Existen
Extracto
Los tumores sólidos en un microambiente hipóxico, y poseen metabolitos de alto glucolíticas. Para evitar la acidosis, las células tumorales deben presentar un mecanismo de regulación del pH citosólico dinámico (s). El canal de protones dependiente de voltaje HV1 media la función oxidasa NADPH mediante la compensación de la pérdida celular de electrones con protones. Aquí, demostramos por primera vez, que la expresión de HV1 se incrementa en colorrectal tejidos tumorales y líneas celulares, asociada con un mal pronóstico. La inmunohistoquímica mostró que HV1 se expresa fuertemente en los adenocarcinomas, pero no humilde o colorrectal expresada en normal o pólipos hiperplásicos. hv1 expresión en el cáncer colorrectal se asocia significativamente con el tamaño del tumor, la clasificación del tumor, los ganglios linfáticos, el estadio clínico y el estado de p53. HV1 alta expresión se asocia significativamente con la supervivencia global y libre de recurrencia más corto. Por otra parte, en tiempo real RT-PCR e inmunocitoquímica mostraron que HV1 es altamente expresado en líneas celulares de cáncer colorrectal, SW620, HT29, LS174T y Colo205, pero no en SW480. Las inhibiciones de expresión HV1 y la actividad en las células SW620 altamente metastásicas de pequeños ARN de interferencia (siRNA) y Zn
2 +, respectivamente, disminuyen significativamente la invasión celular y la migración, extrusión de protones contención y la recuperación del pH intracelular. Nuestros resultados sugieren que HV1 se puede usar como un biomarcador potencial para el diagnóstico y el pronóstico de carcinoma colorrectal, y un objetivo potencial para medicamentos contra el cáncer en la terapia del cáncer colorrectal
Visto:. Wang Y, Wu X, Li Q, Zhang S, Li SJ (2013) humano dependiente de voltaje de protones Canal HV1: Un nuevo biomarcador potencial de Diagnóstico y Pronóstico de cáncer colorrectal. PLoS ONE 8 (8): e70550. doi: 10.1371 /journal.pone.0070550
Editor: Rakesh K. Srivastava, la universidad del centro médico de Kansas, Estados Unidos de América
Recibido: 27 de enero de 2013; Aceptado 19 de junio de 2013; Publicado: 5 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31271464). La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El canal de protones dependiente de voltaje HV1 se identificó mediante búsquedas bioinformáticas basadas en los canales de cationes conocidos, que se expresa principalmente en las células inmunes como los macrófagos, neutrófilos, eosinófilos y [1], [2]. HV1 en fagocitos de mamíferos se propuso para ser responsable de la vía de protones de transporte, que regula el pH intracelular durante el consumo de oxígeno asociado con la fagocitosis, llamado "estallido respiratorio" [3], [4]. HV1 se activa por la despolarización y la acidificación intracelular, cuya actividad intracelular mantiene un pH neutro para mantener especies reactivas de oxígeno (ROS) de generación de [5], [6]. HV1 no sólo regula el pH en el citoplasma, pero también puede proporcionar protones en el fagosoma, un compartimiento de membrana cerrada de la matanza y la digestión de un patógeno [3]. HV1 es extremadamente selectivo para H
+, sin permeabilidad detectable a otros cationes [7], [8]. La relación de voltaje de activación de HV1 depende en gran medida tanto el pH intracelular (pH
i) y el pH extracelular (pH
O). El aumento de pH
O o disminución del pH
H I promueve la apertura
+ canal desplazando el umbral de activación a potenciales más negativos [3]. Por otra parte, la corriente HV1 es inhibida por concentraciones de Zn submilimolar
2 + y Cd
2 + y otros cationes divalentes [9]
HV1 contiene tres dominios predijo:. N-terminal ácido y prolina dominio rico, transmembrana dominio tensión-sensor (VSD), y el dominio C-terminal.
voltaje canales de K + se componen de cuatro subunidades, cada una de las cuales tiene un dominio poro y un variador de velocidad. Los cuatro dominios de poro se unen para formar un solo poro central, y cuatro VSD periféricos controlan la puerta del poro [10]. En contraste con el voltaje K
+ canales, el HV1 contiene un VSD pero carece del dominio de poro. Estudios recientes mostraron que las funciones de HV1 como un dímero en el que el dominio intracelular C-terminal es responsable de la arquitectura de la proteína dimérica, y cada subunidad contiene su propio protones de transporte de vía [11] - [14]. El dominio intracelular C-terminal de HV1 forma un dímero a través de un paralelo
α-helicoidal
espiral de la bobina y es esencial para la localización de la proteína [14].
