-γ
+ células (
panel de la izquierda
) y TNF-α
+ células (
panel de la derecha
) entre los Vδ2
+
+ midieron a 5 h después de las estimulaciones de
ex vivo
LR (n = 4) y R (n = 4) PBMCs con dosis crecientes de BrHPP (0,1 a 6 m). E) La expresión de la cadena CD3 medida en Vγ9Vδ2 PBMCs de los grupos LR y R. Porcentaje (
panel superior
) y IMF (
panel inferior
) de la tinción de CD3 en el Vδ2
+ CD3
+ células LR EOC PBMC (n = 5), R EOC PBMCs PBMCs (n = 3) y R donantes (n = 3). F) la expresión en las células CRTAM Vγ9Vδ2 mide a 20 h después de la estimulación de LR (n = 8) y R (n = 8) EOC PBMCs con BrHPP. No Stim:. Ninguna estimulación
La proliferación de citoquinas y reducción de la producción de células Vγ9Vδ2 podría ser el resultado de varios factores, incluyendo una expresión reducida de los receptores de células T CD3 cadenas, proporciones alteradas de ingenua y subconjuntos de memoria o una relación desfavorable de las células T reguladoras a las células Vγ9Vδ2. Estas posibilidades se investigaron posteriormente.
El nivel de expresión de las cadenas CD3 es similar entre las etiquetas
ex vivo
LR y R EOC PBMCs
La transducción de la señal de activación de los linfocitos T pasa a través las colas citoplasmáticas de las cadenas CD3 del receptor de células T. Un defecto en la expresión de estos componentes en
ex viv sobre O Vγ9Vδ2 se exploraron las células PBMCs de LR. Sin embargo, no se detectaron diferencias significativas en los porcentajes y niveles (MFI) de expresión de la cadena CD3 entre
ex vivo
LR y R Vγ9Vδ2 PBMC (Fig. 2E). También se compararon las capacidades de las células Vγ9Vδ2 en LR y R EOC PBMCs para expresar la restringidos de clase I molécula asociada a las células T (CRTAM) [24], que fue identificado recientemente por nuestro grupo como un marcador fenotípico que está fuertemente asociado con el activación de Vγ9Vδ2 PBMCs [25]. Curiosamente, después de la estimulación BrHPP, CRTAM se encontró que se expresa de manera similar (porcentaje y MFI) en células Vγ9Vδ2 tanto de LR y R PBMCs (Fig. 2F y datos no presentados).
la fracción de células Vγ9Vδ2 Naive se Reducido en
ex vivo
LR EOC PBMCs
los subconjuntos ingenua y la memoria de las células Vγ9Vδ2 fueron analizados en
ex vivo
LR y R EOC PBMCs según la expresión de CD27 y CD45 marcadores -Ra (Fig. 3). La frecuencia de células naive mediana entre Vγ9Vδ2 PBMCs fue significativamente menor en el grupo LR (37%) que en el grupo R (53%; Fig. 3). En consecuencia, la frecuencia de células de memoria media fue mayor en el grupo LR. Se encontró una correlación positiva significativa entre las frecuencias de células ingenuas entre Vγ9Vδ2 PBMC y las veces los aumentos de las células después de la estimulación Vγ9Vδ2 BrHPP (p = 0,041 según la prueba de correlación de Spearman). Dicha correlación no se encontró en experimentos realizados con Zol. Dentro del compartimento de la memoria, no se detectaron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos de riesgo bajo e I en las frecuencias de la central, efector o subconjuntos efectores terminales diferenciadas entre Vγ9Vδ2 PBMC (Fig. 3). Por lo tanto, no hay subconjuntos Vγ9Vδ2 memoria se enriquecieron preferentemente en el
ex vivo
LR EOC PBMCs.
Los porcentajes de ingenuo (CD27
+ CD45RA
+), memoria central (CM) (CD27
+ CD45RA
-), memoria efectora (EM) (CD27
-CD45RA
-) y diferenciación terminal de memoria efectora (TEMRA) (CD27
-CD45RA
+) células entre el Vδ2
+ CD3
+ células en
ex vivo
LR (n = 13) y R (n = 11) EOC PBMCs.
