Extracto
Antecedentes
El cáncer colorrectal (CCR) es la segunda causa principal de muerte por cáncer a pesar del hecho de que la detección de este cáncer en etapas tempranas resultados en la tasa de supervivencia superior al 90%. Actualmente, menos del 45% de las personas en situación de riesgo en los EE.UU. son examinados regularmente, exponiendo la necesidad de mejores pruebas de detección. Se realizó dos estudios de casos y controles para validar una prueba basada en la sangre que identifica el ADN metilado en el plasma de todas las etapas del CRC.
Metodología /Principales conclusiones
El uso de un ensayo de PCR para el análisis de
Septin 9 gratis (SEPT9) hipermetilación del ADN extraído de plasma, el rendimiento clínico fue optimizado en 354 muestras (252 CRC, 102 controles) y validados en un estudio ciego, independiente de 309 muestras (126 CRC, 183 controles). También se evaluaron 168 pólipos y 411 controles de enfermedad adicionales. Con base en el estudio de la formación basada en la clasificación SEPT9 detectó 120/252 CRC (48%) y controles 7/102 (7%). En el estudio de ensayo CRC 73/126 (58%) y las muestras de control 18/183 (10%) fueron positivos para SEPT9 validación de los resultados del conjunto de entrenamiento. La inclusión de una réplica medición adicional aumenta la sensibilidad del ensayo en el conjunto de pruebas a 72% (90/125 CRC detectados) mientras se mantiene 90% de especificidad (19/183 para los controles). tasas positivas para los plasmas de los otros tipos de cáncer (11/96) y condiciones no cancerosas (41/315) fueron bajos. La tasa de detección de pólipos (& gt; 1 cm) fue ~ 20%
Conclusiones /Importancia
Análisis de la metilación del ADN en plasma SEPT9 representa un método sencillo y mínimamente invasivo para detectar todas las etapas de. CRC con potencial para satisfacer las necesidades insatisfechas de un mayor cumplimiento en la población de selección. Pruebas clínicas adicionales se justifica
Visto:. Grützmann R, Molnar B, C Pilarsky, Habermann JK, Schlag PM, Saeger HD, et al. (2008) la detección sensible de cáncer colorrectal en sangre periférica mediante Septin 9 metilación del ADN de ensayo. PLoS ONE 3 (11): e3759. doi: 10.1371 /journal.pone.0003759
Editor: José Najbauer, City of Hope Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 4 Agosto, 2008; Aceptado 21 de octubre de 2008; Publicado: 19 Noviembre 2008
Derechos de Autor © 2008 Grützmann et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio fue patrocinado por Epigenómica AG, Berlín. El patrocinador del estudio participó en el diseño del estudio y el análisis de las muestras. Interpretación de los datos y la redacción del documento, así como la decisión de enviarlo para su publicación fue realizada por los autores, incluyendo todos los autores empleados por el patrocinador
Conflicto de intereses:. Fabian Modelo, Volker Liebenberg, Theo Devos, Xiaoling Song, Robert H. Día, Andrew y Catherine Z.Sledziewski Lofton-día se emplean en Epigenómica, el patrocinador del estudio.
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es una de las la mayoría de las neoplasias comunes que se encuentran en los hombres y mujeres en los Estados Unidos. La Sociedad Americana del Cáncer había estimado que se producirían 154.000 nuevos casos de CCR en 2007, lo que resulta en más de 52.000 muertes. Los programas de cribado para la identificación de las condiciones de CRC etapa temprana y pre-neoplásicas pueden mejorar significativamente la evolución de la enfermedad debido a la ventaja de la detección temprana del tratamiento [1]. procedimientos de detección no invasivos actuales no son muy eficaces, ya que requieren el cumplimiento del paciente con muestra de heces auto-recoger analizarán anualmente para detectar la presencia de sangre oculta en heces (SOH) [2]. Hasta la fecha, las mejoras en las pruebas, haciéndolos más sensibles y más fácil de usar, no han aumentado el cumplimiento de la Convención de cribado basados en las heces. pruebas de detección invasivas, como la colonoscopia o la sigmoidoscopia, aunque más eficaces, requieren una preparación extensa del intestino, invasión de la privacidad, y la sedación, y no superar los problemas de cumplimiento actuales de cribado de CCR. Existe una creciente expectativa de que la nueva generación de pruebas de detección basados en biomarcadores moleculares presentes en la sangre debe mejorar el cumplimiento del paciente en el cribado de CCR como lo demuestra el éxito de otros programas de detección, tales como colesterol /lípidos y antígeno específico de próstata (PSA) [5] - [7].