Las células tumorales con frecuencia existen en una hipóxica microambiente, y poseen actividad de alto glucolítica y producir metabolitos ácidos [15], [16]. Para evitar la acidosis resultante de la reducción en el pH citosólico, las células tumorales deben extruir excessing protones citosólicas para mantener el pH citosólico, que se traduce en microambiente tumoral ácido. El microentorno del tumor hipóxico y ácido juega un papel clave en el desarrollo del cáncer, la progresión y la metástasis [15]. Nuestro trabajo anterior mostró que HV1 se expresa específicamente en los tejidos tumorales de mama humano altamente metastásicas y líneas celulares, y promueve la progresión de células de cáncer de mama y metástasis, a través de la regulación de las células del cáncer de mama pH intracelular [17], [18]. En el presente estudio, se determinó la expresión de HV1 en los tejidos tumorales de colon y líneas de células y su potencial asociación con las características clínico-patológicos y supervivencia post-reseccional. Inhibición de la expresión y actividad HV1 en las células de cáncer colorrectal metastásico altamente disminuyen significativamente la invasión celular y la migración, extrusión restricción de protones. Nuestros resultados sugieren que la sobre-expresión HV1 se puede usar como un biomarcador independiente para el pronóstico y el diagnóstico de pacientes con cáncer colorrectal.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Todo de los procedimientos se realizaron de conformidad con la Declaración de Helsinki y las políticas pertinentes en china. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes en nuestro estudio. La aprobación ética del estudio obtenido para nuestro estudio del comité de ética de Tonghua Hospital Center.
Pacientes y muestras
muestras de tejido de cáncer colorrectal se obtuvieron de pacientes que se sometieron a cirugía curativa de rutina en el Departamento de Cirugía , hospital Centro de Tonghua entre 2001 y 2007. Los pacientes no fueron pretratados con radioterapia o quimioterapia antes de la cirugía. 139 tejidos de cáncer colorrectal y tejidos colorrectales no tumorales adyacentes apareados se fijaron en 10% de formalina y embebidos en parafina para el análisis inmunohistoquímico. Las características clinicopatológicas de estos pacientes se muestran en la Tabla 1. Además, para verificar la expresión de HV1 en lesiones displásicas premalignas, 10 colorrectal normal 18 pólipo hiperplásico y 20 tejidos adenoma También se examinaron mediante inmunohistoquímica. el estado clínico de cada paciente fue clasificado de acuerdo con el grado tumoral patológico, el tamaño del tumor, los ganglios linfáticos. la diferenciación del tumor fue clasificado por el sistema de clasificación Edmondson. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de Tonghua Hospital Center, y el consentimiento informado se obtuvo de cada paciente.
Generación de un anticuerpo policlonal anti-
HV1
Un anti-HV1 policlonal anticuerpo fue generado contra el dominio carboxilo terminal de HV1 (residuos 221-273 de HV1, KTRSERQLLRLKQMNVQLAAKIQHLEFSCSEKEQEIERLNKLLRQHGLLGEVN). La proteína se purificó a homogeneidad después de la expresión en
Escherichia coli
[19]. La proteína purificada se inyectó en ratones y el anticuerpo policlonal anti-HV1 se purificó por rProtein A Sepharose (GE, Healthcare) columna. Cabra conjugado con HRP IgG anti-ratón se adquirieron de Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. (West Grove, PA).
vector de expresión y transfección
HV1 cDNA fue clonado en pEGFP-N1 (Clontech ) para crear HV1 plásmido de expresión pHv1-EGFP, fusionado con la proteína fluorescente verde mejorada resto (EGFP) unido al C-terminal de HV1 [14]. 293 T células se cultivaron en DMEM (medio de Eagle modificado de Dulbecco; GIBCO) con 10% de suero fetal bovino más antibióticos (100 unidades /ml de penicilina y 100 g /ml de estreptomicina, GIBCO) en una CO 5%
2 incubadora a 37 DO. Las células cultivadas en cubreobjetos de vidrio a 50-70% de confluencia en una placa de seis pocillos fueron transfectadas transitoriamente con pHv1-EGFP plásmido utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante. Las células se utilizaron para los experimentos 36 a 48 h después de la transfección.
