Extracto
Antecedentes
El propósito de este estudio fue demostrar la viabilidad de una plataforma de microarrays de oligonucleótidos longmer al perfil de genes alteraciones del número de copias en líneas celulares de cáncer de próstata y para indicar rápidamente nuevos genes candidatos, que puede jugar un papel en la carcinogénesis.
Métodos /resultados y conclusiones
cribado de todo el genoma para las regiones de ganancias y pérdidas genéticas en las líneas celulares de cáncer de próstata y nueve (PC3, DU145, LNCaP, CWR22 y sublíneas derivados) se llevó a cabo mediante hibridación genómica comparativa en un microarray de oligonucleótidos 35,000 función (arrayCGH). En comparación con cromosómico convencional CGH, más deleciones y pequeñas regiones de ganancias, particularmente en regiones pericentromeric y regiones próximas a los telómeros, se detectaron. Como validación de la alta resolución de arrayCGH que además analiza una pequeña amplificación de 1,7 MB en 9p13.3, que fue encontrado en CWR22 y CWR22-RV1. El aumento del número de copias fue confirmado por fluorescencia
In situ
hibridación utilizando el RP11-165H19 clon BAC de la región amplificada que comprende los dos genes de interleuquina 11 receptor alfa (
IL11-RA
) y dynactin 3 (
DCTN3
). El uso de PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) podríamos demostrar que
IL11-RA
es el gen con el más alto número de copias ganancia en las líneas celulares en comparación con
DCTN3
sugiriendo
IL11-RA
a ser el blanco de amplificación. Proyección de 20 carcinomas de próstata primarios por qPCR reveló un
IL11-RA
copia el número de ganancia en el 75% de los tumores analizados. Ganancia de
DCTN3
se encuentra sólo en dos casos, junto con una ganancia de
IL11-RA
.
Conclusiones /Importancia
ArrayCGH utilizando microarrays de ADN longmer es factible para análisis de alta resolución de desequilibrios chomosomal. Caracterización de una pequeña región obtenida en 9p13.3 en líneas celulares de cáncer de próstata y cáncer de próstata muestras primarias por fluorescencia
In situ
hibridación y PCR cuantitativa ha revelado interleucina gen de la alfa del receptor 11 como un candidato objetivo de amplificación con una amplificación frecuencia de 75% en los carcinomas de próstata. amplificación frecuente de
IL11-RA
en el cáncer de próstata es un mecanismo potencial de
IL11-RA
sobreexpresión en este tipo de tumor
Visto:. Kamradt J, V Jung, Wahrheit K, L Tolosi, Rahnenfuehrer J, Schilling M, et al. (2007) La detección de amplicones Novel en el cáncer de próstata por Integral genómico de perfiles de líneas celulares de cáncer de próstata Uso ArrayCGH basados en oligonucleótidos. PLoS ONE 2 (8): e769. doi: 10.1371 /journal.pone.0000769
Editor Académico: Stefan Maas, Lehigh University, Estados Unidos de América
Recibido: 5 de Julio, 2007; Aceptado: 18 Julio 2007; Publicado: 22 Agosto de 2007
Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la declaración Creative Commons Public Domain que estipula que, una vez colocado en el dominio público, este trabajo puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitirse, modificarse, construida sobre, o de otra forma utilizado por cualquier persona con cualquier objeto lícito
Financiación:. Deutsche Forschungsgemeinschaft, número de concesión KA1793 /1-1, für Bildung und Bundesministerium Forschung, el número de concesión 01GR0453, red de excelencia BioSapiens , número de contrato de la UE LSHG-CT-2003-503265
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Las alteraciones genéticas se cree que son clave eventos en el desarrollo de la mayoría de los tumores, como el cáncer de próstata [1]. La progresión tumoral parece depender de la adquisición sucesiva de aberraciones cromosómicas que conducen a pérdidas o ganancias de parte del genoma de la célula tumoral. Por lo tanto, la caracterización de estas alteraciones genómicas en el cáncer de próstata puede ayudar a entender la patogénesis molecular y puede revelar marcadores genéticos de la progresión
.
