Extracto
En el Taiwan de los Balcanes y, la relación entre la exposición al ácido aristolóquico y el riesgo de neoplasias uroteliales se deduce de la a & gt; T sello genético en
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gen de las células malignas. Este estudio tuvo como objetivo caracterizar el
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espectro mutacional en los cánceres uroteliales consecutivos para aristolóquico Ácido nefropatía en Bélgica. secciones congeladas de tumores de serie de pacientes de sexo femenino (n = 5) expuestas a ácido aristolóquico durante régimen de pérdida de peso se utilizaron alternativamente, ya sea para la inmunotinción p53 o microdisección láser. Se seleccionaron áreas de tejido con al menos 60% de núcleos de p53-positivo para microdissecting secciones de acuerdo a las áreas que coinciden con p53 positivo. Todas las áreas parecían ser carcinoma in situ. Después de la extracción de ADN, las mutaciones en los
TP53 región
punto caliente (exones 5-8) se identificaron mediante PCR anidada y secuenciación. controles falsos negativos consistieron en microdissecting tejidos tumorales frescos congelados tanto de un paciente con un síndrome de Li-Fraumeni, que lleva una mutación constitucional p53, y de
KRAS mutado
adenocarcinomas. Para descartar falsos resultados positivos que pueden generar microdisección y PCR anidada, un carcinoma urotelial fenacetina asociada a los tejidos normales y ureterales frescas (n = 4) fueron procesados con láser de potencia alta. No hay resultados inesperados siendo identificados, el análisis molecular fue perseguido en los tejidos malignos, que muestra al menos una mutación en todos los (seis mutaciones diferentes en dos pacientes), con 13/16 exonic (absurdo, 2; missense, 11) y 3/16 intrónica ( sitio) mutaciones uno de empalme. Se distribuyeron como transiciones (n = 7) o transversiones (n = 9), con una prevalencia igual de A & gt; T y G & gt; T (3/16 cada uno). Mientras que los resultados actuales están en línea con A & gt; prevalencia T informó anteriormente en los estudios de los Balcanes y Taiwán, que también demuestran que múltiples mutaciones en el
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región de punto caliente y una alta frecuencia de G & gt; T transversion aparecen como complementarios firma que refleja la toxicidad de una dosis acumulativa de ácido aristolóquico ingerirse en un corto período de tiempo
Visto:. Aydin S, Dekairelle AF, Ambroise J, Durant JF, Heusterspreute M, Guiot Y, et al. (2014) La detección inequívoca de múltiple
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mutaciones genéticas en AAN-Asociada cáncer urotelial en Bélgica Uso de microdisección de captura por láser. PLoS ONE 9 (9): e106301. doi: 10.1371 /journal.pone.0106301
Editor: Robert Hurst, Universidad de Oklahoma Health Sciences Center, Estados Unidos de América
Recibido: 2 de Junio, 2014; Aceptado: July 29, 2014; Publicado: 3 Septiembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Aydin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y. La declaración de la ética se introdujo bajo el número de registro B40320095694 belga
Financiación:.. Los autores no tienen ningún soporte o financiación reportar
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El ácido aristolóquico nefropatía (AAN) fue reportado por primera vez a principios de la década de 1990 en pacientes belgas haber llevado a cabo un régimen de pérdida de peso contaminada con ácido aristolóquico (AA) [1], [2] . AAN se caracteriza por una nefropatía intersticial rápidamente progresiva con proteinuria tubular y glucosuria, a principios de la anemia grave, fibrosis intersticial extensa hipocelular decreciente desde el exterior al laberinto cortical interior, y un rápido desarrollo de las vías urinarias carcinomas de células de transición en 40 a 46% de la los pacientes dentro de 2-6 años después del cese de la exposición [3] - [6]. AAN es ahora reconocida como una enfermedad devastadora que ocurre en todo el mundo con nada menos que 100 millones de personas potencialmente en riesgo de exposición AA [7]. Si bien el mecanismo de nefrotoxicidad AA aún no se ha explorado a fondo, la actividad carcinogénica se atribuye actualmente a la genotoxicidad de Al (aristolactam) aductos-ADN que se caracterizan por una alta frecuencia de A & gt; T transversión en el
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gen supresor de tumores de los tumores AA-asociado. Esto ha sido bien documentado en experimentos con animales [8], [9] y, aunque no de manera consistente, en pacientes que presentan similitudes clínicas e histopatológicas con los casos AAN belgas originales [10] - [14]. Mientras que los aductos AL-ADN que demuestran la exposición AA han sido bien documentados en los tejidos del riñón de la cohorte de Bélgica [6], [15], [16], la presencia de A & gt; T transversion testigo de la relación causal entre la exposición y la malignidad todavía tenía que haber investigado. El objetivo del presente trabajo fue, por tanto, para caracterizar el
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espectro mutacional en muestras congeladas de tejidos uroteliales malignas de pacientes AAN belgas utilizando métodos de genotipado a fondo validados.