Determinación de los eventos epigenéticos es un fuerte candidato para la detección precoz de la enfermedad ya la regulación de la expresión génica mediante la metilación aberrante del ADN es un evento bien caracterizado en la biología del tumor [8], [9], y se describe ampliamente para CRC [10] - [12]. Los niveles elevados de ADN metilado-libre circulante en la sangre de pacientes con cáncer en comparación con los controles sanos se han reportado [13], [14]. Varios laboratorios también informaron candidatos prometedores de ADN basada en la metilación de marcadores para la detección de CRC [15] - [19]. La traducción de este tipo de marcador candidatos viables en pruebas validados clínicamente y comercialmente ha sido excesivamente lenta e inadecuada. Para facilitar mejoras en la medicina traducción biomarcador Pepe
et al.
Propuso un proceso sistemático para la validación de biomarcadores para la detección precoz del cáncer con 5 fases distintas, cada fase proporcionando mayor nivel de evidencia de validación marcador [20]. En un primer estudio que presentamos el primer nivel de evidencia que SEPT9, un biomarcador basado en la metilación del ADN, efectivamente discrimina CRC a partir de muestras normales [21]. El gen Septina 9 pertenece a una clase de GTPasas que participan en numerosos procesos celulares [22] .El gen se ha demostrado que tiene múltiples transcripciones de codificación empalmados alternativamente al menos 5 polipéptidos caracterizados designado V1-V5 [23], algunos de los cuales se han asociado con el cáncer. La relación de expresión v4 y v4 *, proteínas idénticas codificadas por diferentes transcritos, se ha demostrado que ser alterado en el cáncer de ovario con v4 ser la forma predominante expresado en las células normales y v4 * expresado en tumores [24]. Estudios recientes de la isoforma v1 sugieren que puede promover la sobre-expresión de este polipéptido progresión del tumor en el tejido mamario [25]. Nuestro trabajo previo que describe la metilación aberrante de la región promotora de la transcripción v2 indica que la metilación en esta región está asociada con el cáncer colorrectal [21]. Avanzando en el proceso propuesto por Pepe
et al
, en este informe proporcionamos el segundo nivel de evidencia mediante la presentación de los resultados de la validación del ensayo clínico para SEPT9 en dos grandes conjuntos independientes de plasma que demuestra el potencial de este marcador para la detección precoz del CCR. Aumentar el número de ensayo de pruebas en paralelo ha dado lugar a una alta sensibilidad para la CRC con excelente especificidad en los controles sanos. La especificidad se evaluó adicionalmente en un número de controles de la enfermedad. Por último, se informa que la metilación SEPT9 de lesiones pre-malignas.
Métodos
Los pacientes
700 muestras de pacientes recogidos en 9 sitios se midieron en el estudio de la formación. Se incluyó a pacientes con todos los estadios del cáncer colorrectal, los individuos sin enfermedades del colon según lo verificado por la colonoscopia, controles de enfermedad adicionales y un número de pacientes con pólipos adenomatosos (Tabla 1). Un subconjunto de 354 muestras (sólo CRC y normales con total medición SEPT9) se utilizó para generar el algoritmo de entrenamiento conjunto. El estudio de prueba consistió en 547 muestras de pacientes (un subconjunto de 309 CRC y normales con total medición SEPT9 se utilizó como un conjunto de prueba) recogidos en 14 sitios y se incluye categorías clínicas similares de muestras tal como se utiliza en el estudio de formación. Los controles adicionales de la enfermedad se obtuvieron de individuos con cáncer no colorrectal y varias enfermedades no cancerosas para las pruebas de especificidad adicional. No todos los sujetos fueron verificados con la colonoscopia como CRC-y /o adenoma-libre. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los participantes del estudio que se adhieren a las directrices éticas locales.