Western blotting
Western Blot se realizó con un anticuerpo anti-HV1 anticuerpo policlonal (1 mg /ml) como se describe anteriormente con una dilución final de 1 1000. Las proteínas desnaturalizadas se separaron por 12,5% de SDS-PAGE y después se transfirieron a una membrana de PVDF (GE, Healthcare) mojando dispositivos electrotransferencia. la absorción de proteínas no específica se evitó el uso de 5% (w /v) de leche descremada en solución salina tamponada con fosfato que contiene 0,1% de Tween 20 (PBS-T) durante 1 h. incubación del anticuerpo primario en PBS-T se realizó durante 1 h a temperatura ambiente. El anticuerpo secundario anti-ratón acoplado a HRP se utilizó a una dilución final de 1 15 000 en PBS-T, y HRP se reveló con un sistema de detección quimioluminiscente (Millipore).
Inmunohistoquímica
histológico diagnósticos de tejidos fijados en formalina y embebidos en parafina tumorales y no tumorales fueron confirmados en hematoxilina y eosina secciones manchadas. La inmunohistoquímica se realizó con un anticuerpo policlonal anti-HV1. El anticuerpo-HV1 contra (1,0 mg /ml) se diluyó 100 veces con PBST (solución salina tamponada con fosfato que contiene 0,1% de Tween-20) que contiene 1% (w /v) de BSA. Las secciones incluidas en parafina llenos de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) de tampón 10 mM (pH 8,0) se calentaron en un horno de microondas durante 12 min. Después de enfriar, las secciones se trataron con 0,5% Triton X-100 en PBS durante 10 min, expuesto a 3% (v /v) de peróxido de hidrógeno (H
2O
2) durante 10 min para inhibir la actividad de la peroxidasa endógena . Posteriormente, las secciones se incubaron en PBST que contiene 5% de suero bovino fetal y 2% de BSA durante 30 min para reducir la unión no específica. La incubación con el anticuerpo primario se realizó durante la noche a 4 ° C en una cámara humidificada. anticuerpo secundario anti-ratón acoplado a HRP se utilizó a una dilución final de 1 400 por 1 h. Por último, la señal de visualización se desarrolló con diaminobenzidina (DAB) y los portaobjetos se contratiñeron en hematoxilina. El control negativo se realizó para tratar con suero de ratón no inmune como anticuerpo primario en lugar de anticuerpo anti-HV1.
Las secciones teñidas fueron evaluadas en una forma ciega sin conocimiento previo de la información clínica mediante la puntuación inmunorreactiva alemán, inmuno-reactiva-Score (IRS). En pocas palabras, el IRS asigna calificaciones de sub-distribución inmunorreactiva (0-4) y la intensidad (0-3), luego se multiplica para obtener la puntuación del IRS. El porcentaje de positividad fue marcado como "0" (& lt; 5%), "1" (5-25%), "2" (25-50%), "3" (50-75%), "4" ( & gt; 75%). La intensidad de la tinción fue la puntuación de acuerdo con el área de las células de tinción HV1-positivos como "0, -" (negativo, & lt; 5%), "1, +" (débilmente positivo, 5-25%), "2, ++ "(positivo, 25-50%), y" 3, +++ "(fuertemente positiva, & gt; 50%). La puntuación final de la expresión HV1 se calcula a partir de los valores de la puntuación de porcentaje de positividad y la puntuación de la intensidad de la tinción, que se varió de 0 a 12. Se estimó IRS promediando los valores en ocho campos en 500 × magnificación para cada muestra. los niveles de expresión HV1 se definieron de la siguiente manera: una baja expresión (puntuación ≤3) y de alta expresión (score & gt; 3). El análisis inmunohistoquímico y puntuación fueron realizadas por dos patólogos independientes con experiencia.
Cultivo de células
Las líneas celulares de cáncer colorrectal humano SW620, HT29, LS174T, se cultivaron Colo205 y SW480 a 37 ° C en una atmósfera de 95% de aire y 5% de CO
2 con DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 U /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina y 20 mM de L-glutamina.