Pacientes y métodos
Ética Declaración
en 2001, un estudio sobre el polimorfismo genético de las enzimas implicadas en el metabolismo del ácido aristolóquico entre los pacientes AAN belgas fue aprobado por el Prof. JM Maloteaux, Presidente de la Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud de Ética de la Investigación Comité de la Universidad Católica de Lovaina (Bélgica). Tras la aprobación del Comité de Ética, un consentimiento informado por escrito fue proporcionado por cada paciente de la serie AAN belga. Estos datos del estudio se mantuvieron sin publicar.
En 2009, una enmienda para el estudio piloto se defina específicamente la corriente
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la investigación que se llevó a cabo en muestras de tejido de pacientes 5 AAN reportados en este estudio, y fue aceptada como tal por el Comité de Ética de Investigación de la Universidad Católica de Lovaina (Bélgica) como una continuación del estudio se inició en 2001. las muestras de tejido de pacientes 1-5, que eran todos parte del estudio original (2001) fueron anónima antes de la de análisis.
Las muestras de sangre fueron parte de un estudio previo (referencia Comité de Ética de la UCL aprobación. 2003/05/03/08 ninguna) [17]. muestras de adenocarcinoma y ureterales quirúrgica se recogieron de pacientes con AA no relacionada como parte de su tratamiento médico y fueron anónimos antes del análisis. Después de la información escrita, los tejidos de adenocarcinoma fueron almacenadas en la biblioteca UCL Biológica (http://www.centreducancer.be/fr/show/index/section/8/page/34). muestras ureterales relacionados con AA no tomadas de nefroureterectomías retirados en el momento del trasplante renal se utilizaron como controles en este estudio con una codificación tras el análisis patológico de acuerdo con las leyes belgas en los bancos de tejidos (2008).
El broche de presión espécimen de tumor de células de la granulosa -frozen del paciente Li-Fraumeni se obtuvo de la biblioteca biológica UCL (igual que anteriormente). Después del consentimiento por escrito de los padres, esta muestra se convierte en anónima antes de su uso.
Anterior informaron datos incluyen aductos de ADN AL-identificados en tejido renal de los pacientes 1, 3, 4 [15], [16], [18 ] y
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secuenciación de genes a cabo en un CTP de la vejiga del paciente 1 [10].
AAN pacientes
Cinco pacientes AAN se refiere Clínicas Universitarias Saint-Luc (Bruselas, Bélgica) fueron estudiados (tabla 1). Todos eran mujeres con una edad media de 42,8 años (rango: 27-53) en la presentación. Un paciente era un fumador. Ninguno tenía antecedentes de abuso de analgésicos o las características típicas de la nefropatía por analgésicos. Todos ellos fueron sometidos a nefroureterectomía bilateral, ya sea en el momento del trasplante renal o posteriormente para tumores malignos del tracto urinario superior. Además, un paciente también se sometió a resecciones transuretrales de carcinoma recurrente de células transicionales (TCC) de la vejiga y, con el tiempo, la cistectomía. El diagnóstico de la AAN se basó en los siguientes criterios: la ingesta de AA a través de un régimen de pérdida de peso fitoquímico demostrado como contaminados (pacientes 1, 2, 3 y 5), una histología renal típica de fibrosis intersticial (todos los cinco pacientes), la identificación de AL -ADN aductos en el tejido renal (pacientes 1, 3 y 4) y el desarrollo de tumores malignos del tracto urinario superior (todos los cinco pacientes) [15], [16], [18]. En los pacientes 4, la ingesta de AA podría sin embargo, nunca se ha demostrado formalmente como ella afirmó haber asistido a la clínica de pérdida de peso antes de que el régimen contaminada con AA (la llamada "fórmula 2") se introdujo [1]. No obstante, los cinco pacientes cumplen los criterios propuestos recientemente para un diagnóstico definitivo de la AAN [19] en el caso de la serie actual. Aunque carece de la
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estado de mutación, vale la pena señalar que el paciente 1 es n ° 3 en las referencias 4, 5, 15 y 16, el paciente 2 es n ° 7 en la referencia 5, el paciente 3 es n ° 4 en las referencias 15 y 16, n ° 5, en referencia 5, y el paciente 4 es n ° 2 en la referencia 20 y el número n ° 8 en la referencia 18 mientras que el paciente 5 aún no ha sido reportado.