Todos los pacientes con cáncer y controles sanos incluidos en ambos estudios fueron por lo menos 40 años de edad, con una preferencia para los pacientes mayores de 50 años y deriva principalmente de las mismas clínicas. Todos los sujetos participantes tenían ni una historia personal de VIH, VHB o VHC o historia previa de cáncer con la excepción del carcinoma de células basales ni síntomas de la enfermedad crónica aguda severa ni exacerbado.
La sangre de todos los sujetos se ha elaborado ya sea antes o más de 2 días y hasta 6 meses después de la colonoscopia y antes de iniciar cualquier tratamiento específico del cáncer. El diagnóstico de cáncer fue confirmado histológicamente de la pieza quirúrgica y sólo los adenocarcinomas fueron incluidos en este estudio.
flujo de trabajo de procesamiento de la muestra
Un flujo de trabajo 3-parte fue desarrollado para la prueba SEPT9 (Figura 1). Extracción de ADN: Libre-flotante en circulación se extrajo ADN de plasma usando el gran volumen kit de extracción de ADN total de ácidos nucleicos (Roche Ciencias Aplicadas, Indianapolis, IN) y el dispositivo de Roche MagnaPure. Ocho o 16 ml de plasma se distribuyó en pocillos MagnaPure (1 ml por pocillo), se extrajo siguiendo el protocolo del kit, y el ADN se eluyó en alícuotas de 100 mL. Los eluidos de cada paciente se juntaron y se concentraron hasta un volumen final de 100 l utilizando Microcon YM-30 filtros (Millipore). Una parte alícuota de 5 l de cada muestra se retuvo para medir el ADN genómico total usando el ensayo de PCR en tiempo real (CFF1) se describe en el cuadro complementario S1. Tratamiento con bisulfito: muestras de ADN concentradas se bisulfito tratados usando métodos para conseguir la conversión máxima y la recuperación de ADN [35]. Una parte alícuota de 5 l de cada muestra se retuvo para medir el ADN total tratado con bisulfito usando el ensayo de PCR en tiempo real (HB14) se describe en el cuadro complementario S1. Análisis en tiempo real PCR: El tiempo real SEPT9 ensayo de PCR se ha diseñado que rodea el sitio de inicio de la transcripción de la transcripción v2. El proceso de análisis de secuencias en tiempo real, las condiciones del ciclo y el control de calidad se describen en el texto S1 y Figura complementario S1. Para las mediciones de ADN de bisulfito convertido genómicos y totales totales, PCR se realizó en una dilución 1:10 (en tampón de elución) de los materiales respectivos. Para las mediciones de SEPT9 en muestras, las reacciones se realizaron en 10-12.5 l de DNA sin diluir en función de experimento. PCR se realizó utilizando el dispositivo de Roche LightCycler 2.0 con la mezcla de ADN de Comienzo Acelerado Maestro HybProbe (Roche Applied Science). Cada ejecución PCR incluyó una curva de ADN estándar preparada utilizando ADN metilado universal CpGenome tratado con bisulfito (Millipore (Chemicon), Billerica, MA) a concentraciones entre 50 pg /rxn-20 ng /rxn. Cada corrida también incluyó un control sin plantilla que se dejó sin tapar durante todo el proceso para el control de la contaminación, y 3 controles sin plantilla que se utilizaron para establecer la línea base de la reacción de PCR. Las muestras se analizaron como capilares individuales de cada PCR plazo, y las réplicas se realizaron en la PCR separada corre. curvas de amplificación de cada reacción fueron verificadas manualmente por 2 revisores independientes.