Un desequilibrio entre CD4
+ CD25
highFoxP3
las células T reguladoras altas y células Vγ9Vδ2 existe en
ex vivo
LR EOC PBMC, pero no participa en la expansión de células con deficiencias Vγ9Vδ2
las frecuencias de CD4
+ CD25
highFoxP3
células T reguladoras altas (Treg) y las proporciones de células T reguladoras a las células Treg (Vγ9Vδ2: relación Vγ9Vδ2) fueron exploradas en
ex vivo
LR y R EOC PBMCs. no se encontraron Las frecuencias de células Treg a ser significativamente diferente entre el LR y R EOC PBMCs (Fig. 4A). Sin embargo, una disminución significativa en las frecuencias de las celdas Vγ9Vδ2 en LR EOC PBMCs llevaron a Treg: relaciones Vγ9Vδ2 que fueron significativamente mayores en el grupo de bajo riesgo que en el grupo I (Fig. 4B). Es importante destacar, no se observaron correlaciones inversas entre estas relaciones y las veces los aumentos de células Vγ9Vδ2 que se midieron después de la estimulación con cualquiera de BrHPP o Zol (de acuerdo con el coeficiente de correlación de Spearman análisis, p = 0,07 y p = 0,67, respectivamente). Además, el agotamiento de las células T reguladoras en LR EOC PBMCs con microperlas anti-CD25 no mejoró la capacidad de expansión de las células después de la estimulación con Vγ9Vδ2 BrHPP o Zol (Fig. 4C). De hecho, no se observaron diferencias significativas en las frecuencias, los números o veces los aumentos de células Vγ9Vδ2 de PBMCs LR agotado-CD25 en comparación con LR PBMCs no agotado después de la estimulación con cualquiera de BrHPP o Zol (Fig. 4C y datos no presentados). Es de destacar que no hay agotamiento de células Vγ9Vδ2 y viabilidades celulares alterados fueron evidentes después de CD25-agotamiento (datos no mostrados). En conjunto, estas observaciones sugieren que el aumento de la proporción de células T reguladoras en comparación con las células Vγ9Vδ2 en LR EOC PBMCs no está implicado en el deterioro de la respuesta de las células Vγ9Vδ2.
A) de CD4
+ CD25
highFoxP3
alta celulares (Treg) y las frecuencias correspondientes Vδ2
+ CD3
+ frecuencias celulares en
ex vivo
LR (n = 13) y R (n = 11) CMSP. B) Las proporciones de células T reguladoras (%) a Vδ2
+ CD3
+ células (%) (Treg: Vδ2
+ ratio) entre los PBMCs en los grupos de riesgo bajo e R. PBMCs C) LR de pacientes EOC (n = 6) fueron estimulados con BrHPP (▴) o Zol (▪) e IL-2 antes y después del agotamiento de CD25
+ células; la proliferación de Vδ2
+ CD3
+ células se analizó en el día 7. frecuencias Vδ2
+ CD3
+ celulares entre células expandidas (
panel de la izquierda
) y Vδ2
+ CD3
+ veces los aumentos de células (
panel de la derecha
) se muestran.
Una frecuencia reducida de células Vγ9Vδ2 en
ex vivo
EOC PBMCs ≤0.35 % predice una respuesta ineficiente para la BrHPP y zoledronato
un análisis de la
ex vivo
continuación frecuencias celulares Vγ9Vδ2 se llevó a cabo en los cuatro grupos descritos anteriormente en la Tabla 1. la frecuencia de las células era Vγ9Vδ2 redujo significativamente en el grupo de LR en comparación con todos los otros grupos (Fig. 5A). Los valores de la mediana de las frecuencias de células Vγ9Vδ2 en PBMCs eran 0,28% para el grupo LR y 1,38% para el grupo R (Fig. 5A). Se observaron valores intermedios para los grupos Br-LR y LR-Zol, con frecuencias medias de 0,48% y 0,64%, respectivamente. Curiosamente, no se observaron diferencias significativas entre los, Br-LR, Zol-LR y R EOC grupos LR en las frecuencias de no Vδ2
+ γδ células T (Fig. 5B) o de células CD3
+ en las células PBMCs (Fig. 5C). Además, teniendo en cuenta toda la cohorte, se encontró una correlación positiva significativa entre los
ex vivo
frecuencias de las celdas Vγ9Vδ2 y el pliegue aumenta después de la estimulación con BrHPP pero no con Zol (p = 0,015 según las pruebas de correlación de Spearman). Además, las correlaciones positivas entre los
ex frecuencias celulares in vivo
Vγ9Vδ2 y el interferón-gamma-producciones en respuesta a cualquiera BrHPP o PMA /ionomicina (. Midieron en la figura 2C) se evidenciaron (p = 0,015 y p & lt; 0,001, respectivamente). Estos datos ponen de manifiesto una reducción específica en la frecuencia del subconjunto Vγ9Vδ2 que está fuertemente asociado con anomalías funcionales en LR EOC PBMCs.