Desde su primera descripción por Kallioniemi et al. (1992) [2] cromosómica hibridación genómica comparada (cCGH) se ha convertido en la técnica más utilizada para detectar los cambios de número de copias de ADN en los genomas tumorales. Nosotros y otros han analizado el genoma de líneas celulares de cáncer de próstata y muestras de cáncer de próstata primario con esta técnica [3] - [5]. La fluorescencia
In situ
hibridación de ADN (FISH) y la PCR en tiempo real cuantitativa han demostrado ser herramientas valiosas para el descubrimiento de genes diana dentro de las regiones cromosómicas identificadas de ganancia, por ejemplo,
TLOC1 /Sec62
gen en 3q26.2 en el cáncer de próstata [6]. La aplicación de modelos bioinformáticas avanzadas en los datos cCGH demostraron que los patrones de aberraciones cromosómicas contienen valiosa información sobre el pronóstico de un tumor [7].
Debido a la relativa baja resolución espacial (~20MB) de cCGH y su inexactitud en centromérica como así como las regiones teloméricas esta técnica no es ni capaz de detectar adecuadamente pequeñas regiones de ganancias o pierde ni alteraciones genómicas próximos al centrómero o telómeros. Además, para la identificación de genes diana en las regiones obtenidas como se encuentra por cCGH, multa de cartografía con técnicas como el pescado es laborioso y requiere mucho tiempo.
En comparación con cCGH, basada en microarrays de CGH, conocido como CGH array (aCGH ) o matriz CGH [8] - [9], tiene una más o menos 1.000 veces mayor resolución (o incluso más) y permite el análisis de regiones cromosómicas cerca del centrómero y telómeros. Diferentes enfoques de aCGH se han seguido en los últimos años. Varios grupos de matrices utilizadas BAC genómica [10], mientras que otros han optado por arrays de cDNA o de oligonucleótidos que fueron diseñados originalmente para el análisis de la expresión [9], [11]. Arrays diseñados para la expresión génica son ventajosas para la comparación directa de alteraciones genómicas y la expresión de genes en la misma plataforma. Varios estudios han demostrado que este enfoque muestra una asociación significativa entre el número de copias del gen y el nivel de expresión [12], [13]. Últimamente, diseñado ya se informó uso de arrays de oligonucleótidos específicos para aCGH [14] y ahora está disponible comercialmente como una plataforma aCGH. Para los análisis de aCGH de líneas celulares de cáncer de próstata, así como muestras clínicas, ya sea BAC o cDNA arrays se han utilizado [12], [13], [15] - [20].
A continuación presentamos el primer estudio la utilización de una característica 35000 matriz de oligonucleótidos 70-mer, originalmente diseñado para el análisis de expresión, para la caracterización genómica detallada de líneas celulares de cáncer de próstata y nueve. ACGH perfiles resultantes se comparan con los resultados cCGH. La aparición de una pequeña amplicón recién detectado en la sub-banda pericentromeric 9p13.3 en diversas líneas celulares es validado por FISH y PCR cuantitativa en tiempo real y se confirma también en muestras de cáncer de próstata primarios.
Material y Métodos
líneas de células tumorales y el aislamiento de ADN
La líneas celulares de cáncer de próstata humano DU145, PC3, LNCaP, CWR22 y CWR22-RV1 se obtuvieron de American Type Cell Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, EE.UU.) y cultivaron de acuerdo con los protocolos recomendados por la ATCC. Desde PC3 y DU145, dos ramas diferentes estaban disponibles, que se realizó en el laboratorio de la Subdivisión de Genética del Cáncer, NHGRI, el NIH (PC3
NIH
, DU145
NIH
) y el otro en el laboratorio urológico en Homburg (PC3
HOM
, DU145
HOM
). PC3-N, PC-125-1L, y DU145-MN1 se establecieron como se ha descrito anteriormente [21], [22]. LNCaP-CN4-2 fue proporcionado amablemente por Z. Culig, Departamento de Urología de la Universidad de Medicina, Innsbruck, Austria.