El diagrama ilustra las principales etapas de procesamiento de la muestra y de flujo de trabajo de laboratorio. Se muestra donde se introducen las muestras de control de proceso en el flujo de trabajo y lo que los ensayos se utilizan para medir la salida de cada paso del proceso. Los recuadros grises indican las pruebas establecer medidas específicas de flujo de trabajo.
Análisis de los datos
Las muestras de pacientes para la formación y la prueba de estudio se agruparon de acuerdo con el diagnóstico y el género y se asignaron aleatoriamente a los lotes de extracción de ADN. Además el estudio de muestras de ensayo fueron cegados antes de la elaboración de los análisis de laboratorio y datos. Se realizó cuantitativa en tiempo real PCR análisis de las muestras de plasma como se ha descrito anteriormente y se replican se promediaron las mediciones. Se utilizó [21] prueba de Chi cuadrado para comparar las tasas de detección entre diferentes ubicaciones de tumor, la edad, el estadio tumoral y sexo. prueba de Wilcoxon-Mann-Whitney y Kruskall-Wallis test se utilizaron para comparar cuantitativamente las concentraciones de ADN metilado 9 Septin entre diferentes ubicaciones de tumor, la edad, el estadio tumoral y sexo. Los intervalos de confianza para proporciones de muestras detectadas se fijaron en 95% y en base a las distribuciones binomiales. Todos los valores de p son de doble cara.
Resultados
El objetivo de esta investigación fue validar el uso de SEPT9 hipermetilación como un biomarcador para el cáncer colorrectal mediante la determinación del clasificador óptimo utilizando un conjunto de muestras (estudio de entrenamiento) y confirmando el clasificador seleccionado en un conjunto de muestras independientes (prueba de estudio). Cada muestra de plasma se procesó utilizando un flujo de trabajo de tres etapas que se describe en la Figura 1. El proceso de flujo de trabajo se controló cuidadosamente con la adición de controles positivos y negativos en cada paso del proceso y las muestras individuales fueron aceptados para el análisis final, después de pasar las especificaciones de control de calidad (ver texto suplementario S1).
estudio de formación
los parámetros demográficos y clínicos de los sujetos incluidos en el estudio de la formación se resumen en la Tabla 1. Trescientos cincuenta y cuatro cáncer colorrectal y muestras de control normal se incluyeron en el análisis de datos primaria. Los datos del estudio se analizó cualitativamente la formación, donde una reacción SEPT9 fue llamado positivo si se detectó una curva de PCR distinta. Cada muestra de plasma se midió en tres reacciones de PCR independientes y con base en análisis de rendimiento clínico, muestras de los pacientes fueron clasificados como positivo si dos de cada tres réplicas de PCR fueron llamados positivo. Sobre la base de este algoritmo cualitativo que mide una sensibilidad del 48% para el cáncer colorrectal y una especificidad del 93% para las muestras de colonoscopia-verificado enfermedades no colorrectales. Alternativamente, se determinó umbrales óptimos basado en el análisis cuantitativo del marcador SEPT9. Estos algoritmos cuantitativos no mejoraron el rendimiento general del marcador (véase el cuadro complementario S2). Utilizando el análisis cualitativo, se analizaron las correlaciones entre la detección de cáncer colorrectal y de diferentes parámetros clínicos. No hubo diferencia significativa en la tasa de detección de localización de tumor, edad o sexo. Se detectaron cánceres colorrectales en etapa temprana a tasas ligeramente más bajos (43%) que los cánceres en etapa posterior (55%), pero la diferencia no fue significativa. Tampoco hubo diferencia cuantitativa significativa entre la cantidad de ADN metilado SEPT9 entre las diferentes etapas (Figura 2A). El marcador SEPT9 también detectó el 22% de los pólipos mayores de 1 cm.