quirúrgico especímenes
se seleccionaron tejidos de cinco pelvi-ureterectomies y un solo cistectomía sobre la base de la disponibilidad de material congelado. El carcinoma
In situ gratis (CEI) y papilar TCC fueron diagnosticados de acuerdo a la clasificación de la OMS de 2004 de los tumores uroteliales [21], [22]. Unilaterales CiS multifocales desarrollados en el derecho del tracto urinario superior (pelvis, superior, media e inferior del uréter) en dos pacientes (pacientes 1 y 5). Mientras ureterales CiS invadieron focalmente la lámina propia en el paciente 1, que también desarrolló la vejiga papilar TCC. CiS bilaterales multifocales desarrollaron en el tracto urinario superior de los 3 pacientes restantes. Retardo entre final de la exposición y la cirugía promedió 44,75 meses (rango 15 a 96) en los pacientes 1, 2, 3, 5 y no estaba disponible en el paciente 4. En los primeros cuatro pacientes, unilateral y bilateral TCC fueron diagnosticados un promedio de 61 meses ( rango: 27-96) y 41 meses (rango: 18-64) después del final de la exposición conocida, respectivamente
inmunohistoquímica de p53 (IHC)
CiS fue identificada por microscopía de luz sobre hematoxilina eosina. secciones teñidas de muestras pelvi-ureteral congelados. Fuera de serie de secciones congeladas (7 micras de espesor), secciones n ° 1, n ° 3 yn ° 5 fueron utilizados para inmunohistoquímica de p53 (IHC) y se mantuvo durante la noche a 37 ° C, mientras que las secciones n ° 2, n ° 4 y n ° 6 se utilizaron para la microdisección por láser. Las últimas tres secciones se colocaron en bioquímicamente polietileno naftalato (PEN) de membrana cubierto diapositivas inertes y se mantuvieron a -20 ° C hasta su uso. Para p53 IHC, las secciones se mantuvieron a 37 ° C se fijaron posteriormente en formaldehído 4% durante 3 horas. peroxidasa endógena fue bloqueada con peróxido de hidrógeno 0,3% en agua desionizada durante 30 min. Los portaobjetos se incubaron a 97 ° C durante 75 min y se lavaron en una solución que contiene agua desionizada y triton 0,05%. Las secciones se cubrieron entonces durante 30 minutos con suero de cabra normal 10% (NGS) que contiene 1% de albúmina de suero bovino (BSA), diluido en Tris-triton. Se incubaron durante la noche a temperatura ambiente con el anticuerpo monoclonal de ratón anti-p53 DO-7 (Biocarta, Europa Gmbh) a una dilución de 1:1000. Después de lavar con tris-Triton 0,05%, los portaobjetos se incubaron a temperatura ambiente durante 75 min con un sistema anti-ratón EnVision-peroxidasa listo para el uso (Dako, Glostrup, Dinamarca) de acuerdo con el protocolo del fabricante y de contraste con hematoxilina. Un suero de cabra normal se utilizó como control negativo.
La sobreexpresión de p53 se definió como la tinción nuclear con independencia de la intensidad IHC. Extensa tinción por IHC p53 ha sido previamente recomendado para mejorar la tasa de detección de mutaciones de
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[23]. En consecuencia, sólo se seleccionaron las áreas de tejido que contienen más de 60% de núcleos positivos para microdisección. Coinciden exactamente con las áreas de las secciones de serie aún no procesados (n ° 2, n ° 4 y N ° 6) se sometieron a microdisección como se detalla más adelante.