Las frecuencias de Vδ2
+ CD3
+ células (A), Vδ2
-γδ
+ CD3
+ células (B) y CD3
+ células (C) entre LR (n = 16), Br-LR (n = 8), Zol-LR (n = 4) y R (n = 32) se muestran EOC PBMCs. Las diferencias entre el grupo LR y cada uno de los otros grupos se indican. A) Una característica receptor-operador (ROC se realizó) análisis en el que las muestras de PBMC LR se compararon con las otras muestras de PBMC. Las líneas discontinuas indican puntos de corte-en el 0,35% y el 0,8%. Sp: Especificidad. Se:. Sensibilidad
Para determinar si un valor de frecuencia de célula particular Vγ9Vδ2 podría utilizarse para predecir las respuestas ineficientes a ambos BrHPP y Zol, un receptor-operador se realizó característica análisis (ROC). A la frecuencia de células Vγ9Vδ2 entre PBMCs de 0,35% o menos siempre se asoció con respuestas bajas a ambos BrHPP y Zol (100% de especificidad). Para frecuencias de 0,8% o más, todas las expansiones eran eficientes con al menos uno estímulos. Para frecuencias de entre 0,35% y 0,8%, se observaron respuestas ineficientes a ambos estímulos y respuestas eficientes. Estos resultados demuestran que una frecuencia de células Vγ9Vδ2 de 0,35% o menos entre
ex vivo
PBMCs es predictiva de las respuestas ineficientes a ambos BrHPP y Zol.
A la frecuencia de células Vγ9Vδ2 de 0,35% o menos en
ex vivo PBMC
EOC es un marcador pronóstico negativo en pacientes EOC
para investigar las relaciones entre las células y las enfermedades Vγ9Vδ2 EOC, los datos clínicos de los pacientes fueron analizados en relación con las frecuencias de las celdas Vγ9Vδ2 en
ex vivo
PBMCs (Tabla 2 y Fig. 5). Entre todos los parámetros que se registraron en el momento de la recogida de sangre, una asociación sólo se estableció con la edad del paciente (Tabla 2). La mediana de edad fue significativamente mayor en el grupo que tenía frecuencias celulares Vγ9Vδ2 en PBMCs de 0,35% o menos (group≤0.35%) que en el grupo con frecuencias superiores a 0,35% (grupo & gt; 0,35%). Es importante destacar, no se observaron disminuciones en las concentraciones en sangre de leucocitos y PBMCs en el group≤0.35%, lo que confirma la deficiencia cuantitativa específica de células Vγ9Vδ2 en la sangre periférica. No se encontró asociación fue establecida entre esta deficiencia y la administración de quimioterapia antes de la extracción de sangre. Por otra parte, no se encontró correlación entre la deficiencia en las células de sangre periférica y Vγ9Vδ2 una etapa avanzada de la enfermedad o tumor de grado superior. Con respecto al tratamiento de los pacientes EOC (Tabla 2), no se observaron diferencias significativas entre el% group≤0.35 y el grupo & gt; 0,35% en la eficacia de la cirugía de reducción de volumen o en el tipo de quimioterapia recibido (Tabla 2). Sin embargo, se encontró que los resultados clínicos de los pacientes tratados con quimioterapia EOC ser distinta entre los grupos. Curiosamente, la proporción de pacientes que fueron refractarios a la quimioterapia fue significativamente mayor en el group≤0.35% (62,5%) que en el grupo & gt; 0,35% (17,5%) (Tabla 2). Además, el análisis univariado de la supervivencia libre de enfermedad con diferentes factores pertinentes revelaron que una frecuencia de células Vγ9Vδ2 de 0,35% o menos en PBMCs y una citorreducción óptima no son predictores de corta duración de la supervivencia libre de enfermedad (Tabla 3). Con una duración media de seguimiento de 13 meses para estos pacientes, la duración media de la supervivencia libre de enfermedad fue de 1 mes, en el group≤0.35% frente a 10 meses en el grupo & gt; 0,35% (Fig. 5). Es importante destacar que el valor pronóstico negativo de la frecuencia de células Vγ9Vδ2 reducción se mantuvo después de un ajuste en un análisis multivariado (Tabla 3).