diagramas de caja de percentiles de ADN metilado conjunto de entrenamiento SEPT9 concentraciones en plasma se muestran en los pacientes normales colonoscopia verificado (Normal) y los pacientes con cáncer colorrectal ( CRC). La mediana de las concentraciones de ADN son líneas horizontales rojas; percentiles 25 y 75 son líneas horizontales azules. La anchura de la gráfica de caja percentil en cualquier altura dada es proporcional al porcentaje de observaciones que son más extrema en la dirección que se aleja de la mediana. Los valores de medición individuales se representan como círculos grises. B) Diagramas de caja de percentiles de conjunto de pruebas de ADN metilado concentraciones en el plasma. SEPT9
estudio para el examen
Para confirmar el rendimiento clínico del algoritmo de entrenamiento SEPT9 se recogieron muestras de plasma de una organización independiente conjunto de pacientes (conjunto de prueba - Tabla 1). En comparación con el conjunto de entrenamiento del equipo de prueba contenida significativamente menos casos de cáncer en etapa temprana y pacientes con cáncer eran un poco mayores. Utilizando el umbral SEPT9 determinado en el estudio de entrenamiento hemos sido capaces de confirmar el rendimiento marcador en la prueba de 309 pacientes con cáncer colorrectal y controles sanos con una sensibilidad del 58% y una especificidad del 90% (Tabla 2).
no hubo diferencia significativa en la tasa de detección de localización de tumor, edad o sexo. Se detectaron cánceres colorrectales en fase inicial a tasas más bajas (36%) que los cánceres en etapa posterior (73%), pero la diferencia en la tasa de detección no fue significativa. Sin embargo, hubo una diferencia cuantitativa significativa entre cantidades de ADN metilado SEPT9 entre diferentes etapas (P & lt; 0,002; Figura 2B). pólipos grandes (& gt; 1 cm). Se detectaron a una tasa del 18%
Mejora del proceso produce un mejor rendimiento SEPT9
Durante nuestro control de calidad de rutina se observó la inhibición esporádica de la reacción de PCR (ver Figura S2). Por lo tanto, hemos analizado una réplica SEPT9 adicional utilizando 10 muestras diluidas-plegado disponibles a partir de las mediciones totales originales bis-ADN. La gráfica de correlación de la medida estándar SEPT9 (media de tres réplicas estándar) y una sola medición de la muestra diluida se muestra en la Figura 3.
eje X - concentración de SEPT9 en muestras de aparatos de prueba estándar (media de tres repeticiones estándar) del eje Y - concentración de SEPT9 en 1:10 muestras conjunto de prueba diluido (solo replicar). mDNA - ADN metilado. Grupo 1 - muestras con la misma amplificación SEPT9 en la concentración estándar y diluida, en el grupo 2 - muestras con amplificación SEPT9 sólo en concentración estándar, el grupo 3 - muestras con amplificación SEPT9 sólo en concentración diluida. triángulos verdes - colon sano, círculos rojos - cáncer colorrectal, pólipos cuadrados negros -
Hay tres grupos de muestras: el grupo 1. en el que la amplificación SEPT9 fue idéntica en las muestras testigos y diluidas, en las que el grupo 2 solamente muestras de concentración estándar amplifican y grupo 3 en el que sólo las muestras diluidas amplifican. Grupo 2 consiste en muestras para las que no se observó inhibición de la PCR, pero contenía niveles de ADN tumoral insuficiente para la amplificación de SEPT9 después de la dilución. Grupo 3 muestras muestran inhibición de la PCR en la concentración estándar, pero cuando se diluye, mostró una amplificación SEPT9. Incorporamos el resultado de esta medición adicional en un nuevo algoritmo en el que una muestra de paciente es clasificado positivo si cualquiera de dos de cada tres réplicas de PCR estándar son positivos (algoritmo de conjunto de entrenamiento) o la medida de la muestra diluida es positivo. El nuevo análisis de los resultados de pruebas de ajuste utilizando este algoritmo mejorado dramáticamente el rendimiento del ensayo SEPT9 (Tabla 2).