primario de próstata muestras de cáncer
mediciones cuantitativas del número de copias de genes se realizaron el 20 de primaria muestras de adenocarcinoma de próstata, que se obtuvieron después de la prostatectomía radical de pacientes con cáncer de próstata tratados previamente. Después de la prostatectomía, los especímenes fueron disecados por un patólogo, se congelaron rápidamente y se almacenaron a -80 ° C. Sólo las muestras que contienen & gt;. Células tumorales 50% se incluyeron en el estudio
aislamiento del ADN y la cuantificación
ADN se aisló utilizando el kit de aislamiento de ADN QIAmp (Qiagen, Hilden, Alemania) y posteriormente se cuantificó por un ensayo fluorométrico (Quant-iT Pico verde dsDNA Kit, Invitrogen, Karlsruhe, Alemania). Se midió la fluorescencia utilizando un lector de fluorescencia de microplacas SpectrafluorPLUS TECAN (Salzburg, Austria) con una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 535 nm. las concentraciones de ADN se calcularon a partir de una curva estándar de DNA de doble cadena de control proporcionada con el kit que se midió por triplicado a las concentraciones de 30, 3, 0,3, y 0,03 ng /l (medida por fluorometría).
Whole la amplificación del genoma y la purificación
Un volumen de 2,5 l de 4 ng /l de diluciones líneas celulares y controlar ADN se utilizó como material de partida para la amplificación. El phi29-amplificación se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante kit Repli-G (Qiagen) utilizando un tiempo de incubación de 16 h. reacciones Repli-G fueron verificados por un intra basada en tiempo real
Alu-PCR
ensayo. Además la concentración de ADN se cuantificó fluorimétricamente con Quant-iT Pico Verde dsDNA Kit (Invitrogen) y osciló entre 10 a 30 g.
Alu-PCR ensayo
Debido a una síntesis de fondo observado con frecuencia en el Repli-G-amplificado sin plantilla de control, se realizó un control de calidad extra en 1 l (dilución 1:50) de ADN amplificado Phi29 sin purificar. Un
Alu
banda específica debe estar presente en todas las muestras amplificadas Repli-G y ausente en los Repli-G-amplificado sin plantilla de control. Cada 2 l de muestra se comparó con 1 l de diluciones seriadas de ADN de control macho (Promega, WI, EE.UU.) (10, 5, 2, 1, 0,5, 0,1, 0,01, 0,001 ng /l). Las reacciones de 25 l contenían 1 × arranque en caliente SYBR verde Master Mix (Qiagen), 1,5 mM de MgCl
2, 0,2 mM dNTP Mix, 400 nM primers cada uno (
Alu
-forw: 5'-GTGGGCTGAAAAGCTCCCGATTAT- 3 'y
Alu
-Ap: 5'-ATTCAAAGGGTATCTGGGC TCTGG-3'). Las condiciones de ciclación fueron los siguientes: 1 min a 94 ° C; 35 ciclos de 20 s a 94ºC, 20 s a 55ºC y 20 s a 72 ° C; 10 min a 72 ° C. Los productos de amplificación se verificaron mediante análisis de la curva de fusión utilizando el software de cuantificación LightCycler ™ 3.5 (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) y electroforesis en gel. La amplificación se considera exitosa cuando la cantidad de humano
Alu
secuencias en Phi29 generados fragmentos de ADN oscilaron desde 10 hasta 30% y cuando un frotis de fragmentos de ADN, que van desde 1 a 20 kb, era visible por electroforesis en gel.
ArrayCGH
10 g de amplificada y ADN purificado se marcaron usando el BioPrime matriz CGH Genómica Labeling kit (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante en un volumen de 50 l con una mezcla dNTP modificado que contiene 120 M cada uno de dATP, dGTP, dCTP y; 60 mM dTTP; y 60 mM Cy5-dUTP o Cy3-dUTP. ADN marcado se purificó usando columnas de purificación QIAquick PCR (Qiagen). Tumor y referencia de ADN se agruparon, se mezcla con 50 g Cot-1 DNA (Invitrogen) y se concentró hasta un volumen de 20 l en una centrífuga de vacío. El ADN se mezcla a continuación con una cantidad igual de 2 x tampón de formamida, desnaturalizado a 95 ° C durante 5 min y se preincubaron a 37 ° C durante 30 min en un baño de agua.
