Extracto
Antecedentes
dipeptidil-peptidasa IV (EC 3.4.14.5) (DPP-IV) es una serina peptidasa implicados en la diferenciación celular, la adhesión, la modulación inmune y la apoptosis, las funciones que controlan neoplásica transformación. Estudios previos han demostrado alteraciones en la expresión y la actividad de los tejidos y de circulación de DPPIV en varios tipos de cáncer y propuso su utilidad potencial para el diagnóstico precoz en el cáncer colorrectal (CCR).
Métodos y resultados principales
La actividad y ARNm y proteínas expresión de DPPIV se analizó de forma prospectiva en adenocarcinomas, adenomas, mucosa colorrectal no afectado y el plasma de 116 pacientes con CRC por fluorimétrica, RT-PCR cuantitativa y métodos inmunohistoquímicos. Los resultados se correlacionaron con los datos patológicos clásicos más importantes relacionados con la agresividad y con tasas de supervivencia a 5 años. Los resultados mostraron que: 1) los niveles y la actividad de DPPIV de mRNA aumentaron en neoplasias colorrectales (prueba de Kruskal-Wallis, p & lt; 0,01); 2) Los dos adenomas y CRC muestran inmunotinción citoplasmática positiva con refuerzo de membrana luminal; 3) la actividad plasmática DPP-IV fue menor en los pacientes con CRC que en los sujetos sanos (prueba de Mann-T, p & lt; 0,01); 4) la actividad DPP-IV plasmática se asoció con una supervivencia peor global y libre de enfermedad (log-rank p & lt; 0,01, Cox análisis p. & Lt; 0,01) guía
Conclusión /Importancia
1) Sobre regulación de DPPIV en tumores colorrectales sugiere un papel para esta enzima en la transformación neoplásica de tejidos colorrectales. Este hallazgo abre la posibilidad de nuevas dianas terapéuticas en estos pacientes. 2) plasmática DPP-IV es un factor pronóstico independiente de la supervivencia de los pacientes con CCR. La determinación de los niveles de actividad DPP-IV en el plasma puede ser una manera segura, mínimamente invasivo y de bajo costo para definir la agresividad de CRC en la práctica diaria
Visto:. Larrinaga G, Pérez I, Sanz B, M Beitia, Errarte P, Fernández A, et al. (2015) dipeptidil-peptidasa IV Actividad se correlaciona con el pronóstico del cáncer colorrectal. PLoS ONE 10 (3): e0119436. doi: 10.1371 /journal.pone.0119436
Editor Académico: Hiromu Suzuki, Universidad Médica de Sapporo, Japón
Recibido: 7 Septiembre, 2014; Aceptado: January 14, 2015; Publicado: 19 Marzo 2015
Derechos de Autor © 2015 Larrinaga et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de Gobierno Vasco (IT8-11 /13), la Universidad del País Vasco UPV /EHU (UFI 11/44), y el Gangoiti Fundación Barrera. Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el CCR es la tercera neoplasia maligna más común en hombres y mujeres en los Estados Unidos, con más de 136.500 nuevos casos estimados y más de 50.000 muertes estimadas en 2014 [1]. Europa y otras regiones desarrolladas muestran tasas similares de incidencia y mortalidad [2]. Tradicionalmente relacionado con los hábitos alimenticios [3], su frecuencia ha aumentado constantemente en las últimas décadas en los países occidentales como consecuencia de estilo moderno de vida para convertirse en un problema de salud de gran preocupación. enormes recursos que se están invirtiendo en la prevención y el diagnóstico precoz de esta enfermedad. campañas de detección basados en la población tratan de descubrir lo más temprano tumores y lesiones precursoras como sea posible, con el objetivo de disminuir la incidencia de la enfermedad, para simplificar el manejo clínico de los pacientes una vez que la lesión se desarrolla, y para mejorar la supervivencia.
Desde el punto de vista patológico, lesiones adenomatosos en el intestino grueso se aceptan plenamente precursores de CRC [4,5] y la secuencia adenoma-carcinoma todavía proporciona un modelo sólido para la investigación sobre la carcinogénesis [6]. Sin embargo, un gran número de procesos metabólicos celulares todavía en gran parte desconocidas están involucrados en el origen y desarrollo de procesos neoplásicos [7].
peptidasas desempeñan un papel clave en la carcinogénesis de varias maneras, por ejemplo la regulación de péptidos bioactivos que son crucial en el crecimiento neoplásico y la respuesta inmune, la degradación de la matriz extracelular, en calidad de moléculas de adhesión o participar en la señalización intracelular [8]. Además, algunos estudios han demostrado que la actividad y la expresión de estas enzimas varían en diferentes tumores en función de los diversos parámetros patológicos como el grado histológico, el estadio y la supervivencia del paciente [8-12]. Por esta razón, las peptidasas son herramientas útiles en el desarrollo de estrategias clínicas para el tratamiento y seguimiento de pacientes con cáncer.
dipeptidil-peptidasa IV (EC 3.4.14.5) (DPP-IV), también conocida como la diferenciación de clúster CD26 antígeno , es una peptidasa de serina expresado en una variedad de células incluyendo células epiteliales, endoteliales y linfocitos [13]. Como otras glicoproteínas unidas a la membrana, sino que también puede ser liberado en forma activa a los fluidos corporales tales como plasma, suero y orina [14]. escinde DPPIV dipéptidos N-terminal de péptidos bioactivos seleccionados incluyendo algunas citocinas, quimiocinas y neuropéptidos, conduciendo a su inactivación y /o degradación. Independientemente de su actividad enzimática, DPPIV interactúa con componentes de la matriz extracelular (ECM), incluyendo el colágeno y la fibronectina, regulando así las interacciones célula-célula y célula-ECM, y con varios receptores y proteasas que conduce a la secreción de las metaloproteasas de matriz (MMPs). A través de estos múltiples funciones, DPPIV regula diversos procesos biológicos incluyendo la diferenciación celular, la adhesión, la modulación inmune y la apoptosis, las funciones que controlan la transformación neoplásica [13].