detección del cáncer colorrectal global alcanzó el 72% mientras se mantiene muy alta especificidad del 90%. Especialmente impresionantes fueron las mejoras en la detección de cáncer en etapa temprana (etapa I /II - sensibilidad 62%). Confirman el valor potencial de SEPT9 como un biomarcador de detección precoz de cáncer colorrectal
No cáncer colorrectal (NCC) y no canceroso enfermedades (NCD) muestra el análisis
también se recogieron y analizaron un subconjunto de muestras de plasma de pacientes con diagnóstico de cáncer no colorrectal (NCC), incluyendo la vejiga, mama, pulmón, hígado, páncreas y próstata, así como no enfermedad cancerosa que puede tener efectos de confusión sobre el desempeño marcador SEPT9. Como se muestra en la Tabla 3, SEPT9 es excepcionalmente específica sobre el cáncer colorrectal en comparación con la detección de los NCC: sólo unas pocas muestras de plasma de cáncer de hígado (2 de 8 muestras), el cáncer de pulmón (4 de cada 13) y el cáncer de vejiga (4 de cada 19) pacientes fueron positivos para el marcador. El bajo porcentaje de SEPT9 presente en varios grupos de enfermedades no cancerosas, por ejemplo, insuficiencia renal crónica, la gastritis y las infecciones respiratorias crónicas (véase la Tabla 3) puntos a su alta especificidad para la malignidad del cáncer colorrectal.
Discusión
En el presente trabajo se determinó el rendimiento de un verdadero ensayo -time PCR para el ADN metilado SEPT9 primero en un estudio de entrenamiento y luego en un estudio de pruebas independiente cegado. La sensibilidad global de los cánceres colorrectales fue comparable en ambos estudios identificados mediante el algoritmo original de entrenamiento. Sensibilidad aumentó al 72%, con una réplica SEPT9 adicional del 10-pliegue de la muestra de plasma diluido. El marcador ha demostrado ser sensible para el cáncer colorrectal en estadio temprano que identifican el 62% de los CRC Etapa I /II. Hubo una tendencia para los cánceres colorrectales etapa temprana para detectar a tasas ligeramente más bajos que los cánceres en etapa posterior, tanto en el estudio de la formación y las pruebas, pero las diferencias no fueron significativas debido al número insuficiente de muestras para cada etapa individual de cáncer. La sensibilidad de la detección de CRC era completamente independiente de la localización del tumor en el colon. Esto puede ser una característica general de los biomarcadores de metilación desde que Chen
et al.
Observó una falta similar de correlación a la etapa o la ubicación en un estudio reciente en las heces de los pacientes con cáncer colorrectal [26]. Otras pruebas fecales tales como sangre oculta en heces y iFOBT han demostrado tener una sensibilidad disminuida para ambos cánceres colorrectales proximales y primeras etapas de cáncer [27]. Finalmente, nuestros resultados indican que el biomarcador también es altamente específico (90 a 93%) en individuos sanos.
Hemos desarrollado un ensayo muy sensible de PCR para detectar promotor v2 metilado de SEPT9 en muestras de plasma. validación eficaz de una prueba de este tipo depende tanto de la calidad del biomarcador como en la calidad y la consistencia de los pasos de flujo de trabajo, incluyendo la medición de marcador final. Hemos controlado el flujo de trabajo en cada paso; evaluación de la variabilidad de la extracción de ADN, la conversión de bisulfito y la amplificación por PCR y debido a tal control de calidad que fueron capaces de identificar inhibición de la PCR esporádica en el equipo de prueba. La superación de este problema mediante la dilución de la reacción de PCR de 10 veces y la combinación de esta medición con la medición sin diluir dio el verdadero rendimiento del marcador SEPT9. El uso de cuatro repeticiones de ensayo (3 repeticiones estándar y 1 diluida) permite el análisis de enfoque alternativo, ya sea en la sensibilidad o especificidad del ensayo de marcador. Al requerir SEPT9 esté presente en todas las repeticiones estándar o un replicado diluida antes de una muestra se clasifica positivo, la prueba logra una muy alta especificidad (97%), y todavía conserva la sensibilidad sustancial (65%). Cuando sólo 1 de 4 repeticiones (ya sea un estándar o uno diluida) se requiere que sea positivo para una llamada positiva (modo de alta sensibilidad) la sensibilidad aumenta a 77% mientras que la especificidad sigue siendo respetable al 75% [véase el cuadro complementario S3].