Las hibridaciones se llevaron a cabo en la costumbre (impreso en Fondo para las diapositivas) de vidrio NHGRI /NIH Microarray núcleo que contiene el oligonucleótido 70mer Operon configurar la versión 3 con 34.580 oligonucleótidos. Los oligonucleótidos fueron diseñados originalmente para el análisis de expresión. Para arrayCGH todos los oligonucleótidos se alinean contra la secuencia del genoma humano (build 34), EnsEMBL, RefSeq, dbEST y UCSC genes conocidos que resultan en 29.383 oligonucleótidos con una cartografía cromosómica específica.
Las muestras de ADN fueron hibridadas en la matriz para el 16 -18 horas a 42 ° C que utilizan el sistema de MAUI la hibridación de 4 bahías y Maui mezclador A0 (sistema BioMicro, Salt Lake City, UT, EE.UU.). Después de arrays de hibridación y Maui Mixer fueron desmontados en 42 ° C 1 X SSC y SDS al 0,05% (solución de lavado 1) y posteriormente se lavaron dos veces en solución de lavado 1 durante 5 minutos seguido de dos lavados en 0,1 x SSC (solución de lavado 2) para 5 minutos. diapositivas de matriz secos fueron escaneados utilizando un escáner de microarrays ScanLite Express (Perkin Elmer, Wellesley, MA, EE.UU.). archivos de imagen RAW de los arreglos fueron procesados utilizando el software DeArray [23] y como resultado los datos de imagen se importaron en medio ambiente: R usando paquetes de Bioconductor [24] para su posterior análisis.
Procesamiento de datos y análisis estadístico de los datos de microarrays
El análisis estadístico para identificar regiones cromosómicas con el número de copias alteradas en las matrices individuales consistió en dos pasos. En primer lugar, después de la cartografía de los medidos número de copias del gen diario de los coeficientes a sus respectivas localizaciones cromosómicas, suavizado se aplicó. Los pesos de adaptación algoritmo de suavizado GLAD basados en [25] para identificar regiones de número de copias constante se utilizó. Este algoritmo se ajusta a una función constante por tramos a lo largo del cromosoma de los diario de los coeficientes. A continuación, se identificaron para cada regiones de la muestra que se amplifican o se eliminan. Aquí, las distribuciones normales se ajustaron de manera robusta para el diario de los coeficientes de suavizado de cada matriz. En particular, la mediana y el rango intercuartil se calcularon, y una distribución normal se ajustó a estos parámetros. Por último, se detectaron regiones constantes con valores superiores o inferiores a los puntos de corte especificados como regiones ganado o perdido, respectivamente. Con el fin de discriminar entre las señales débiles y fuertes, la mediana más o menos uno o dos desviaciones estándar fueron seleccionados como puntos de corte para las aberraciones débiles y fuertes, respectivamente. Los algoritmos fueron implementados en el lenguaje de programación R (www.r-project.org). Los resultados se obtuvieron utilizando R versión 2.3 y la biblioteca GLAD proporcionada por el proyecto Bioconductor (www.bioconductor.org), versión 1.7.
cromosómico CGH
La hibridación se realizó como se describió previamente con menor modificaciones [26]. 500 ng biotina DNA sonda marcada, digoxigenina marcado con ADN de referencia 500 ng (ADN de referencia varón humano, Promega, WI, EE.UU.) y 50 g cuna-DNA no marcado humano (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) se precipitaron con acetato de sodio 0,3 M en el 2,5 doblar volumen de etanol y se disolvió en 2,5 l de formamida desionizada. Después de 30 minutos, se añadieron los 2,5 l de la mezcla de hibridación doble (tampón fosfato sódico 100 mM, 4 x SSC y 20% de sulfato de dextrano, pH 7,0) y se desnaturalizaron durante 5 min a 75 ° C seguido de 15 min preannealing a 37 ° DO. La hibridación se realiza bajo cubreobjetos sellados durante 3 días a 37 ° C en una cámara húmeda. Después de la hibridación, los portaobjetos se lavaron tres veces durante 5 min en una solución de lavado (50% de formamida en 2 x SSC pH 7,0) a 45 ° C, dos veces en 2 x SSC (pH 7,0) a 45 ° C, y una vez en 0,1 x SSC (pH 7,0) a 45 ° C.
sonda de ADN biotinilado se detectó con estreptavidina marcada con FITC (vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Se detectó el ADN de control digoxigenized con rodamina marcado con anticuerpos anti-digoxigenina (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). Finalmente se counterstained las diapositivas, y una solución antifade aplican en la misma etapa (Vectashield con DAPI, Vector Laboratories).