la inmunocitoquímica
SW620, HT29, LS174T, las células Colo205 y SW480 cultivadas en cubreobjetos de vidrio en confluencia en placas de cultivo tisular de seis pocillos se fijaron con paraformaldehído al 4% en PBS a temperatura ambiente durante 30 min (v /w), se lavaron en PBS, se trató con 0,5% Triton X-100 en PBS durante 20 min, se expone a 3% (v /v) de peróxido de hidrógeno (H
2O
2) durante 15 min, y se bloqueó con 5% fetal de suero bovino y 2% de BSA en PBST durante 20 minutos a temperatura ambiente. Los cubreobjetos bloqueadas se incubaron con el anticuerpo anti-HV1 (1,0 mg /ml) a una dilución de 1 200 con PBST que contenía 1% (w /v) de BSA a 37 ° C durante 1 h. Después de lavar en PBS por tres veces, los cubreobjetos se incubaron adicionalmente con el anticuerpo secundario acoplado a HRP anti-ratón a una dilución final de 1 400 por 1 h. Las señales se visualizaron por el sistema de HRP /DAB. Los núcleos celulares se tiñeron con hematoxilina.
Cuantitativo PCR en tiempo real
Los niveles de expresión de ARNm de HV1 en SW620, HT29, LS174T, Colo205 y las células SW480, fueron evaluados por cuantitativa en tiempo real PCR utilizando el Sistema de ABI PRISM 7000 de detección de secuencias (Applied Biosystems, Foster City, CA). ARN totales se extrajeron mediante RNAiso Reactivo (Takara), y la transcripción inversa de MMLV transcriptasa super (Takara). Cuantitativa en tiempo real PCR de transcripción inversa se realizó con el Kit de SYBR PrimeScriptTM RT-PCR (Takara) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cebadores fueron los siguientes: HV1, 5'-CAGGTCATCATCATCTGCTTG-3 '(hacia delante) y 5'-CCGTTCTGAACGTGTCTTAAC-3' (marcha atrás); GAPDH, 5'-CCAAGGTCATCCATGACAAC-3 '(hacia delante) y 5'-AGAGGCAGGGATGATGTTCT-3' (hacia atrás). PCR condición térmica utilizada fue: 94 ° C durante 30 s; recocido, 52 ° C durante 30 s; extensión, 72 ° C durante 30 s. Los niveles de expresión de ARNm de proteínas se calcularon según la ecuación: 2
-ΔΔCT, en el que ΔΔCT = (CT
HV1 - CT
GAPDH) - (CT
HV1 - CT
GAPDH )
SW620. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
inmunofluorescencia
SW620 y SW480 células cultivadas en cubreobjetos de vidrio se fijaron con 4% (v /v) de paraformaldehído en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a temperatura ambiente durante 30 min, se lavaron en PBS, se trató con 0,5% Triton X-100 en PBS durante 20 min, y se bloquearon con suero bovino fetal al 5% y 2% de BSA en PBST durante 1 h. Los cubreobjetos bloqueados se incubaron con anticuerpo anti-HV1 (1,0 mg /ml) a una dilución de 1 200 en 2% de BSA a 4 ° C durante la noche. Después de lavar con PBS durante 5 min para cuatro veces, los cubreobjetos se incubaron adicionalmente durante 1 h a temperatura ambiente con una cabra conjugado con FITC anti-IgG de ratón a una dilución de 1 400 en 2% de BSA, seguido de otro lavado como se describió anteriormente . Las imágenes confocales de fluorescencia FITC de SW620 y las células SW480 se registraron en un Leica TCS SP5 microscopía confocal (Leica, Alemania) con el conjunto de FITC-filtro para HV1 y el filtro DAPI fijado para el tinte DAPI nuclear. Las imágenes fueron posteriormente procesados por el software Adobe Photoshop.
expresión de ARNm que suprime el HV1
La secuencia del siRNA dirigidos al gen HV1 fue 5'-CTACAAGAAATGGGAGAAT-3 ', y la secuencia aleatoria fue sentido 5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 ', ambos de los cuales se obtuvieron de Ribobio (Guangzhou, china) [17]. se pasaron las células SW620 cultivadas a confluencia en placas de 6 pocillos a 30% de confluencia y se incubaron durante la noche, a continuación, transfectadas con el ARNsi y el control negativo, respectivamente, utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen), de acuerdo con el protocolo del fabricante. La concentración final de ARNsi fue de 100 nM. El silenciamiento se examinó a 48 h después de la transfección. La eficiencia de siRNA en la supresión de la expresión HV1 se determinó por cuantitativa en tiempo real PCR, inmunocitoquímica e inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpo anti-HV1 como se describe anteriormente.