los grupos de pacientes de control en nuestros estudios incluyeron un conjunto principal de individuos sin enfermedades del colon según lo verificado por la colonoscopia, pero algunas de ellas con condiciones que puedan estar presentes dentro de la población de cribado de CCR. Hemos hecho todo lo posible para evitar el sesgo de selección de los pacientes en el estudio, al exigir controles para estar en el mismo rango de edad como los CRC y que se deriva principalmente de las mismas clínicas como nuestros pacientes con CCR. A pesar de estos esfuerzos se mantuvieron algunos sesgos: la mayoría de los pacientes con CRC en la formación y el equipo de prueba son hombres (57% y 60%, respectivamente), y los pacientes aparatos de prueba son un poco mayores que la formación de los pacientes establecidos. Sin embargo, ya que encontramos que la detección del CRC es independiente de la edad y el sexo del rendimiento SEPT9 informado no debería verse afectada. Nuestro análisis primario se compara el rendimiento del marcador en el plasma de pacientes con cáncer colorrectal versus los sujetos sin enfermedad colorrectal. Se realizaron análisis adicionales utilizando los controles de enfermedades no cancerosas y del plasma de cáncer colorrectal que no sean para identificar los posibles problemas de especificidad. El número de pacientes con estas condiciones no se ponderan en función de su prevalencia, y por lo tanto la verdadera especificidad respecto a estas enfermedades no pueden ser determinadas para la población objetivo. Dado que la tasa positiva observada del marcador es muy baja en las muestras de control, creemos que el marcador SEPT9 tenga un buen rendimiento en futuros estudios clínicos prospectivos cuando se mide en la población de cribado de CCR.
La prueba SEPT9 tiene por objeto la detección asintomática los casos de cáncer colorrectal. También se obtuvieron datos preliminares sobre la detección de pólipos con el ensayo SEPT9 que indican algunos cambios pre-malignos se identifican con nuestra prueba. La última prueba de cribado de CCR también se centrarán en los adenomas que hagan avanzar al cáncer y que podría ser eliminado durante el seguimiento colonoscopia. Aunque en la actualidad todavía no entendemos completamente la historia natural de los adenomas, y no podemos predecir cuáles serían progresar a cáncer, es tentador especular que los marcadores epigenéticos, como SEPT9, puede ayudar con tal estratificación pólipo.
La
Septin 9
gen, también llamado MSF, codifica una proteína de mamífero septinas involucrado en muchos procesos celulares. La interrupción de la acción de
Septin 9
resultados en la división celular incompleta [28].
Septin 9
y otras proteínas han demostrado ser socios de la fusión de los proto-oncogén
MLL
que sugiere un papel en la tumorigénesis [29], [30].
Septin 9
También se ha demostrado que estar en una región suprimida frecuentemente en cánceres de mama y de ovario en la pérdida de heterocigosidad (LOH) estudios, un hallazgo que implica además el gen como un posible supresor de tumor [31]. Burrows
et al.
Informó de un estudio en profundidad de la expresión de las múltiples isoformas de la
Septin 9
gen en el cáncer de ovario y mostró expresión específica de tejido de varias transcripciones [32]. La expresión de la transcripción de v4
Septin 9
ha demostrado ser ausente o disminuido en varias líneas celulares y podría ser reactivado por el tratamiento con 5-azacitidina, proporcionando evidencia inicial de la regulación potencial del gen de la metilación del ADN. se proporcionó evidencia adicional de control de la metilación de la transcripción v2 en un análisis cuantitativo reciente en tejidos y plasma de pacientes con cáncer de colon [21]. Además, un estudio reciente de Bennett
et al.
