Extracto
Antecedentes
La regulación aberrante de phosphatidylinositide 3-quinasas (PI3-K) /Akt activada por AMP, la proteína quinasa (AMPK) y mamíferos objetivo de rapamicina (TOR-m ) vías de señalización en el cáncer ha llevado a un interés significativo en la supresión de estas vías para tratar el cáncer. El ácido cafeico (CA) se ha informado que poseen importantes acciones anti-inflamatorias. Sin embargo, los mecanismos moleculares por los cuales los derivados de CC, incluido el éster fenetilo ácido cafeico (CAPE) y éster de ácido cafeico fenilpropilo (CAPPE), ejercen efectos inhibidores sobre la proliferación de células de cáncer colorrectal humano (CRC) aún no se han dilucidado.
Metodología /Principales conclusiones
CAPE y CAPPE fueron evaluados por su capacidad para modular estas vías de señalización y suprimir la proliferación de células CRC tanto
in vitro
y
in vivo
. Los efectos anticancerígenos de estos derivados de CA se midieron mediante el uso de ensayos de proliferación, análisis del ciclo celular, ensayo de transferencia Western, ensayo de gen reportero y de inmunohistoquímica (IHC) ensayos de tinción tanto
in vitro
y
in vivo
. Este estudio demuestra que CAPE y CAPPE exhiben una inhibición dependiente de la dosis de la proliferación y supervivencia de las células de CRC a través de la inducción de G
0 /G
1 detención del ciclo celular y el aumento de las vías de apoptosis. El consumo de CAPE y CAPPE inhibió significativamente el crecimiento de los tumores de colon en un modelo de xenoinjerto de ratón. Los mecanismos de acción incluyen una modulación de PI3-K /Akt, la AMPK y m-TOR cascadas de señalización tanto
in vitro
y
in vivo
. En conclusión, los resultados demuestran mecanismos novedosos contra el cáncer de derivados CA contra el crecimiento de células humanas de CRC.
Conclusiones
derivados de CA son agentes anticáncer potentes que aumentan la activación de AMPK y promueven la apoptosis en las células de CRC humanos. La estructura de los derivados de CA se puede utilizar para el diseño racional de nuevos inhibidores que se dirigen a las células humanas CRC
Visto:. Chiang E-PI, Tsai SY, Kuo YH, Pai MH, Chiu NS, Rodríguez RL, et Alabama. (2014) derivados del ácido cafeico inhibe el crecimiento de cáncer de colon: La participación de la PI3-K /Akt y AMPK vías de señalización. PLoS ONE 9 (6): e99631. doi: 10.1371 /journal.pone.0099631
Editor: Chih-Pin Chuu, Institutos Nacionales de Investigación en Salud, Taiwán
Recibido: 3 Julio, 2013; Aceptado: 16-may de 2014; Publicado: 24 Junio 2014
Derechos de Autor © 2014 Chiang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este material se basa en el trabajo apoyado, en parte, por el Ministerio de Educación, Taiwán, República de China en el marco del plan de ATU, beca del Consejo Nacional de Ciencia, en virtud de acuerdos NSC-100-2320-B-039-003, 100-2628-B005-002-MY4, 101-2320-B-039-054-MY3, 101-2320- B-005-006-MY3, 102-2911-I-005 -301, 101-2811-B-039-024, el Departamento de Salud de subvención en virtud de acuerdos DOH 102-TD-B-111-004 y el DOH-102- TD-C-111-005 y la Universidad médica de china (CMU) subvención en virtud de acuerdos de adjudicación CMU101- -10, CMU100-ASIA-11, CMU101-ASIA-3, y CMU101-S-25. Las opiniones, resultados, conclusiones o recomendaciones expresadas en esta publicación son las del autor (s) y no reflejan necesariamente la opinión del Ministerio de Educación, Consejo Nacional de Ciencias, Departamento de Salud, Universidad Nacional Chung Hsing, Universidad de Medicina de Taipei de la Universidad de Asia, Universidad de California en Davis y la Universidad de Medicina china. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es una de las principales causas de cáncer y la mortalidad por cáncer en muchos países [1], [2]. Sólo en los Estados Unidos, aproximadamente 50.000 muertes se atribuyen a este tipo de cáncer cada año [1], [2]. Muchos estudios han indicado que las mutaciones de la phosphatidylinositide 3-quinasa (PI3-K) /Akt y de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) /extracelular de señal regulada quinasa (ERK) moléculas se observan comúnmente en varios tipos de cáncer [3] , [4]. Por ejemplo, la activación oncogénica de las moléculas de PI3-K /Akt aumenta la proliferación celular, aumentando el nivel de ciclina D1 [5], [6]. Es bien sabido que la expresión aberrante de las ciclinas D1 y Cdk4 proteínas está implicada en la proliferación de células de CRC [7]. Represión de la PI3-K /Akt y vías de señalización /ERK MAPK conduce al bloqueo de la proliferación celular y demuestra la importancia de estas cascadas de señalización en el control tanto de la progresión del ciclo celular y el crecimiento celular durante el desarrollo del cáncer [4], [8] . Por lo tanto, la PI3-K /Akt y MAPK vías de señalización /ERK juegan un papel predominante en la determinación del destino de crecimiento del tumor. células de cáncer malignas se desprenden del tumor primario y migran a través de las barreras estructurales, incluyendo las membranas basales y la matriz extracelular del estroma circundante (ECM) [9]. la invasión tumoral y la metástasis tanto requieren un aumento en la expresión de metaloproteinasas de la matriz (MMPs) y de la degradación de ECM [9], [10]. MMP son endopeptidasas dependientes de cinc capaces de componentes de ECM degradantes [11]. Las enzimas tales como MMP-9 ECM degrade y crear un microambiente que mantiene el desarrollo de tumores [10], [11].
AMP-activated proteína quinasa (AMPK) es una molécula de combustible con sensor que funciona como un regulador de la balance de energía [12]. AMPK se ha demostrado que se expresa de forma ubicua en las células de mamíferos y de estar involucrados en la homeostasis de la energía [13]. Un aumento de monofosfato de adenosina (AMP) /trifosfato de adenosina ratio (ATP), lo que refleja una disminución en el estado de energía de la célula, conduce a la activación de la proteína AMPK por fosforilación [14]. El aumento de la activación de AMPK se cree que se correlaciona inversamente con el riesgo de cáncer [15]. Estudios recientes han sugerido además que la activación de la PI3-K /Akt y moléculas de señalización MAPK /ERK está asociada con una disminución del nivel de fosforilados AMPK (activada) en el curso de la progresión del tumor [16], [17]. Estudios adicionales llegaron a la conclusión de que los agonistas de AMPK son eficaces en el tratamiento del cáncer [15], [18], mientras que otros estudios mostraron que la ácido graso sintasa de la enzima lipogénica (FASN) está regulada por la ingesta de energía y desempeña un papel crucial en la carcinogénesis [19] . Un estudio reciente informó que la expresión de FASN se correlaciona con el crecimiento y la progresión de la CRC [20]. La fosforilación (activación es decir) de Akt fue mostrado para inducir la expresión de FASN y para activar malignidad agresiva en las células del cáncer [21]. En contraste, el tratamiento con un agonista de la AMPK, que conduce a la activación de AMPK, suprimió la expresión de FASN y bloqueó el crecimiento de tumor colorrectal [22] - [24]. Por otra parte, los estudios epidemiológicos indican además que AMPK (PRKAG2) polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) está asociado con el riesgo de CRC humana [25]. Por lo tanto, la AMPK mediada homeostasis de la energía ha atraído el interés en esta vía como medio de tratamiento de cáncer de colon humano
.