Discusión
Los estudios anteriores han demostrado que convencional
ex vivo
Vγ9Vδ2 protocolos de expansión celular basado en la estimulación de PBMC con BrHPP o Zol fracasaron en un promedio de 35% de los pacientes con cáncer [12], [20] - [22], [26], [ ,,,0],27]. Aquí, hemos confirmado estas observaciones en EOC. De 60 muestras EOC PBMC, las expansiones ineficientes después de la estimulación con cualquiera de BrHPP o Zol ocurrieron en 40% y 33% de los casos, respectivamente. Curiosamente, nuestros análisis comparativos revelaron también que BrHPP y Zol difieren en sus capacidades para ampliar Vγ9Vδ2 PBMCs de pacientes. Las muestras que no se expandieron de manera eficiente con BrHPP podrían ampliarse de manera eficiente con Zol, y lo contrario también es cierto. Estos resultados sugieren que cada compuesto puede ser probado en ensayos de expansión de pequeña escala para permitir la elección de la mejor compuesto para cada paciente. Sin embargo, el 27% de las muestras de CMSP de pacientes con EOC permaneció ineficiente expandió con ambos compuestos (LR PBMCs). Hemos demostrado que las células Vγ9Vδ2 en estos
ex vivo
LR PBMCs no sólo habían reducido la capacidad de proliferación, sino también se muestra una producción alterada de citoquinas pro-inflamatorias IFN-gamma y TNF-a? En comparación con las células Vγ9Vδ2 de responder (R) PBMCs. dosis saturante de BrHPP no pudieron restaurar la respuesta de las células Vγ9Vδ2 en LR PBMCs. Estos resultados apoyan un defecto funcional intrínseca de LR Vγ9Vδ2 PBMCs y sugieren que el uso de dosis más altas de phosphoantigens para mejorar la respuesta de las células Vγ9Vδ2 en LR EOC PBMCs no tendría éxito. Para nuestro conocimiento, este es el primer
ex vivo
demostración de alteración de las funciones efectoras de células Vγ9Vδ2 en pacientes EOC.
Muchos parámetros podrían estar relacionados con esta funcionalidad reducida. La pérdida o reducción de la expresión de la cadena CD3 en las células T de pacientes con cáncer ha sido implicada en problemas de activación de las células T [28]. Sin embargo, no se observaron diferencias en la expresión de la cadena CD3 en
ex vivo
células Vγ9Vδ2 entre el LR y PBMCs R en nuestra cohorte EOC, lo que indica que la expresión de esta cadena no es causal. Los defectos en la expresión de marcadores de activación también podrían estar relacionados. Aquí, la molécula CRTAM, recientemente descrita por nuestro grupo como un marcador fenotípico que está fuertemente relacionado con la activación de Vγ9Vδ2 PBMCs [25], se encontró que se expresa de manera similar en las células Vγ9Vδ2 tanto de LR y R EOC PBMCs después de la estimulación BrHPP. Esta observación sugiere que los eventos de señalización que conducen a la expresión CRTAM no son defectuosos en Vγ9Vδ2 de LR PBMCs. Además, la presencia de CD4
+ CD25
highFoxP3
las células T reguladoras (Tregs altas) podría estar implicado en las deficiencias de las células Vγ9Vδ2 en pacientes con cáncer [29]. Datos recientes de Kunzmann
et al
. han documentado que un aumento en el Treg: relación Vγ9Vδ2 suprime la proliferación de células T γδ phosphoantigen inducida y contribuyó al estado de falta de respuesta inmunológica evidente para phosphoantigens que se observó en algunos pacientes con cáncer [27]. Nuestros resultados en pacientes con EOC mostraron un aumento de Treg: relación Vγ9Vδ2 en
ex vivo
LR PBMCs. Sin embargo, no hemos encontrado una correlación inversa entre esta relación y las veces los aumentos de células Vγ9Vδ2 en respuesta a cualquiera BrHPP o Zol. Por otra parte, Kunzmann
et al
. han informado de que el agotamiento de las células T reguladoras (utilizando CD25-agotamiento) en PBMCs-baja respuesta de los pacientes con tumores otros que EOC restauró la expansión de células en respuesta a Vγ9Vδ2 phosphoantigens. Aquí, la misma reducción de células en PBMCs de pacientes LR EOC no mejoró la proliferación de las células en respuesta a Vγ9Vδ2 phosphoantigens o aminobifosfonatos. En ensayos adicionales, hemos probado un método oblicua de agotamiento de las células para eliminar las células T reguladoras de LR EOC PBMCs preservando CD25
+ células activadas con el uso de las células CD4
+ CD25
+ CD127
dim /- Regulatory T Cell Aislamiento Kit II de Miltenyi Biotec (datos no mostrados). Curiosamente, los efectos de tales agotamiento sobre la proliferación de células Vγ9Vδ2 fueron similares a los observados con el CD25-agotamiento. En conjunto, estos resultados indican que las células T reguladoras no están involucrados en la proliferación de las células deteriorada Vγ9Vδ2 en EOC.