captura de microdisección láser
Después de la tinción con azul de toluidina, sin fijar cada congelada área de tejido que han coincidido exactamente con el área de interés definida de acuerdo con p53 diapositivas IHC se aisló utilizando un sistema de PALM microlaser (Bernried, Alemania) equipado con un láser de impulsos UV nitrógeno (longitud de onda: 337 nm, la energía de pulso & gt; 270 mu J, duración del pulso 3nsec , frecuencia de pulso 1-30 /seg) y el Robot Software Version 2.2 PALM. El sistema se acopla a un microscopio Axiovert 200 y a × Plan de Neofluar 20 (Zeiss, Oberkochen, Alemania). microdissected focos fueron catapultados en un casquillo microtubo y se congelaron a -20 ° C hasta la extracción de ADN (Figura 1).
A-G zona de TCC que contiene más del 60% de p53 manchado núcleos por IHC contraste con hematoxilina de la sección congelada de uréter (A). Para láser microdisección de captura, de un azul de toluidina zona manchada en una sección congelada representante fue igualada (B), corte (C) y catapultado (D) en la tapa de un microtubo (E). 3'-5'dideoxy electroferograma secuenciación del segmento de p53 que muestra la secuencia de tipo salvaje (F, flecha) y A & gt; T transversion (G, flecha) que conduce a la mutación sin sentido en el exón 8. E286V
DNA extracción
En cada tapa, 10 l de una solución que contiene EDTA 0,001 M (pH 8), Tris HCl 0,02 M (pH 8), 0,5% de Tween 20, proteinasa K (2 mg /ml) y se incluye el agua ultrapura. Después de la mezcla y centrifugación, cada tubo de reacción se cubrió con una gota de aceite mineral para evitar la evaporación y se incubó durante la noche a 55 ° C con agitación continua (600 rpm). A continuación se añadió agua ultrapura (5 l) al tubo de reacción para aumentar el volumen final de la solución. Después de la centrifugación, la solución se calentó a 99 ° C durante 10 min para inactivar la proteinasa K. Por último, el extracto se transfiere a otro microtubo.
Nested-PCR
Los exones 5 a 8, que corresponde al dominio de unión al ADN de p53, un denominado "punto caliente" para
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mutaciones de genes [24], fueron amplificados por PCR anidada. Para la primera ronda de PCR, se añadió 3 l de ADN extraído de cada muestra microdissected a una final de la mezcla 50 l de PCR incluyendo mM MgCl 2,25
2, 0,2 U /l Taq oro polimerasa (Ampli Taq oro, Applied Biosystems, Roche) , dNTP 0,2 mM y 0,2 pM /cebadores mu L (Eurogentec, Lieja, Bélgica) (Tabla 2). Una incubación inicial a 95 ° C durante 4 min fue seguida de 25 ciclos (95 ° C durante 30 segundos, 60 ° C, excepto para el exón 7 donde la temperatura de recocido fue de 55 ° C durante 30 seg y 72 ° C durante 1 min) y una elongación final de 7 min a 72 ° C. La segunda ronda de PCR se llevó a cabo con 2,5 l de la primera producto de PCR usando las mismas condiciones que para la primera ronda, a excepción de que 1,5 mM de MgCl
2 y 0,4 U /l de Taq oro polimerasa se utilizó para el exón 6. se utilizó agua ultrapura como control negativo mientras que el ADN extraído de muestras de sangre no relacionados se utilizó como control para
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amplificación.
análisis de secuencias
Los productos amplificados fueron purificados usando el kit de la vuelta PCRapace MSB (STRATEC Molecular GmbH, Berlín, Alemania) según las instrucciones del fabricante. El análisis de secuencia se llevó a cabo en un ABI automatizado 377 Un aparato (Applied Biosystems, Foster City, CA), utilizando el kit de secuenciación del ciclo Taq tinte desoxi Terminator del mismo fabricante y de acuerdo con sus instrucciones. El
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secuencia de referencia de Genbank era NC_000017.10.