Muchos estudios han demostrado que la función de los compuestos de ácido fenólico como potentes antioxidantes [26]. Entre ellos, el ácido cafeico (CA) es un compuesto fenólico no vitamina que se encuentra en gran medida en las verduras y frutas. Además de su actividad antioxidante, CA ejerce efectos anti-inflamatorios en varios tipos de células [27], [28]. Estudios recientes indican que el éster fenetilo ácido cafeico (CAPE), un derivado de CA de forma natural aislado de propóleo de abejas, también ejerce sus efectos beneficiosos a través de actividades antioxidantes y anti-inflamatorias [29], [30]. Además, se ha demostrado que CAPE inhibe la proliferación de células cancerosas y actúan como un agente anti-cáncer de potencial [31], [32]. Sin embargo, no hay ningún informe de los efectos inhibidores de los derivados de CA en la vía de AMPK y /o expresión de FASN durante la progresión de la CRC. Por otra parte, la falta de resultados consistentes a través de numerosos estudios y el fracaso para determinar el mecanismo de acción de los derivados de CA puede explicar la dificultad de demostrar la
in vivo
beneficios de la suplementación CA derivado de la aparición del CCR. Hemos investigado, por lo tanto, los efectos inhibidores de diversos derivados de CA en las células humanas, tanto CRC
in vitro
y
in vivo
. Los resultados demostraron que los derivados de CA como CAPE y éster de ácido cafeico fenilpropilo (CAPPE) inhibe la proliferación celular significativamente en las células humanas CRC. CAPE y CAPPE inducen la detención del ciclo celular a través de la supresión de los PI3-K /Akt y mTOR vías de señalización. Además, los derivados CA reducen los niveles celulares de ATP y suprimen la expresión de FASN. El mecanismo de acción se asocia en parte con un aumento de la vía de la AMPK. Los resultados de este estudio sugieren que los derivados de CA actúan como agentes quimiopreventivos contra CRC humano mediante la modulación de las vías de señalización PI3-K /Akt, mTOR y AMPK tanto
in vitro y
in vivo
.
Materiales y Métodos
Reactivos y anticuerpos
células de cáncer de colon humano HCT-116 y SW-480 fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (Walkersville, MD). Los siguientes anticuerpos monoclonales se compraron de Señalización Cell Technology, Inc .: Anti-N-cadherina (# 4061), PTEN (# 9559), PDK1 anti-fosforilación (Ser241;#3061), el total-PDK1 (# 3062), anti -phosphorylation Akt (S473;#4060), el total de Akt (# 9272), anti-fosforilación GSK3α (S21;#9327), total- GSK3α (4337), anti-fosforilación de GSK3 (S9;#9323), total- GSK3 (# 9315), FOXO3 anti-fosforilación (T32;#9464), FOXO3 total- (# 12829), TSC1 total- (# 6935), TSC2 total- (# 3990), LKB1 total- (# 3047), total- 14-3-3 (# 8312), anti-fosforilación de ERK 1/2 (T202 /Y204;#9101), el total de ERK 1/2 (# 9102), anti-fosforilación AMPKα (T172;#2535), total- AMPKα (# 5832), m-TOR anti-fosforilación (S2448;#5536), el total de m-TOR (2983), anti-FASN (# 3180), anti-NF-kappa B (p65) (# 3033), anti -Cdk4 (# 2906), anti-p21
WAF /CIP1 (# 2947), e anti-ciclina (# 4132), anti-ciclina D1 (# 2978), anti-c-myc (# 9402) y anti -Lamin A (# 2032) (Danvers, MA). El anticuerpo y el compuesto C anti-β-actina (# A2066) (inhibidor específico de AMPK) se adquirieron de Sigma (St Louis, MO). La Akt activa (Myr-Akt1, Addgene plásmido#9008) y el control de vector vacío (pcDNA3, Addgene plásmido#10792) se obtuvieron de Addgene. El tumor necrosis factor α (TNF-α) proteína recombinante era de amp I +; D System (Minneapolis, MN). El Kit de Extracto de reactivo de proteínas nucleares se adquirió de Pierce Biotechnology Inc. (Lackford, IL). El kit de ensayo de detección de luminiscencia ATP (ATPlite kit) se adquirió de Perkin Elmer Life Science (Boston, MA). El plásmido NF-kB elemento de respuesta (NF-kappa B-RE) y kit Dual-Luciferase reportero de ensayo se adquirieron de Promega (Madison, WI). PI (yoduro de propidio) y anti-antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA) (# 610664) anticuerpos monoclonales se compraron de BD Biosciences Inc. (Franklin Lakes, NJ). derivados de CA, incluyendo CAPE y CAPPE (Figura 1) fueron proporcionados por el Dr. Y. H. Kuo (China Medical University). Estos derivados de CA se disolvieron en sulfóxido de dimetilo (DMSO) a una concentración de solución madre 200 mM y se almacenaron a -20 ° C. Inmediatamente antes del experimento, se añadió la solución madre al medio de cultivo celular, como se describió anteriormente.