Indica que la metilación del gen Septina 9 también se produce en los cánceres de cabeza y cuello, sin embargo, la región del evento de metilación no se describe [33]. La sobreexpresión de la
Septin 9
isoformas también se ha demostrado en un número de tejidos tumorales. Un estudio previo de más de 7000 tejidos normales y tumorales indica que el tejido de la expresión específica de Septin 9 transcripciones se produce en una amplia variedad de tipos de cáncer [23] Los autores especulan que el gen es probable que un gen del cáncer de tipo II, donde los cambios en la regulación del control de procesamiento del ARN transcrito de los diferentes productos de la proteína, y los niveles de estas isoformas de proteínas alteradas pueden dar respuestas a la función del gen en tumores malignos. Esta hipótesis es consistente con estudios recientes que muestran Septin 9 isoforma sobre-expresión está asociada con un fenotipo oncogénico [24], [25] y las pruebas que Septin 9 v1 sobre-expresión está asociada con la resistencia del tumor a los fármacos que interrumpen la formación de microtúbulos [34 ].
hasta ahora, las estrategias actuales de cribado de CCR no lograron mejorar el cumplimiento del paciente y para reducir la mortalidad del cáncer colorrectal. La mayoría de los expertos anticipan un cumplimiento de cribado de CCR paciente mejoró con la prueba basada en la sangre, como fue el caso para la detección del cáncer de próstata con PSA o en las enfermedades del corazón con el colesterol prueba /lípidos. Este informe describe la primera validación de una prueba de la metilación del ADN basado en plasma realizado en dos estudios de casos y controles grandes bien controlados que confirma el potencial clínico de SEPT9 biomarcador para la aplicación de la Convención de cribado. Creemos que una prueba basada en la sangre, de fácil administración para la detección precoz del cáncer colorrectal, seguido de la colonoscopia para los individuos positivos tiene el potencial de ser una herramienta muy eficaz para reducir la mortalidad de esta enfermedad. Están previstas las SEPT9 ensayo marcador garantiza una evaluación posterior como una prueba para la detección temprana de CRC y estudios prospectivos para determinar el rendimiento clínico en poblaciones de detección de orientación-elegibles de cribado.
Apoyo a la Información
Texto S1.
métodos complementarios
doi: 10.1371 /journal.pone.0003759.s001 gratis (DOC 0,03 MB)
Tabla S1.
cebador, secuencias de la sonda y el bloqueador del marcador en tiempo real el ensayo de PCR SEPT9, y el control y CFF1 HB14 ensayos de PCR en tiempo real
doi: 10.1371 /journal.pone.0003759.s002
(0.02 MB DOC)
Tabla S2. rendimiento
SEPT9 marcador en conjunto de entrenamiento - algoritmos alternativos
doi: 10.1371 /journal.pone.0003759.s003 gratis (DOC 0,02 MB)
cuadro S3.. rendimiento marcador
SEPT9 en equipo de prueba - análisis alternativo
doi: 10.1371 /journal.pone.0003759.s004 gratis (DOC 0,03 MB)
Figura S1.
Shewhart gráficos de control de la recuperación de ADN genómico total (superior) y SEPT9 ADN marcador (inferior) para el procesamiento de los controles en el conjunto de entrenamiento
doi:. 10.1371 /journal.pone.0003759.s005 gratis (0.08 MB DOC )
figura S2.
Shewhart gráficos de control de la recuperación de ADN genómico total (superior) y SEPT9 ADN marcador (inferior) para el procesamiento de los controles en el conjunto de prueba
doi:. 10.1371 /journal.pone.0003759.s006 gratis (0.08 MB DOC )
Reconocimientos
los autores desean agradecer a los grupos de diagnóstico de la tecnología de detección y desarrollo en Epigenómica para realizar los estudios clínicos. Presentado en parte: Resumen#LB165 Reunión Anual AACR 2007, Los Angeles CA