Evaluación del potencial de
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alteraciones -artifactual en muestras de tejido
(a) evaluar la capacidad del procedimiento de microdisección actual para identificar mutaciones en el ADN, cuatro adenocarcinomas colorrectales investigado previamente para
KRas
mutación mediante pruebas clínicas de rutina en FFPE se seleccionaron muestras de tejido (incluidas en parafina fijadas con formalina). Dos de ellos llevaba una mutación y dos eran de tipo salvaje. Estas cuatro muestras fueron elegidos porque una contraparte congelaron rápidamente se mantuvo almacenado a -70 ° C en el cáncer humano Bio-banco de la Universidad Católica de Lovaina (https://www.uclouvain.be/416846.html). microdisección láser y la extracción de ADN de muestras de adenocarcinoma de snap-congelados se llevaron a cabo usando el procedimiento descrito anteriormente y los resultados de
KRas
pruebas se compararon. Además, un broche de congelados de muestras tumorales de células de la granulosa de una joven de 15 años con un síndrome de Li-Fraumeni se analizó utilizando el mismo procedimiento de microdisección. Mientras que la mutación constitucional ya había sido identificado por FASAY (análisis funcional de los alelos separados en la levadura) del
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ARNm extraído de células mononucleares periféricas del paciente [25], el espécimen fue estudiada para confirmar aún más la capacidad del procedimiento de microdisección actual para identificar correctamente este
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mutación en secciones congeladas de tumor
.
(b) Si las secciones de tejido congeladas instantáneamente podrían verse afectados por un efecto inducido por láser es no se conoce y esto podría incluso ser agravada por factores de interferencia adicionales, tales como un efecto perjudicial de los procedimientos de PCR anidada-fijación, tinción y /o. Para excluir tales sesgo tecnológico, las muestras de uréter quirúrgicas fueron recolectados después de nefroureterectomías (n = 4) tomadas de los pacientes renales trasplantados por la uremia terminal de debido a la enfermedad poliquística renal (n = 2), nefritis intersticial idiopática crónica definitivamente relacionadas con la ingesta de AA (n = 1 ), y glomeruloesclerosis diabética (n = 1). Estas muestras fueron embebidos inmediatamente en Tissue-Tek y se congelaron-y áreas uroteliales se procesaron de forma concomitante de tres maneras diferentes. Microdisección se llevó a cabo en dos intensidades diferentes (baja significa UV-energía: 68; y un alto valor de la energía UV-: 69,4) y, posteriormente, procesada como se informó aquí por las muestras AAN-paciente. En comparación, la serie de secciones adicionales de la misma muestra uréter fueron sometidos a una diapositiva sencilla rascarse como se realiza en
KRas
rutina de pruebas de mutación en muestras de tejido FFPE. la extracción de ADN, amplificación y
TP53
secuenciación se llevaron a cabo de acuerdo con el método descrito en este artículo
.
(c) Como control adicional de
TP53 AA-no relacionado
alteraciones de artefactos potencialmente inducida por el análisis actual, un carcinoma urotelial fenacetina inducida según los informes, que se caracteriza por la ausencia de a & gt; transversiones T en el
TP53
de genes [26] se eliminó del uréter inferior de una mujer de 64 años, incrustado en Tissue-Tek, snap-congelado en nitrógeno refrigerado por líquido de 2-metilbutano (isopentano) y almacenado a -70 ° C. IHC, microdisección, extracción de ADN y
TP53
secuenciación se realizaron de acuerdo con los métodos descritos anteriormente.
Evaluación del límite de detección para la secuenciación de Sanger
En el límite de detección del estudio , el ADN se extrajo a partir de dos líneas de cabeza y cuello Carcinoma de células escamosas (células SC173 y SC263, amablemente proporcionados por AC Begg, Netherlands Cancer Institute, Países Bajos) que llevan diferentes
TP53
mutaciones y de un tipo salvaje
TP53
línea celular CECC (HN30, proporcionado amablemente por M. Flinterman, Departamento de Medicina y Patología Oral, el Kings College de Londres, el Instituto de lluvia, Reino Unido). Caracterización de la
TP53
estado se llevó a cabo previamente en nuestro laboratorio utilizando el análisis FASAY [25]. SC173 lleva una mutación sin sentido en el exón 5: R175H (CGC & gt; CAC). SC263 presenta una alteración compuesto heterocigotos que implica una mutación sin sentido en el exón 8 R306X (CGA & gt; TGA) y una deleción de 32 pb en el exón 7 (del 704 a 735) (datos de laboratorio CTMA). ADN de ambos
TP53
mutado células se diluyeron en serie y enriquecida en el ADN de las células de tipo salvaje que el 50 al 1,25% mutante a las relaciones de ADN de tipo salvaje. La amplificación y análisis de secuenciación se llevaron a cabo como se describe anteriormente.