Los derivados de CA se representan en la Fig. 1. (A) CAPE y (B) CAPPE difieren en el alargamiento de la cadena lateral alquilo del éster del ácido cafeico.
Cultivo de células
resumen, las células fueron cultivadas CRC humanos en un incubador humidificado 37 ° C con 5% de CO
2 y se cultivaron hasta confluencia utilizando suero fetal bovino (FBS), complementado medio RPMI-1640. Las células utilizadas en los diferentes experimentos tienen el mismo número de pases. medio RPMI-1640 se complementó con 10% FBS inactivado por calor, 2 mM L-glutamina y bicarbonato de sodio /L 1,5 g.
suplementación con derivados CA
células CRC humana se incubaron con diferentes concentraciones (0, 5, 10, 20, 50 y 100 mM) de los derivados de CA para 2 h o 24 h. Para la absorción eficiente de los derivados de CA por las células de cáncer de colon humano, estos compuestos se incorporan en FBS durante 30 min y se mezcla con el medio. En los grupos de control, las células se incubaron con un volumen equivalente de disolvente DMSO. (Concentración final: 0,05% v /v) como un vehículo portador
Evaluación de la proliferación celular
El MTT (3- [4,5-dimethhylthiaoly] - bromuro) de ensayo de 2,5-difeniltetrazolio se llevó a cabo para detectar la proliferación celular. CRC células humanas se sembraron en placas de 24 pocillos, así que contienen 1 × 10
5 celdas cada uno. Después de 24 h, el medio de cultivo fue reemplazado por los medios que contienen derivados de CA a una de las cinco concentraciones (es decir, 0, 5, 10, 20, 50 y 100 mM) en presencia o ausencia del compuesto C. Las transfecciones de Akt constitutivamente activa ( Myr-Akt1, Addgene plásmido 9008) y el vector vacío (pcDNA3, Addgene plásmido 10792) se llevaron a cabo utilizando el reactivo de transfección Lipofectamina LTX. Cada concentración se ensayó por triplicado. Al final del experimento, una de las placas fue tomada y MTT fresco (ml en PBS concentración final de 0,5 mg /) se añadió a cada pocillo. Después de 2 h de incubación, se descartaron los medios de cultivo, se añadieron 200 l de isopropanol ácido a cada pocillo y se hace vibrar para disolver el depositante. La densidad óptica se midió a 570 nm con un lector de microplacas.
Análisis cuantitativo de ciclo celular por citometría de flujo
células CRC cáncer de colon humano se cultivaron en placas de 6 pocillos a una densidad de 1 x 10
6 células por pocillo. Antes del experimento, las células se sincronizan cultivándolas en el 0,05% de SFB suplementado medio RPMI-1640 durante la noche hasta CABO o tratamiento CAPPE. Para medir la distribución del ciclo celular, las células fueron tratadas con el cabo o CAPPE (0, 10, 50, 100 mM) durante 24 h adicionales. Se recogieron las células después del tratamiento con una solución de tripsina y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y se suspendieron con el tampón de unión (1 × 10
5 células /ml). CRC células humanas se tiñeron con PI y se analizaron siguiendo el protocolo del fabricante. En resumen, se añadieron cinco microlitros de PI a las células en suspensión y se incubaron a temperatura ambiente en la oscuridad y se analizaron por citometría de BD FACSCanto flujo (BD Biosciences Inc., Franklin Lakes, NJ). Se analizaron las células teñidas con PI utilizando el software de accesorios.