Por otra parte, las diferencias en el
ex vivo
proporciones de los subconjuntos de células Vγ9Vδ2 ingenua y la memoria podría ser asociado con la funcionalidad reducida de Vγ9Vδ2 EOC PBMCs, ya que se ha observado en otros tipos de cáncer [12], [21], [22]. En este documento, se encontró que el subconjunto ingenua se redujo significativamente en
ex vivo
LR EOC PBMCs. Esta disminución podría haber sido provocada por el cebado de antígeno repetida de células Vγ9Vδ2
in vivo
durante el desarrollo de la enfermedad y con la edad, lo que lleva a una marcada diferenciación de las células ingenuas para el compartimiento de celda de memoria en algunos pacientes. Las frecuencias de las celdas Vγ9Vδ2 en
ex vivo
PBMCs de pacientes también podrían estar relacionados con la expansión de células Vγ9Vδ2 ineficientes. Los datos de la literatura sobre este tema son divergentes. Una correlación entre los porcentajes de células basales Vγ9Vδ2 en PBMCs de diferentes pacientes con cáncer y el
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capacidades de expansión se ha establecido recientemente [12], mientras que otro estudio informó de ninguna asociación entre los mismos parámetros en una gran cohorte de los pacientes con diferentes tipos de cáncer [27]. Nuestro estudio de pacientes con EOC soporta el más reciente observación de la reducción de frecuencias de las celdas específicamente Vγ9Vδ2 en
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LR PBMCs. Estas deficiencias en Vγ9Vδ2 PBMC, junto con la disminución de la proporción del subconjunto ingenua que está dotado de capacidades de proliferación [30], podrían ser en parte responsable de la reducción de la proliferación celular Vγ9Vδ2 que se observaron en algunos LR EOC PBMCs. Es de destacar que las frecuencias de las celdas Vγ9Vδ2 de sangre periférica en pacientes con EOC no se vieron afectadas por la quimioterapia y que confirmaron una disminución dependiente de la edad de las frecuencias celulares Vγ9Vδ2 en pacientes EOC, como se ha observado por otros autores en sujetos sanos [31], [32]. Es importante destacar que, hemos demostrado que la frecuencia de células Vγ9Vδ2 entre los
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PBMCs de pacientes con EOC de 0,35% o menos siempre estaba relacionado con expansiones ineficientes en respuesta a BrHPP y a Zol. Estos datos identifican la frecuencia de células Vγ9Vδ2 en PBMCs de 0,35% o menos como un biomarcador único que podría ser útil para la predicción de expansiones ineficientes de PBMCs de pacientes con EOC en respuesta tanto a BrHPP- convencional o protocolos de expansión γδ basados en Zol.
Otro punto importante abordado en este estudio fue la relación entre las células Vγ9Vδ2 y los resultados clínicos de los pacientes EOC que fueron tratados con cirugía más quimioterapia basada en platino. derivados de platino han sido descritos como compuestos inmunomoduladores, y biomarcadores inmunes candidatos, tales como las células T delta gamma ya han sido implicados en la eficacia de estos agentes contra el cáncer [33], [34]. Dos estudios en el carcinoma de ovario avanzado humana, han comentado que la presencia de CD3-tumor infiltrante
+ células T se correlaciona con la mejora de los resultados clínicos de los pacientes que fueron tratados con cirugía más quimioterapia basada en platino [35], [36]. De estos dos estudios, también se ha reportado una correlación entre la presencia de células T delta gamma que se infiltran y un intervalo libre de enfermedad breve después del tratamiento [36]. Sin embargo, este estudio, que se basó en una evaluación molecular de TCRγ por análisis de PCR, no discriminó entre Vγ9Vδ2 y otras células delta gamma. Aquí, demostramos que los pacientes con EOC una disminución de la frecuencia de células Vγ9Vδ2 sangre periférica de 0,35% o menos, lo que se correlaciona fuertemente con un perfil funcional Vγ9Vδ2 PBMC con discapacidad, son más propensos a ser refractarios a la quimioterapia basada en platino y mostrar una disease- más corto tiempo de supervivencia libre después del tratamiento. Un análisis multivariante confirma que esta frecuencia reducida es un predictor independiente de tiempo de supervivencia libre de enfermedad. Por lo tanto, la frecuencia de células Vγ9Vδ2 en PBMCs podría ser utilizado como un biomarcador pronóstico en pacientes EOC. Tomados en conjunto, nuestros resultados respaldan la conclusión de que los resultados para los pacientes tratados con quimioterapia son más favorables cuando no hay deficiencias en el número y la funcionalidad de las células de sangre periférica Vγ9Vδ2. 1, Fig. 5;