análisis estadístico comparativo de la cantidad y el tipo de mutaciones en los datos actuales y anteriores
modelo de regresión de Poisson se construyó para comparar la prevalencia y tipo ( A & gt; T y G & gt; T) de
TP53
mutaciones en sitio de unión de p53 entre actual (n = 5) y anterior [BEN (n = 11 y n = 97) y taiwaneses (n = 151)] clínica series [11], [12], [14], y comparar los resultados de este análisis con los de los pacientes con neoplasias uroteliales (vejiga, uréter, el tracto urinario superior y pelvis renal) (n = 1.111), como aparece en el
TP53
base de datos de la IARC [27]. Vale la pena señalar que los datos asociados con la exposición AA se descartan de
TP53
resultados de base de datos de la IARC.
Resultados
Evaluación del potencial de artefactos
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alteraciones en muestras de tejido
Usando el procedimiento de microdisección activar una correcta identificación de las mutaciones del ADN conocidas caracterizadas por pruebas de rutina anterior. En cuanto a la identificación de los
KRAS mutaciones en
se congelaron los adenocarcinomas, los resultados eran estrictamente idénticos a los obtenidos previamente en muestras FFPE (es decir, la identificación de mutaciones G12S y G12D en los
KRAS mutado y tejidos
estado de tipo salvaje en los otros dos tumores). En cuanto a la identificación de un g.13380 constitucional G & gt; A, mutación p.R248Q identificado mediante un ensayo de FASAY en las células de sangre periférica de un paciente con síndrome de Li-Fraumeni, esta mutación se encontró también en las células malignas del tumor de células de la granulosa utilizando la extracción de ADN, microdisección, nested-PCR y secuenciación de los procedimientos que se utilizan en el presente estudio.
a la inversa, sin artefactos
TP53
se encontraron alteraciones en los distintos controles llevados a cabo para probar la ocurrencia de
TP53 daños relacionados con la extracción de ADN, microdisección, nested-PCR y procedimientos de secuenciación de ADN inducida por
. No se encontraron mutaciones en tres de cada cuatro muestras de uréter utilizados para probar un
TP53
daño iatrogénico. La única excepción fue la muestra uréter de un paciente diabético tipo 2 con un G & gt; Una transición (g.12455, p.R156H) en el exón 5 de la
TP53
gen después de microdisección con energía láser de alta. No se encontraron mutaciones en el dominio de unión al ADN de p53 (exones 5 a 8) en el análisis de ADN extraído de un carcinoma urotelial fenacetina inducida.
Evaluación del límite de detección para la secuenciación de Sanger
El límite de la detección para la secuenciación de Sanger se identificó en 6,25% de mutante con respecto a ADN de tipo salvaje tanto con
TP53
mutado líneas celulares, independientemente de la mutación o deleción evaluado. Con esta proporción de ADN, el heterocigoto A /G pico con diluciones de ADN de serie de SC173 /HN30 ADN mixtas todavía era visible como también lo fue el pico heterocigóticos T y C en combinación con una deleción de 32 pb en el exón 7 con diluciones de ADN de serie de SC263 /HN30 ADN mixtas.
Morfología
Todo p53 áreas positivas correspondieron a TCC papilar o al CIS que contienen anaplásico y células displásicas (Tabla 1). Intra-urotelial y la lámina propia inflamación, hiperplasia y atipia reactiva estaban ausentes. En el paciente 2, las células neoplásicas y displásicas se aferran a la membrana basal (aferrándose CIS).