xenoinjerto implantación del embrión humano de las células tumorales
Para establecer el modelo de xenoinjerto en ratones, se les dio cultivos subconfluentes de células de cáncer de colon HCT-116 fresco medio 24 h antes de ser cosechadas por un breve tratamiento con 0,25% de tripsina y 0,02% EDTA. La tripsinización se detuvo con medio que contiene 10% de FBS, y las células se lavaron dos veces y se resuspendió en medio RPMI 1640 libre de suero. Sólo una sola célula suspensiones con una viabilidad & gt; 90% se utilizaron para las inyecciones
Animales, dieta y suplementación CA Derivado
Adultos (3-4 semanas de edad) Balb /c Ann. ratones desnudos -Foxn1 (19-22 g) se obtuvieron del Laboratorio Nacional Center Animal (Taipei, Taiwan). Los ratones se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos en instalaciones aprobadas por el Laboratorio Nacional Centro de Animales de conformidad con normas y estándares actuales (protocolo de animales no. 102 a 142-N). El protocolo de uso animal que se enumeran más arriba ha sido revisado y aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad Médica de China. El estudio de los animales se realizó de acuerdo a la norma nacional y el protocolo aprobado animales con el fin de mantener el bienestar animal y aliviar el sufrimiento de los animales de experimentación. Durante todo el período experimental, los ratones fueron alimentados con una dieta estándar de laboratorio 5010 adquirido de LabDiet Inc. (St. Louis, MO, EE.UU.). La dieta estándar contiene grasa cruda (13,5% de la energía total de la dieta), proteína (27,5%) y carbohidratos (59%), y no tenía derivados CA detectables, como se indica por el proveedor. Los ratones que habían sido anestesiados con una inhalación de isofluorano se colocaron en una posición supina. Los ratones fueron por vía subcutánea (s.c.) inyectados con cáncer de colon humano HCT-116 células (1 × 10
6 /0,1 ml de medio) en el flanco derecho de cada ratón nude BALB /C Ann-Foxn1. Una ampolla bien localizada fue considerado como un signo de una inyección técnicamente satisfactoria.
Después de la inoculación, los ratones se dividieron en tres subgrupos (n = 6 por grupo). derivados de CA se les dio a los animales de experimentación mediante sonda una vez al día en un volumen total de 0,15 ml. Los grupos CAPPE CAPE y cada uno recibió una dosis oral diaria de derivados de CA disueltos en aceite de maíz (4% w /w) a 50 nmol /kg de BW, una vez por día. El grupo de control recibió tumor aceite de maíz (4% w /w) una vez al día solamente. Los ratones normales sin tumor- inoculación se utilizaron como control negativo. El volumen del tumor se calculó mediante la siguiente fórmula: 0,524 L1 (L2)
2, donde L1 y L2 representan el eje largo y corto del tumor, respectivamente. BW se determinó una vez por semana. No se encontraron diferencias significativas de la ingesta de alimentos o el peso corporal en este estudio. Al final del periodo experimental, los animales fueron sacrificados por CO
2 inhalación; tejidos tumorales fueron entonces extirparon, se pesaron, y se congelaron inmediatamente. Estos tejidos tumorales se seccionaron y se tiñeron con hematoxilina eosina de Mayer (H & amp; E) para su examen al microscopio óptico. Los tejidos restantes del hígado, pulmón, bazo, páncreas y el intestino también se extirparon, se pesaron y se congelaron para experimentos adicionales. Las muestras de sangre se recogieron desde el corazón en un tubo vacutainer de 1 ml en presencia o ausencia de heparina y se centrifugaron durante 10 min a 1.000 g para obtener el plasma o suero, respectivamente.
tinción histopatológica e inmunohistoquímica de tejidos tumorales
tejidos tumorales congelados se cortaron en 5 secciones micras e inmediatamente se fijaron con 4% de paraformaldehído. Las secciones fueron teñidas con hematoxilina de Meyer-eosina (H & amp; E) para microscopía de luz. Los controles negativos no mostraron ninguna tinción. Tres puntos calientes se examinaron en un modo ciego por sección tumor (campo de alta potencia 200 ×) de seis tumores diferentes en cada grupo. Para la tinción inmunohistoquímica, las secciones de tejido congelado se trataron con peróxido de hidrógeno 0,3% para bloquear la actividad de peróxido endógeno. La unión de proteína no específica se bloqueó con 10% de suero de cabra normal (NGS) durante 1 hr seguido de incubación con anticuerpos anti-FASN o anti-PCNA anticuerpos primarios (1:300). Las secciones de tejido se lavaron con solución salina 0,1 M de tampón fosfato (PBS) y se incubaron con inmunoglobulina G biotinyated (1:300 anticuerpo secundario) a temperatura ambiente durante 1 hr. Las secciones de tejido se tiñeron con complejo avidina-biotina (ABC), diaminobencidina (DAB) y peróxido de hidrógeno. Los núcleos celulares se tiñeron con hematoxilina. Imágenes se realizó en 200 × aumentos. Las imágenes de las secciones del tumor fueron adquiridas en un microscopio Olympus BX-51, usando una cámara de imagen y sistema digital Olympus DP-71 (Olympus, Tokio, Japón).