cinética de migración
Para examinar el efecto de HV1 en la capacidad migratoria de las células de cáncer colorrectal, las migraciones de SW620, SW480, SW620 y células regulados hacia abajo la expresión y la actividad HV1 HV1 inhibido de siRNA y Zn
2 +, respectivamente, fueron evaluados en el modelo de monocapa herido. Para regular a la baja la expresión de HV1, se cultivaron las células SW620 hasta la confluencia y se transfectaron con ARNsi de control negativo y por 24 h, respectivamente. Para inhibir la actividad de HV1, se añadió una solución 1 M ZnCl en el medio DMEM a una concentración final de 100 mM [1], [2]. Se sembraron las células SW620 y SW480 en una placa de 24 pocillos (1,5 x 10
5 por pocillo) y se cultivaron durante 24vh hasta la confluencia y, posteriormente, con una punta de heridos. Se observó el movimiento de células en el microscopio de contraste de fase, y se capturaron con una cámara digital cada 12 h.
Invasión y migración ensayos
in vitro
invasión y migración fueron Ensayos in realizado para evaluar los efectos de HV1 sobre las capacidades invasivas y migratorias de las células SW620 y SW480. células SW620 y SW480 se cultivaron en placa de seis pocillos en medio DMEM con 10% de FBS en la confluencia, transfectadas con el ARNsi de control negativo y, respectivamente, durante 24 h, y luego se tripsinizaron, se lavaron y se contaron. Para la invasión de células, cultivos polarizados con 8 micras filtros de tamaño de poro (Millipore) fueron cubiertas con Matrigel (Becton Dickinson) y se inserta en placas de 24 pocillos. Y para la migración de células, los cultivos polarizados no se recubrieron con matrigel. medio DMEM (500 l) que contiene 10% de FBS se añadió a la cámara inferior, y 200 l de una suspensión de células (5 x 10
4 células) se colocó en la cámara superior. Las placas se incubaron a 37 ° C en atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2 para 24 h. Para inhibir la actividad de HV1, se añadió una solución 1 M ZnCl en el medio DMEM a una concentración final de 100 mM [1], [2]. Las células fueron fijadas penetrado por paraformaldehído, se tiñeron con solución de cristal violeta, y se fotografiaron. Cada experimento se llevó a cabo cuatro veces. Las tasas de migración y la invasión se calcularon como [la migración celular Nº de celda de ensayo /migración Número de control de
SW620] × 100% y [celular invasión Nº de celda de ensayo /invasión Número de control de
SW620] × 100%, respectivamente.
actividad de HV1 canal
La actividad de HV1 en células de cáncer colorrectal se evaluó como un cambio en el pH intracelular (pH
i) en respuesta a la despolarización de membrana por BCECF fluorescencia [11]. Las células se incubaron con 3,0 M de BCECF-AM (Molecular Probe) en medio DMEM libre de suero durante 30 min, respectivamente, y se lavaron con solución de PSS (NaCl 140 mM, KCl 5 mM, glucosa 5 mM, CaCl 1
2, MgCl 1 mM
2, Tris 20 mM, pH 7,5) durante 3 veces. Las células se incubaron con NH
4Cl /NMDG (N-metil D-glucamina) solución (mM NMDG 100, NH 40 mM
4Cl, mM KCl 5, glucosa 5 mM, CaCl 1
2, 1 mM MgCl
2, Tris 20 mM, pH 7,3) durante 20 min y se lavó por disolución libre de amonio (NMDG mM 140 mM, KCl 5, glucosa 5 mM, CaCl 1
2, mM MgCl 1
2, 20 mM Tris, pH 7,4), que induce rápidamente la acidificación intracelular [5]. despolarización de la membrana se logró mediante la carga de alta K
+ solución (KCl 145 mM, glucosa 5 mM, CaCl 1 mM
2, mM MgCl 1
2, Tris 20 mM, pH 7,5). pH intracelular cambia células-ácido cargado se detectaron por BCECF sonda fluorescente en longitudes de onda de excitación de 490 nm y 440 nm y una longitud de onda de emisión de 525 nm bajo membrana condición de despolarización usando RF-5301PC Spectrofluorophotometer (Shimadzu, Japón).