mutaciones del gen TP53
Incluyendo los dos resultados se informó anteriormente [10], un total de 16 exonic totalmente diferente (n = 13) o intrónica (n = 3) mutaciones de la
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gen se encontraron en los tejidos uroteliales malignas de la cohorte AAN belga (Tabla 1). En el caso 1, dos se encontraron mutaciones en el mismo exón (exón 7), mientras que una sola mutación se encontró en el paciente 2 (exón 5) y 3 (intrón 7). Los pacientes 4 y 5 albergaban 5 exonic diferente y 1 mutaciones intrónicas. Entre las 13 mutaciones exónicas, dos eran sin sentido (pacientes 2 y 5) y las mutaciones de sentido erróneo 11 (pacientes 1, 4 y 5). Fueron situados en el exón 5 (3 mutaciones), el exón 6 (3 mutaciones), el exón 7 (3 mutaciones) o el exón 8 (4 mutaciones). Una de las tres mutaciones intrónicas (g.12627 A & gt; T, la paciente 5) se encuentra en el sitio aceptor de empalme AG. pares a nivel mundial, las mutaciones afectaron A:T (7/16) y pares G:C (9/16). Hubo un número casi igual de transiciones (7/16) y transversiones (9/16). Transiciones (7/16) se produjo de hecho, con una frecuencia similar en pares A:T (3/16) y pares G:C (4/16). A & gt; G, G & gt; A y C & gt; T (2/16) se produjeron con una frecuencia similar a T & gt; C (1/16). Del mismo modo, transversiones (9/16) fueron encontrados en pares A:T (4/16) y pares G:C (5/16) distribuidos de la siguiente manera: A & gt; T (3/16), G & gt; T (3/16 ), G & gt; C (2/16) y a & gt; C (1/16)
análisis estadístico comparativo de la cantidad y el tipo de mutaciones en los datos actuales y anteriores
El modelo de regresión de Poisson. mostró una diferencia altamente significativa (p & lt; 0,001) aumento relativo de la
TP53
prevalencia de las mutaciones en los codones p53 de punto de acceso de la serie clínica actual, en comparación con los resultados de base de datos de la IARC (Tabla 3). En contraste, se encontró una disminución relativa significativa tanto en el BEN (n = 97) [12] y los taiwaneses (n = 151) [14] serie clínica en comparación con los datos clínicos actuales (Tabla 3) IARC y. A no significativa (p & gt; 0,05) con relación disminución /aumento fue encontrado en BEN (n = 11) [11] en comparación con el CIIC y los datos clínicos actuales (Tabla 3) guía empresas
En cuanto al número de. a & gt; T transversion por paciente, un aumento relativo significativa se encontró en la corriente, tanto BEN [11], [12], y los taiwaneses [14] serie clínica, en comparación con los resultados de base de datos de la IARC (Tabla 4). No significativa (p & gt; 0,05). Los resultados se obtuvieron cuando AAN anterior y la serie clínica actual se compararon (Tabla 4)
En comparación con los resultados de base de datos de la IARC, un 5,85 aumento significativo de G & gt; prevalencia T se encontró en la serie clínica actual (Tabla 5). Sin G & gt; T transversion se encontró en ambas series BEN. En cuanto a la serie taiwanesa, hubo una disminución relativa no significativa en G & gt;. Prevalencia T en comparación con los datos de la IARC que dicha disminución fue muy significativa si se compara con los resultados actuales (Tabla 5) guía empresas
Discusión
Este es el primer informe del espectro mutacional de
TP53
gen supresor de tumores en una serie de pacientes belgas (n = 5) con el desarrollo de la AAN y posterior documentado de la CTP en el tracto urinario superior, junto con la participación de la vejiga en una de ellas. Cuatro de ellos habían seguido la dieta de pérdida de peso AA-contaminada y una exposición negado a AA al tiempo que presenta una histología renal típica de la fibrosis intersticial [20] con aductos AL-ADN [18].
Uso exclusivamente muestras congeladas se un prerrequisito absoluto para permitir una adecuada comparación con los datos reportados. A excepción de cinco de los 11 pacientes en los que se utilizaron tejidos embebidos en parafina y fijado en formalina [11], todas las principales
TP53
investigaciones genéticas en los casos que se presentan con la genotoxicidad inducida por AA y neoplasias uroteliales se ha servido de impulso utilizando tejidos frescos congelados [11], [12], [14]. Por el contrario, el objetivo era evitar el efecto nocivo conocido de la fijación con formalina en términos de calidad del ADN y caracterización de estado mutacional del tejido [28]. Para demostrar que
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mutaciones no dio como resultado de los artefactos tecnológicos cuando se utiliza la sección de congelados, se ha prestado una especial atención a los procedimientos de validación exhaustivas. La corriente
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pruebas incluyeron pasos sucesivos (es decir, la captura de microdisección por láser de las células tumorales después de la tinción con azul de toluidina, la extracción de ADN, amplificación por PCR anidada y secuenciación). Este método no produjo resultados falsos negativos. Se permitió de hecho una correcta identificación de los conocidos
KRAS
mutaciones oncogénicas en los adenocarcinomas. También permitió una identificación correcta de un
TP53
mutación constitucional caracterizado previamente asociado con un síndrome de Li-Fraumeni. Esta mutación se encuentra en las células tumorales, mientras que la caracterización anterior se llevó a cabo mediante un ensayo funcional en las células mononucleares periféricas.