Preparación de la proteína de extracción
CRC Humano HCT-116 células se cultivaron en medio de cultivo FBS 10% en presencia de CAPE o CAPPE durante 2 h o 24 h. Los lisados celulares (citoplasmáticas y proteínas nucleares) de las células de cáncer de colon se prepararon utilizando el kit de reactivos de la proteína que contiene un extracto nuclear inhibidores de inhibidores de la proteasa y de fosfatasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la centrifugación durante 10 minutos a 12.000 x g para eliminar los restos celulares, los sobrenadantes se conservaron como un extracto citoplásmico. No se detectó contaminación cruzada entre las fracciones nucleares y citoplasmáticas (datos no mostrados).
Detección de plasma de MMP-9 mediante ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)
El nivel de plasma de MMP-9 fue medida por ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante (R & amp; D Systems Inc.). Brevemente, se añadió un 100 l diluido muestra de plasma (1:08 dilución) de cada grupo a cada pocillo y se analizó. Al finalizar el proceso de ELISA, la placa se leyó a 450/570 nm de longitud de onda usando un lector de microplacas (Tecan Inc., Mannedorf, Suiza).
Análisis de los niveles celulares de ATP
CRC humana las células se cultivaron durante 24 h en placas de 96 pocillos, conteniendo cada pocillo 1 × 10
4 células en presencia del Cabo o CAPPE. Las mediciones de ATP celular fueron analizados siguiendo el protocolo del fabricante. Brevemente, los lisados celulares se prepararon utilizando directamente tampón de lisis celular. lisado celular total (100 l) se mezclaron con solución de sustrato y se hace vibrar para disolver los depósitos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La densidad óptica se midió con un Multi-Modo lector de microplacas Synergy HT (BioTek, Winooski, VT).
análisis de transferencia Western
Las proteínas celulares (70 g) se fraccionaron en un 10% SDS PAGE, transferidos a una membrana de nitrocelulosa, la inmunotransferencia con anti-fosforilación anticuerpo monoclonal Akt, y realizado con ensayo basado en quimioluminiscencia. La fosforilación de proteínas de PDK1, la fosforilación de GSK3α, la fosforilación de GSK3, la fosforilación de FOXO3, la fosforilación de AMPK, la fosforilación de m-TOR, PTEN, N-cadherina, PDK1, Akt, GSK3α, GSK3, FOXO3, TSC1, TSC2, mTOR, LKB1 , 14-3-3, AMPK, FASN, NF-kB (p-65), ciclina D1, Cdk4, PCNA, p21
CIP1 /WAF1, se midieron la ciclina e y c-myc en los lisados celulares usando el mismo procedimiento descrito anteriormente. Las transferencias fueron despojados y reprobed con anticuerpos A o bien β-actina o lamina como el control de carga.
Reportero ensayo de gen
La transfección de elemento de respuesta a NF-kB (NF-KB-RE) plásmido se llevó a cabo en humanos CRC HCT-116 y las células SW-480 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. CRC humano HCT-116 y las células SW-480 se sembraron a una densidad de 2 × 10
5 células por pocillo en placas de 12 pocillos en 2 ml de medio y se incubaron durante la noche. Las células se trataron con CAPE o CAPPE a diferentes concentraciones durante 24 h antes del análisis de las actividades del gen indicador. El ensayo de gen indicador se realizó utilizando kit Dual Luciferase reportero de ensayo. intensidades de luciferasa se midieron usando un Multi-Modo lector de microplacas Synergy HT (BioTek, Winooski, VT).