Las láminas fueron analizados utilizando un sistema de análisis de imagen digital (MetaSystems, Altlussheim, Alemania), basada en una Olympus AX 70 microscopio equipado con una cámara CCD enfriado (Fotometría, Tucson, AZ, EE.UU.). Para el análisis de datos de fluorescencia diferencial se utilizó el software ISIS MetaSystems 3. Las imágenes de tres colores con rojo, verde y azul fueron adquiridas de 15-20 metafases. se detectaron desequilibrios cromosómicos sobre la base del perfil de relación de fluorescencia, desviarse del valor equilibrado (FITC: rodamina = 1). Para cada cromosoma los valores de la relación finales se preparan a partir de los valores medios de al menos diez homólogos de cromosomas de metafase para untar separadas. CGH resultados se representaron gráficamente como una serie de perfiles de verde a rojo de relación, y la interpretación de los resultados siguieron los protocolos descritos anteriormente [3].
fluorescencia de hibridación in situ
FISH se realizó en metafase y los núcleos untar de la CWR22 líneas celulares y CWR22-RV1. Propagaciones de metafases de linfocitos de un donante sano se utilizaron como control. El RP11-165H19 clon BAC (9p13.3, número de acceso GenBank AQ382511) se obtuvo de BACPAC de recursos hospitalarios (Instituto de Investigación de Oakland, Oakland, CA, EE.UU.) para niños y centro de cohybridized con una sonda específica para el centrómero del cromosoma 9 (D9Z1; Oncor, Gaithersburg, MD, EE.UU.). Los cultivos bacterianos y el aislamiento de ADN se realizaron de acuerdo con el protocolo BACPAC Miniprep (http://www.biologia.uniba.it/rmc).
Alu
-PCR productos de la BAC se utilizaron como sondas y se biotina mediante traslado de cortes. Fluorescencia dual de color
In situ
hibridación y detección de señales de fluorescencia se realizaron como se describe anteriormente [6].
PCR cuantitativa en tiempo real
cuantitativa en tiempo real PCR para el número de copias del gen medición se basa en un enfoque descrito recientemente [27]. En el presente estudio, hemos utilizado ensayos de SNP prediseñados y validados (Applied Biosystems, CA, EE.UU.) con el sistema AB 7900 (Applied Biosystems). Para la validación de la 9p13.3 amplificación de dos genes dentro del amplicón (IL-11RA, AssayID: C__11340987_10 y DCTN3, AssayID: C__25472566_10) y un gen en al 3p24.2 situado en una región no alterados en el cáncer de próstata (TOP2B, AssayID :. C__8063527_10) se analizaron
en un primer paso, todos los ensayos de SNP utilizados en este estudio se realizaron en una serie de dilución de ADN normal de la sangre para determinar la eficiencia de PCR (E) de cada conjunto de cebadores por la fórmula E = 10
-1 /s, donde s representa el valor absoluto de la pendiente en una parcela del ciclo umbral (C
T) contra el registro de la cantidad de entrada. Todos los cebadores se demostrado tener una eficacia igual de aproximadamente E = 2 y en parcelas de eficiencia relativa comparando los diferentes cebadores (registro de la cantidad de entrada
vs.
? C
T) el valor absoluto de la pendiente era menos de 0,1. a continuación, el número relativo de copias de genes se calculó siguiendo la equitación: 2
-ΔΔCT (boletín de Usuario#2, Applied Biosystems). Para la calibración se añadió ADN normal de la sangre en cada PCR plazo. Para los genes que tienen dos alelos detectados por el ensayo de la C
valor T se restó por 1 basado en la eficiencia se muestra de 2. Para determinar si los resultados obtenidos por análisis de PCR en tiempo real de las muestras de cáncer de próstata fueron significativamente diferentes de los obtenidos para muestras de individuos sanos, se determinó un intervalo de tolerancia (TI) de los números de copias de genes relativos, utilizando la desviación estándar (SD) de C
valores de T para diana y de referencia genes en 8 individuos sanos de acuerdo con la ecuación: TI = 2 ± (SDΔC
T x 2). La TI varió desde 1,62 hasta 3,17 para
DCTN3 Opiniones y 1,77-2,94 para
IL11-RA
.