las mediciones de pH intracelular
pH intracelular se midió utilizando la sonda fluorescente sensible al pH BCECF-AM. Las células cultivadas en las monocapas se incubaron con 3,0 M de BCECF-AM (Molecular Probe) en medio DMEM libre de bicarbonato a 37 ° C durante 30 min. Después de la carga, las células se lavaron tres veces con tampón HEPES para retirar el tinte extracelular, y obligados a permanecer en el tampón idénticas. El tampón HEPES contenía NaCl 140 mM, KCl 5 mM, MgSO 1
2 mM NaH 1
2 PO
4, glucosa 5,5 mM y HEPES
4 mM, CaCl 1 20, pH 7.4. La fluorescencia a longitudes de onda de excitación de 490 nm y 440 nm se registró en una longitud de onda de emisión de 525 nm usando RF-5301PC Spectrofluorophotometer (Shimadzu, Japón). La calibración de la fluorescencia vs pH se realizó mediante equilibrio de pH externo e interno con nigericina (10 mM) en un alto K
+ tampón con una gama de pH 5,5 a 8,0. El alto K
+ tampón contenía KCl 145 mM, glucosa 5 mM, CaCl 1 mM
2, 1 mM de MgCl
2, y HEPES 20 mM (o MES). Los valores de la relación de fluorescencia relativa se representaron frente a pH
i valores, lo que permitió la determinación del pH desconocido
i correspondiente.
El análisis estadístico
Todas las estadísticas se realizaron con SPSS16.0 software. Los datos de medición se representan como media ± desviación estándar. La comparación de la media entre los grupos se realizó mediante la
t
prueba.
Los valores P Restaurant & lt; 0,05 se consideró significativo. El análisis de supervivencia se evaluó mediante el método y la supervivencia de Kaplan-Meier tasa se comparó con la prueba de log-rank.
Resultados
hallazgos clínico-patológicas
perfiles clínico-patológicas de los 139 casos seleccionados para este estudio fueron revisados en la Tabla 1. La edad media de los pacientes fue de 62,4 años (rango, 36-76), incluyendo 68 varones y 71 mujeres. Las ubicaciones de sus cánceres de 29 procedimientos de izquierda lados y 43 por dos puntos del lado derecho, y 47 recto, respectivamente. Entre los 139 casos resecados, el tamaño del tumor primario variado como sigue: & lt; 5 cm en 72 casos, y ≥ 5 cm en 67 casos. Veinte de 139 tumores mostraron una pobre diferenciación citológica. La extensión del tumor estaba limitado (T1 o T2) en 45 casos y avanzado (T3 o T4) en 94 casos. se observó metástasis del tumor a los ganglios linfáticos en 59 de 139 casos.
aumento de expresión de HV1 en el cáncer colorrectal
HV1 expresa en células inmunes se asocia con "estallido respiratorio" [3], [ ,,,0],4], pero su función en la tumorigénesis no ha sido identificado. Para investigar HV1 para el uso como un biomarcador potencial y objetivo terapéutico para el cáncer colorrectal, la expresión HV1 en 139 tejidos de cáncer de colon y los tejidos normales emparejados, 10 colorrectal normal 20 adenoma colorrectal y 18 tejidos de pólipos hiperplásicos, se detectó mediante inmunohistoquímica con un anticuerpo anti-HV1 anticuerpo policlonal que se generó en casa. Para examinar la especificidad del anticuerpo, 293 células T fueron transfectadas con plásmido de expresión pHv1-EGFP. Y la expresión de HV1-EGFP se detectó por inmunocitoquímica y Western Blot con el anticuerpo, y la fluorescencia EGFP. Los resultados mostraron que el anticuerpo reconoce específicamente HV1 y EGFP es un marcador para la expresión HV1 (Fig. 1A y B).
A, 293 T células fueron transfectadas con pHv1-EGFP plásmido y observados por un Leica TCS SP5 microscopia focal. a, observación de fluorescencia EGFP. Hv1-EGFP fluorescencia se representa en verde. b, inmunofluorescencia anti-HV1 (longitudes de onda TRITC) (rojo). c, mancha DAPI para visualizar los núcleos (azul). d, la imagen es fusionada compuesta de la fluorescencia EGFP, inmunofluorescencia anti-HV1, y la tinción DAPI. B, 293 T células fueron transfectadas con el vector pcDNA3.1 y el plásmido pcDNA-HV1, respectivamente. Y HV1 se detectó por Western Blot. C, HV1 se expresa en tejidos de cáncer colorrectal. un (100x) y B (500 ×), c (100 ×) y D (500 ×), colorrectal tejidos normales; e (100x) yf (x 500), tejidos adenoma; g (100 ×) y h (500 ×), i (100 ×) y J (500 ×), k (100 ×) y L (500 ×), tejidos de cáncer colorrectal. En los tejidos normales colorrectal, pólipos hiperplásicos y tejidos adenoma colorrectal, la tinción fue negativa o débilmente positivo. En los tejidos tumorales, se observó una intensa inmunorreactividad a HV1. HV1 se observa principalmente en la membrana plasmática (h, j y l) (como se indica por puntas de flecha). El HV1 se tiñe de marrón, mientras que los núcleos de fondo son de color azul.