El análisis estadístico
Una metodología cuantitativa se utilizó para determinar si había alguna diferencia significativa en la viabilidad celular así como la expresión de proteínas entre las series experimentales y conjuntos de control de células de cáncer de colon. En resumen, los análisis estadísticos de las diferencias en la viabilidad celular entre conjuntos por triplicado de las condiciones experimentales se realizaron utilizando software SYSTAT. La confirmación de una diferencia en la viabilidad celular como significativa requiere rechazo de la hipótesis nula de no diferencia entre los índices medios obtenidos de los conjuntos de réplicas de los grupos experimentales y de control en el
P
= 0,05 nivel, utilizando el ANOVA de una vía modelo. Se utilizó el test post hoc de Bonferroni para determinar las diferencias entre los diferentes grupos.
Resultados
derivados
CA, inhibió la proliferación de las células humanas CRC
in vitro
se investigaron los efectos inhibitorios de los derivados de CA sobre la proliferación de células humanas (CRC HCT-116 y las células SW-480)
in vitro
. Como se muestra en la Figura 2-3, derivados de CA (en las concentraciones de 5, 10, 20, 50 y 100 mM) inhibió significativamente la proliferación de humano CRC HCT-116 y las células SW-480. A las concentraciones de 5, 10, 20, 50 y 100 m, CAPE y CAPPE cada una contención significativa de la proliferación de las células HCT-116 CRC humanos, respectivamente. (Efectos inhibitorios de CABO: 4, 31, 47, 54, y 58%; CAPPE: 5, 45, 56, 59 y 64%) (Figura 2A). Las CI50 para CAPE y CAPPE en células HCT-116 CRC humanos son de 44,2 micras y 32,7 m, respectivamente. A las concentraciones de 5, 10, 20, 50 y 100 mM, CAPE y CAPPE suprimió significativamente la proliferación de células CRC SW-480 humanos, respectivamente. (Efectos inhibidores de los CAPE: 0,5, 8,9, 14, 19 y 32%; CAPPE: 6, 15, 22, 26 y 47%) (Figura 3A). Las CI50 para CAPE y CAPPE en células SW-480 CRC humanos son 132,3 130,7 M y M, respectivamente. Estos resultados demuestran que CAPE y CAPPE son cada uno capaces de inhibir significativamente la proliferación de células de CRC humanos en una manera dependiente de la dosis. CAPPE parece inhibir la proliferación de células HCT-116 CRC humanos con más eficacia que CAPE. Por esta razón, se seleccionaron CAPE y CAPPE para su posterior estudio de sus posibles efectos contra el cáncer en células humanas de CRC. Se investigó el papel de las moléculas sobre la proliferación celular en las células de CRC humanos tratados con derivados de CA de señalización. En estas células, Akt era o sobre-expresó por transfección con un plásmido Myr-Akt1 constitutivamente activa, o la actividad de AMPK se inhibió por el compuesto C. Como se muestra en la Figura 2A, tanto la sobre expresión de Akt y supresión de la actividad AMPK rescató la proliferación celular inhibida por los tratamientos del Cabo o CAPPE en células HCT-116 CRC humanos. Los efectos de la sobre-expresión de Akt actividad AMPK reducido en el rescate de la proliferación celular o eran menos significativo, sin embargo, en las células SW-480 tratadas con CA-derivado (Figura 3A). Los niveles de expresión de p-Akt y proteínas t-Akt por la sobreexpresión de una forma constitutivamente activa de Akt en humanos CRC HCT-116 y las células SW-480 se muestran en la Figura 2B y la Figura 3B, respectivamente. Los niveles de expresión de p-AMPK y proteínas t-AMPK por el tratamiento del compuesto C en humanos CRC HCT-116 y las células SW-480 se muestran en la Figura 2C y la Figura 3C, respectivamente. Los resultados sugieren que los derivados de CA actúan como agentes quimiopreventivos contra CRC humano a través de una modulación de las vías de señalización PI3-K /Akt y AMPK
CRC humano HCT-116 células (A) se cultivaron en medio RPMI-1640 con CAPE y CAPPE (a concentraciones de 0, 5, 10, 20, 50 y 100 mM) en presencia o ausencia de compuesto C (10 mM) durante 24 h. Las transfecciones de Akt constitutivamente activa (Myr-Akt1) y el vector vacío (pcDNA3) se llevaron a cabo antes de que el tratamiento de los derivados CA. La proliferación celular se midió mediante el ensayo MTT como se describe en Materiales y Métodos. Los datos son la media ± SD (desviación estándar) de tres experimentos independientes. Los diferentes símbolos (??? para CAPE y ▵ para CAPPE) representan una diferencia estadísticamente significativa en comparación con el grupo control -untreated derivado de CA en cada grupo, respectivamente, en P & lt; 0,05. Los diferentes símbolos (# para CAPE_Akt, § para CAPE_compound C, ▴ para CAPPE_Akt, y ▪ para CAPPE_compound C) representan una diferencia estadísticamente significativa en comparación con cada CA correspondiente derivative- tratado grupo control en cada subgrupo de dosis, respectivamente, en P & lt; 0,05. (B-C) Proteínas citoplasmáticas se prepararon para el análisis de Western blot utilizando anticuerpos monoclonales contra el anti-fosforilación de Akt (S473), el total de Akt, anti-fosforilación AMPKα (T172) y Total-AMPKα.