Resultados
recurrentes regiones mínimas de alteraciones
Debido a sus genomas muy alterados y el gran volumen de datos generados por matriz de análisis, simple inspección visual de loci alterada resultó ineficaz para identificar regiones recurrentes mínimas de aberración. Para analizar el conjunto de datos, se combinaron identificación aberración automática con un procedimiento gráfico de frecuencia modificada. Aplicación del análisis de frecuencia ponderada de los autosomas de líneas celulares de cáncer de próstata reveló varias regiones de cambios altamente recurrentes. En comparación con nuestra cCGH varios análisis de pequeñas amplificaciones y unidades de deleción solamente fueron detectados por aCGH, especialmente en regiones pericentromeric y regiones cerca de los telómeros (Fig. 1). El tamaño de las regiones más pequeñas de la aberración se pudo determinar a 110 kb para las pérdidas en 19q13.41 en líneas celulares DU145
NIH
, DU145-MN1, PC3 y 125-1L CWR22-RV1, y 760 kb para los aumentos en 14q32.11-q32.12 en PC3
HOM
, PC3-N y PC3-125-1L. La mayoría de las aberraciones cromosómicas como se detecta por cCGH también fueron vistos en aCGH. Sin embargo, se detectaron más pérdidas con microarrays y grandes regiones de más ganancias con la técnica de la metafase. Para las regiones comúnmente detectados de aberraciones, no se observó ninguna diferencia entre los dos métodos en la asignación de ganancias o pérdidas en la región individuo (tabla 1).
Una pequeña región de ganancia en 9p cerca del centrómero (B, punta de flecha) y una pequeña deleción en 14q (D, punta de flecha) solamente son detectados por arrayCGH.
constitución citogenético de las diferentes ramas de las líneas celulares de cáncer de próstata y la línea celular de sus padres frente a la comparación sublínea
los resultados aCGH de las líneas celulares de los padres PC3
HOM
, DU145
HOM
, LNCaP y CWR22 y sus sublíneas se resumen en la figura 2. Para PC3 y DU145, dos ramas diferentes podrían ser comparados (
HOM vs. NIH
). Lo más sorprendentemente, la constitución citogenético de PC3
HOM
difería notablemente de PC3
NIH
. De un total de 54 aberraciones en ambas líneas celulares, sólo seis aberraciones fuertes podían encontrarse en común: las pérdidas en 1q, 8p, 10p y 13 y las ganancias en 10q y 17q. La ganancia de 8q11.2-8q24.3 en PC3
HOM
también se observó en PC3
NIH
mostrando una variación tamaño mínimo de 100 kb. Para DU145
HOM Opiniones y DU145
NIH
, se encontró una buena concordancia global de la composición genética.
Los números encima de la trama indican el número de cromosomas y líneas límites verticales entre los cromosomas.
la comparación de las líneas celulares PC3
HOM
, DU145
HOM
, LNCaP y CWR22 con sus derivados PC3 sublíneas -N, PC3-125-1L, DU145-N, LNCaP-CN4-2 y CWR22-RV1, respectivamente, una alta congruencia de las aberraciones citogenéticas entre las líneas celulares correspondientes fue cedido por aCGH. Vale la pena mencionar que, además de variaciones menores de la cantidad de regiones adicionales con las ganancias o pérdidas de las diferencias materiales genéticos entre las líneas celulares parentales y sublíneas afectados predominantemente la extensión de las regiones con alteraciones del número de copias correspondientes, como por ejemplo se observó para las regiones con ganancias en 12q y 15q en PC3
HOM vs.
PC3-N y para las regiones con pérdidas en el 2T, 4T, 6q y 13q21.33 en LNCaP
vs
. LNCaP-CN4-2.