Tal como se muestra en la Fig. 1C y en la Tabla 2, HV1 tinción fue principalmente moderado o positivo fuerte en tejidos de cáncer colorrectal, pero no en colorrectal normal y tejidos pólipo hiperplásico. HV1 se observó principalmente en la membrana plasmática de las células tumorales en los tejidos de colon, como se muestra en la Fig. 1C (h, j y l) (como se indica por puntas de flecha). En los tejidos adenoma colorrectal, la tinción fue negativa o débilmente positivo (Fig 1C, e y f;. Tabla 2). HV1 en tejidos de cáncer colorrectal se expresó significativamente en comparación con la de colorectal normal pólipos hiperplásicos y tejidos adenoma, lo que sugiere que HV1 puede estar implicada en la tumorigénesis colorrectal. En general, 106 de los 139 (76,3%) casos mostraron alta HV1 expresión en los tejidos tumorales (IRS sobre 3), mientras que el 33 (23,7%) de los casos mostraron una baja expresión (IRS 0-3). En general, la densidad de HV1 fue significativamente mayor en los tejidos de cáncer que en los tejidos adenoma (7,20 ± 3,25 frente a 2,20 ± 2,12) (Tabla 2).
La expresión de alto HV1 se asocia con un mal pronóstico
las correlaciones entre HV1 de expresión y clínico-patológicas características se resumen en la Tabla 3. No hubo asociaciones significativas con la profundidad de la clasificación de tumores (
P
= 0,007), la edad (
P = 0,021
) , el tamaño del tumor (
P
= 0,000), los ganglios linfáticos (
P
= 0,000), el estadio clínico (
P
= 0,000) y p53 estado (
P = 0,014
) en pacientes que tenían una expresión de alto HV1 en comparación con los pacientes que tenían una baja expresión HV1. No se encontró asociación significativa entre la expresión HV1 y las otras características clínicas, como el género, la diferenciación y la expresión de Ki-67. Además, las correlaciones entre los niveles de expresión de p53, Ki-67, TopoII, GST-π y P-gp y características clínico se mostraron en la Tabla 4. p53 estado relacionada con la clasificación del tumor (
P = 0,011
), Ki-67 a la diferenciación (
P
= 0,010), TopoII a la diferenciación (
P
= 0,010), y GST-π con el tamaño del tumor (
P =
0,007) y diferenciación (
P
= 0,000). Sin embargo, la P-gp no mostró significación estadística con parámetros clínico.
Kaplan-Meier de supervivencia mostraron que los pacientes que tenían una expresión de alto HV1 eran más propensos a tener una menor supervivencia global (
P = 0,008
, Fig. 2A) y la supervivencia libre de recurrencia (
P = 0,008
, Fig. 2B), en comparación con los pacientes que tenían una baja expresión HV1, lo que sugiere que HV1 sobre-expresión puede ser asociado con un pronóstico clínico pobre. Los pacientes que tenían una alta expresión HV1 tenían una pobre supervivencia libre de recurrencia (
P
= 0,008) en comparación con los pacientes que tenían una baja expresión HV1 (análisis univariado) (Tabla 5). La supervivencia global examinados por el análisis univariado de Cox también indicó que la alta expresión de HV1 se asoció significativamente con la supervivencia más corta (
P
= 0,008). Los análisis de regresión de Cox univariante mostraron que el nivel de expresión HV1 se asoció significativamente con libre de recurrencia y la supervivencia global, mientras que otras características clínicas perdieron su importancia predictiva. Por otra parte, la regresión de Cox análisis multivariado reveló que la alta expresión de HV1 fue factor de riesgo independiente para la supervivencia global (riesgo relativo [RR] = 0,443,
P = 0,015
) y la supervivencia libre de recurrencia (RR = 0,427,
P
= 0,026) (Tabla 6). Los pacientes que tenían una alta expresión de HV1 eran propensos a tener una recurrencia temprana en comparación con los pacientes que tenían una baja expresión de HV1 (37,4 ± 3,0 vs 47,2 ± 10,7,
P Hotel & lt; 0,008). (Tabla 5)
los pacientes con baja expresión tienen más global y la supervivencia libre de enfermedad que los pacientes con alta expresión.