SW-480 células CRC Humanos (a) se cultivaron en medio RPMI-1640 con el cabo y CAPPE (a concentraciones de 0, 5, 10, 20, 50 y 100 mM) en presencia o ausencia del compuesto C (10 mM) para 24 h. Las transfecciones de Akt constitutivamente activa (Myr-Akt1) y el vector vacío (pcDNA3) se llevaron a cabo antes de que el tratamiento de los derivados CA. La proliferación celular se midió mediante el ensayo MTT como se describe en Materiales y Métodos. Los datos son la media ± SD (desviación estándar) de tres experimentos independientes. Los diferentes símbolos (??? para CAPE y ▵ para CAPPE) representan una diferencia estadísticamente significativa en comparación con el grupo control -untreated derivado de CA en cada grupo, respectivamente, en P & lt; 0,05. Los diferentes símbolos (# para CAPE_Akt, § para CAPE_compound C, ▴ para CAPPE_Akt, y ▪ para CAPPE_compound C) representan una diferencia estadísticamente significativa en comparación con cada CA correspondiente derivative- tratado grupo control en cada subgrupo de dosis, respectivamente, en P & lt; 0,05. (B-C) Proteínas citoplasmáticas se prepararon para el análisis de Western blot utilizando anticuerpos monoclonales contra el anti-fosforilación de Akt (S473), el total de Akt, anti-fosforilación AMPKα (T172) y Total-AMPKα.
CAPE y CAPPE cada inducida G
0 /G
1 la detención del ciclo celular en las células CRC
para determinar si la supresión de CA derivada mediada por la proliferación celular se debió a un arresto en una cierta etapa de la ciclo celular, los efectos de CAPE y CAPPE se estudiaron adicionalmente en HCT-116 y las células SW-480. Las células tratadas con CABO o CAPPE fueron sometidos a análisis de citometría de flujo después de su ADN se tiñeron con PI. Los histogramas de los datos de citometría de flujo se muestran en la Figura 4A. CAPE y CAPPE significativamente inducida detención del ciclo celular en el G
0 /G
1 fase de una manera dependiente de la dosis (P & lt; 0,05). A una concentración de 50 mM, CAPE y CAPPE aumentaron significativamente la detención del ciclo celular de las células HCT-116 durante el G
0 /G
1 fase hasta en un 56% y 61%, respectivamente, mientras que en el grupo de control el porcentaje de células en el G
0 /G
1 fase fue sólo el 34% (Figura 4B). A una concentración de 50 mM, CAPE y CAPPE aumentaron significativamente la detención del ciclo celular de las células SW-480 durante el G
0 /G
1 fase hasta en un 44% y 57%, respectivamente, mientras que en el grupo de control el porcentaje de células en el G
0 /G
1 fase fue sólo el 37% (Figura 4C). Estos aumentos de G
0 /G
1 detención eran en su mayoría a expensas de los S y G
2 /M fase de poblaciones de células. CAPPE parece inducir G
0 G
1 la detención del ciclo /célula con más eficacia que el cabo en células humanas de CRC. Por lo tanto, es plausible que CAPE y CAPPE inhibieron la proliferación celular de las células CRC humanos a través de una detención del ciclo celular en el G
se sincronizaron 0 /sub> 1
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