Validación de la región 9p13.3 pericentromeric amplificada utilizando el análisis de FISH y PCR cuantitativa en tiempo real
Una región Mb novela 1,7 con aumentos del número de copias fue consistentemente reconocido en la célula líneas CWR22 y CWR22-RV1 y se asignan a la sub-banda pericentromeric 9p13.3. La presencia de este amplicón en el CWR22 líneas celulares y CWR22-RV1 fue confirmada por FISH en metafase utilizando un clon de BAC (RP11-165H19) de la región amplificada y una sonda específica para el centrómero del cromosoma 9 (Fig. 3A y B). óptima de la señal y la falta de hibridación cruzada se verifica por medio de metafase para untar normales (Fig. 3C). Este clon BAC contenía dos genes,
IL-11RA
y
DCTN3
, que ya se cree que desempeñan un papel en el crecimiento del cáncer de próstata [13].
Identificación del incrementaron copias de las señales de la RP11-165H19 clon BAC asignadas a 9p13.3 amplificación en la línea celular CWR22 y CWR22-RV1 (a y B). y la falta de señal de hibridación cruzada óptima C se verifica por medio de la metafase normal de los diferenciales que muestra dos señales para cada sonda. BAC clon de señales RP11-165H19 son de color verde; señales rojas indican centrómero del cromosoma 9 (D9Z1).
basada en la localización de genes y la función de los genes anotada, se seleccionaron estos dos genes candidatos para las mediciones del número de copias de genes en las líneas celulares de cáncer de próstata y carcinoma de próstata primario 20 muestras usando PCR cuantitativa en tiempo real.
IL-11RA
mostró un aumento significativo en el número de copias del gen encima de lo normal en CWR22 y CWR22-RV1 y en 15 de 20 (75%) muestras de tumor de cáncer de próstata primario (Fig. 4). Para
DCTN3
, no se detectó aumento de número de copias en cualquier línea celular y en sólo 2 de los 20 muestras (10%) de tumores de cáncer de próstata. El gen de control
TOP2B
en 3p24.2 se demostró sin cambios en comparación con la sangre normal (datos no mostrados).
IL-11RA
mostró un aumento significativo en el número de copias del gen por encima de lo normal en CWR22, CWR22-RV1, DU145
HOM Opiniones y DU145-MN1 y en 15 de los 20 muestras (75%) de cáncer de próstata. Para
DCTN3
, no se detectó aumento de número de copias en cualquier línea celular y en sólo 2 de los 20 muestras (10%) de cáncer de próstata. Valores por encima de la línea de corte se asignan como número incrementado de copias del gen en comparación a la normalidad.
Discusión
A pesar de que las líneas celulares de cáncer de próstata han sido analizados previamente por aCGH la utilización de plataformas de microarrays de ADNc [12] , [13], [15] - [20], se demuestra en este estudio la viabilidad de un conjunto longmer oligonucleótido, diseñado originalmente para el análisis de la expresión, para un perfil genómico de alta resolución de líneas celulares de cáncer de próstata y nueve. Los microarrays de datos para este estudio se han presentado a NCBI GEO GSE7376 adhesión. En comparación con cCGH, detectamos más deleciones y pequeñas regiones de ganancias con aCGH, especialmente en regiones pericentromeric y regiones cerca de los telómeros, donde cCGH se sabe no entregar información confiable sobre los desequilibrios de ADN. Por otro lado, las grandes regiones de ganancias según lo revelado por cCGH que abarcan casi todo el brazo de cromosomas fueron pasados por alto por aCGH. Observaciones similares también fueron reportados por Saramäki et al. (2006) [13] utilizando aCGH basados en ADNc. Además de los artefactos de normalización se podría argumentar que estas diferencias podrían ser el resultado de la etapa de amplificación de ADN para aCGH en nuestro estudio, mientras que se utilizó no amplificación de ADN para cCGH. A pesar de que la amplificación del genoma completo por Phi29 polimerasa puede añadir un poco de sesgo e incrementar el ruido de fondo, se considera el enfoque más imparcial en comparación con los procedimientos de amplificación de ADN basados en la PCR [28]. Como cualquier etapa de amplificación de ADN parece inevitable en el estudio de muestras de cáncer de próstata primario, se utilizó una etapa de amplificación en nuestro estudio a pesar de que la cantidad de ADN no era un factor limitante cuando se trabaja con líneas celulares.
Nuestros resultados están en aCGH buen acuerdo con los datos reportados en la literatura para PC3, DU145, LNCaP, y CWR22 [12], [13], [15] - [20]. Sin embargo, un aspecto secundario interesante de nuestro estudio es la observación de una diferencia marcada citogenética entre las dos ramas PC3, que se llevó a cabo en dos laboratorios diferentes (PC3
HOM vs.