Distribución de HV1 en líneas de células colorrectales humanos
Para examinar si HV1 también se expresa en líneas celulares de cáncer colorrectal humano, la expresión de HV1 en líneas celulares de cáncer colorrectal humano, SW620, HT29, LS174T, Colo205 y SW480, fue detectado por inmunocitoquímica y en tiempo real RT-PCR. Como se muestra en la Fig. 3, los niveles de expresión de HV1 entre estas líneas celulares de cáncer colorrectal tienen diferencia significativa. HV1 se expresa en un alto nivel en SW620, HT29, LS174T, y las células Colo205, pero no en las células SW480. La localización de HV1 en las células SW620 se determinó mediante una microscopía confocal. Como se muestra en la Fig. 3C, HV1 es altamente expresado en las células SW620, que se localiza en ambos sitios intracelulares y de membrana plasmática (como se indica por puntas de flecha), mientras que HV1 apenas se expresa en las células SW480. El resultado de que la expresión HV1 es mayor en las células SW620 que la de las células SW480 es idéntico con los resultados de inmunocitoquímica (Fig. 3A) y el tiempo real de RT-PCR (Fig. 3B).
A, HT29 (una , 200 ×), LS174T (b, 200 ×), Colo205 (c, 200 ×), SW480 (d, 200 ×), SW620 (e, 200 ×) y SW620 (f, 500 ×) detectó por inmunocitoquímica. B, los niveles de mRNA de expresión de HV1 en SW620, HT29, LS174T, Colo205 y células SW480 estimados por cuantitativa en tiempo real PCR. Los valores son medias ± SD (
n
= 3). *
P Hotel & lt; 0,05, en comparación con las células SW620. C, SW620 (a, byc) y SW480 (d, eyf) las células cultivadas en cubreobjetos de vidrio en la confluencia en una placa de seis pocillos de cultivo de tejidos se tiñeron con anticuerpo anti-HV1 y observado por microscopía SP5 confocal Leica TCS . A y D, inmunofluorescencia anti-HV1 (FITC, verde). B y E, tinción DAPI para visualizar los núcleos (azul). C y F, las imágenes fusionadas son compuestos de anti-HV1 inmunofluorescencia y tinción DAPI. HV1 se observa en membrana plasmática y sitios intracelulares en las células SW620 altamente metastásicas (como se indica por puntas de flecha), pero no en las células SW480 metastásicos mal. D, la expresión de HV1 en HT29, células SW620 y SW480, se detectó por Western Blot. Baja regulación de la expresión HV1 se llevó a cabo por siRNA dirigidos HV1 (HT29-si, SW620 y SW480-si-si).
La inhibición de la actividad de HV1 disminuye la invasión y la migración de células de cáncer colorrectal metastásico altamente
La invasión y la migración son dos características prominentes de la malignidad del tumor. Para evaluar la contribución de HV1 al potencial invasivo y migratoria en células de cáncer colorrectal, hemos realizado ensayos de invasión y migración. En primer lugar, se analizó la cinética de la capacidad migratoria de SW620, SW480 y células HT29. Higo. 4A, B y C mostraron la cinética de migración de SW620 (Fig. 4A), SW480 (Fig. 4B) y HT29 (Fig. 4C) de las células. Una monocapa heridos de las células SW620 permitido para el cierre de heridas después de 48 h (Fig. 4A, a, b, c, d y e). SW620 y HT29 (Fig. 4C, a, b, c, d y e) células cerradas la herida dramáticamente más rápido que las células SW480 (Fig. 4B, a, b, c, d y e). Con el fin de la baja regulación de la expresión HV1 y la inhibición de la actividad de HV1, el siRNA dirigidos HV1 y una concentración final de 100 mM ZnCl
2 [1], se utilizaron [2], respectivamente. Las eficiencias de HV1 knock-down con siRNA en SW620, SW480 y células HT29 fueron evaluadas por Western Blot, que mostró la reducción de los niveles de proteína HV1 sobre siRNA desmontables en SW620 y células HT29 (Fig. 3D). Supresiones de expresión HV1 por siRNA (f, g, h, i y j en la Fig. 4A, B y C) y la actividad HV1 por 100 M ZnCl
2 (k, l, m, n y o en la Fig. 4A Como se muestra en la Fig. Como se muestra en la Fig. Como se muestra en la Fig.