Del mismo modo, el procedimiento actual no creó a los resultados falsos positivos en el análisis de las muestras recogidas después de uréter normales en Nefroureterectomía pacientes con enfermedades no relacionadas con AA o un carcinoma fenacetina inducida, y teniendo genotipado convencional actual como estándar de oro. Esto también se aplica cuando se realiza la captura de microdisección por láser con alta intensidad. La única mutación encontrada era un solo G & gt; A de transición (g.12455, p.R156H) en la muestra de tejido de un paciente diabético tipo 2 sin ninguna historia de neoplasia. De interés, no hay diferencia significativa en la prevalencia de G & gt; A de transición entre la población general y pacientes diabéticos tipo 2 [29]. Según la evaluación de diluciones seriadas de ADN
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ha mutado, el límite de detección del procedimiento de determinación del genotipo de corriente fue de 6,25% del mutante de relación de tipo salvaje.
De interés, todos los pacientes de la serie actual eran mujeres y cada uno de ellos presentan al menos un
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mutación en sus tejidos uroteliales malignas mientras que una relación más equilibrada hombre /mujer fue encontrada (53% /47%) en estudios anteriores [11], [14] . En estudios anteriores, la prevalencia de pacientes con
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mutación hotspot varió de 100% (11/11 pacientes BEN) [11] con el 37% (36/97 tumores BEN) [12] o el 47% ( 71/151) taiwaneses AA-pacientes [14]. Teniendo en cuenta que sólo un único paciente se informó con una mutación quíntuple en la base de datos IARC, la observación actual que 40% (2/5) de los pacientes albergaba múltiple
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mutaciones, cada uno con seis mutaciones diferentes (cinco exonic y uno mutaciones intrónicas, entre los cuales uno de empalme mutación en el sitio en el paciente 5) fue un hallazgo sorprendente y muy inusual. También es interesante observar que esta mutación quíntuple también se encontró en la serie BEN [12], que es uno de los hasta ahora más grande reportado serie humana de AA relacionada
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mutaciones. En comparación con los datos de los cánceres uroteliales no relacionados con AA en la base de datos de la IARC (n = 1111) y de la serie taiwaneses (n = 151), la serie actual que mostraron el mayor aumento de la prevalencia relativa de la mutación y G & gt; T transversión en el
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región de punto de acceso. Independientemente de la serie AA actual o anterior, la prevalencia de A & gt; T transversión era significativa y consistentemente más alta que en la base de datos IARC [27]. Nuestro hallazgo confirma que el número y perfil de los
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mutaciones por paciente es altamente inusual, lo que probablemente refleja una exposición repentina altamente tóxico. Ya sea que estas múltiples mutaciones ocurrieron en diferentes clones malignos no se evaluó. Sin embargo, el número de zonas tumorales distintos asociados a este complejo espectro mutacional sin duda refleja la heterogeneidad amplia dentro del tumor con células uroteliales malignas o poli- multiclonales.
Mirando en detalles sobre el tipo de mutación hotspot en este estudio, el punto mutaciones en pares A:T eran tan frecuentes como los que están en pares G:C (7/16 frente a 9/16, respectivamente). Ellos fueron dominados por transversiones con A & gt; T y G & gt; T representan cada una el 18,7% (3/16) de todos los
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mutaciones. Curiosamente, A & gt; T transversión en el tumor urotelial relacionados AA-humana se informó por primera vez en un paciente del Reino Unido [30], pero A & gt; entonces T transversion se encuentra con frecuencia en la región p53 punto de acceso de un carcinoma urotelial asociado con la nefropatía endémica de los Balcanes (BEN) [ ,,,0],11], [12], así como en Taiwán [14]. En todos estos estudios, la población se expuso a AA durante muchos años, con cifras de hasta 66% (33/50) a 72% (13/18) y 55% (46/84) de todos los
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mutaciones, respectivamente. En la serie actual, un tumor con múltiples
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albergaba dos a & gt; transversiones T, una característica también comúnmente reportados en el BEN y la serie de Taiwán [11], [12], [14].