PC3
NIH
). La inestabilidad genómica presume de líneas de células puede conducir a la divergencia genética, lo que tiene que tenerse en cuenta al comparar los resultados de diferentes laboratorios en aparentemente las mismas líneas celulares. Un sistema de gestión de la calidad, que incluye detalles de la composición genética de las líneas celulares utilizadas de forma individual, parece prudente.
En cuanto a la comparación de las líneas celulares de sus padres y sublíneas, no hay grandes diferencias en la composición citogenética fueron encontrados por aCGH. Las diferencias refiere predominantemente a los límites de las regiones con alteraciones del número de copias correspondientes. Estos resultados están en contraste con nuestros estudios previos que demuestran cCGH varias regiones adicionales de ADN copia alteraciones numéricas en las sublíneas en comparación con las líneas celulares de sus padres [4]. Una explicación podría ser de carácter técnico, como la reportada previamente diferencias regiones cromosómicas implicadas grandes, principalmente, que son detectados con una sensibilidad inferior en comparación con aCGH cCGH, como se discutió anteriormente.
Como una validación de la alta resolución de aCGH , que además analiza una pequeña unidad de amplificación de 1,7 MB en el pericentromeric región del cromosoma 9 en 9p13.3, que fue encontrado en las líneas celulares de xenoinjertos derivados CWR22 y CWR22-RV1 por aCGH pero no por cCGH. Curiosamente, Saramäki et al. (2006) [13] también encontraron esta región por aCGH a amplificar en el xenotrasplante de cáncer de próstata LuCaP35. Confirmaron sus resultados por BAC-FISH y demostraron la amplificación y sobreexpresión del gen ubiquitina-conjugación enzima E2R2 (
UBE2R2
), el gen dynactin 3 (
DCTN3
) y el dominio de las repeticiones WD 40A gen (
WDR40A
) en 9p13.3. Usando una técnica de PCR en tiempo real, cuantificamos aún más el número de copias del gen del receptor alfa de interleucina 11 (
IL-11RA) y el gen dynactin 3 (
DCTN3
) tanto revelando la más alta log2 en relación aCGH en 9p13.3.
IL-11RA
se encontró con el mayor aumento de número de copias en CWR22, CWR22-RV1, DU145
HOM Opiniones y DU145MN1 sugiriendo
IL-11RA
como el putativo gen diana de este amplicón. Nosotros, por lo tanto, se examinaron 20 muestras de cáncer de próstata primario y encontramos 75% de los tumores que albergan un
IL-11RA
ganancia del número de copias solo, ninguno de
DCTN3
solo, y 10% de ambos genes . La ganancia media de número de copias de
IL-11RA
era aproximadamente 4 veces. Estos datos ponen de relieve nuestra hipótesis inicial de que
IL-11RA
representa el objetivo de amplificación en lugar de
DCTN3
. Esta hipótesis se ve reforzada por estudios inmunohistoquímicos [29], [30] y el cáncer de la base de datos de perfiles de Oncomine ™ (www.oncomine.org), que revelan tanto la sobreexpresión de alta
IL-11RA
en el cáncer de próstata en comparación a la normalidad tejido de la próstata.
IL-11RA
codifica un receptor específico para IL-11 y pertenece a la familia de receptores de citoquinas gp130 dependiente, que incluyen los receptores de IL-6, factor inhibidor de leucemia, factor neurotrófico ciliar, la oncostatina M, y cardiotrofina [31]. Un sistema de señalización importante activado por
IL-11RA
y otros miembros de esta familia de receptores es el transductor de señal quinasa Janus y activador de la transcripción (Jak-STAT) vía con STAT3 que tiene una importancia estudiado bien en la carcinogénesis de próstata [ ,,,0],32]. Por otra parte, se cree que STAT3 se activa para jugar un papel clave en la activación del receptor de andrógenos en ausencia de andrógenos, una explicación de la hormona del crecimiento de cáncer de próstata refractario [33]. Ya sea
IL-11RA
es causal en el crecimiento del cáncer de próstata debe ser investigado en estudios posteriores.