Muchos estudios han descrito que la expresión y la actividad de DPPIV se altera significativamente en varios tejidos de tumores sólidos y que estos cambios están asociados con el grado del tumor, el estadio y los pacientes supervivencia a 5 años, que apuntan a esta enzima como una herramienta de diagnóstico y diana terapéutica potencial [12,13,15]. Por otra parte, se ha demostrado que los niveles de DPPIV sangre son significativamente más bajos en pacientes con cáncer que en los individuos sanos, un hallazgo que ha sido de gran interés en el desarrollo de marcadores tumorales adicionales [14,16-19]
.
en cuanto a CRC, dos estudios recientes describen que el aumento de la expresión inmunohistoquímica de DPP-IV en los tejidos de CRC se correlaciona con metástasis y peor supervivencia global de los pacientes con CCR [20] y que los niveles circulantes de DPPIV se correlacionan con la recurrencia distante de CRC [21]. Nosotros y otros grupos descritos que el perfil de expresión y la actividad de otras serina peptidasas relacionadas con DPPIV varían a lo largo de la secuencia adenoma-adenocarcinoma y que están correlacionados de forma independiente con la supervivencia de los pacientes con CCR [22-26]. Todas estas evidencias acumuladas apuntan a los análisis de serina peptidasas tales como DPPIV como herramientas prometedoras en el diseño de nuevos biomarcadores de diagnóstico /pronóstico y dianas terapéuticas en el CCR [14,20-26].
En este contexto, la objetivo del presente trabajo fue estudiar de forma prospectiva los perfiles metabólicos y de expresión de DPP-IV en pacientes con CCR el análisis de tejidos de la secuencia adenoma-adenocarcinoma y plasma muestras, y correlacionar los resultados obtenidos con parámetros histopatológicos clásicos para el pronóstico del tumor y la supervivencia .
Materiales & amp; Métodos
Los autores declaran que todos los experimentos llevados a cabo en este estudio cumplen con las normas legales vigentes en España y de la Unión Europea. Las muestras y los datos de los pacientes incluidos en este estudio fueron proporcionados por el Biobanco Vasco para la Investigación-OEHUN (www.biobancovasco.org). Todos los pacientes fueron informados sobre el uso potencial para la investigación de sus tejidos resecado quirúrgicamente, y aceptaron esta eventualidad mediante la firma de un documento específico aprobado por los comités éticos y científicos del Sistema de Salud Pública País Vasco (Osakidetza) (CEIC 11/51).
los pacientes
Un total de 116 pacientes con CCR fueron incluidos prospectivamente en el estudio. Todos los pacientes recibieron una colectomía parcial. La distribución topográfica fue del 41 se puso del lado derecho CRC, 51 y 24 de la izquierda caras del recto. 7 pacientes recibieron terapia preoperatoria, 49 pacientes recibieron quimioterapia o quimio-radioterapia después de la resección, y 60 pacientes no recibieron ningún tratamiento.
En 20 pacientes, pólipos adenomatosos y tanto adenocarcinomatous fueron diagnosticados. 13 adenomas tubulares eran, 6 eran adenomas túbulo, y 1 adenoma velloso. Además, 16 mostraron displasia leve a moderada y 4 mostraron displasia de alto grado. El tamaño promedio fue de 2,1 cm (con un rango de 0.6-4cm). Se utilizaron estos 20 casos para analizar la actividad de DPP-IV y la expresión de ARNm /proteína a lo largo de la secuencia normal de la mucosa adenoma-adenocarcinoma.
El American Joint Committee on sistema de Cáncer (AJCC, 7
ª edición) [27 ] se ha aplicado para asignar etapa y el grado. El seguimiento se cerró el 30 de junio de 2014. En ese momento, 43 pacientes (37%) habían muerto de la enfermedad. El seguimiento medio fue de 53 meses (rango 4-88).
Además, el plasma se recogió antes de la operación y se analizó en 98 de estos pacientes. El plasma de 72 voluntarios sanos sin historia clínica de las enfermedades neoplásicas se utilizó como muestra de control.
Los datos clínicos incluidos en el estudio fueron recuperados de las historias clínicas de los pacientes y se resumen en la Tabla 1.
muestras de tejido
resecciones quirúrgicas fueron sometidos
In fresca
al laboratorio de patología en un plazo de 30 minutos después de la eliminación. El material para este estudio proviene del exceso de tejido de diagnóstico patológico. Manipulación de las muestras se llevó a cabo siguiendo protocolos convencionales para el manejo de las resecciones quirúrgicas del colon y el recto [28]. Las características del tumor fueron reconocidos en el examen macroscópico y fragmentos de tejidos no tumorales del tumor y se congelaron en isopentano y almacenados a -80 ° C seleccionados. Los procedimientos de rutina en el laboratorio de patología incluyen la fijación con formalina de la muestra y de parafina quirúrgica incorporación de los fragmentos de tejido seleccionados para el examen histopatológico. cortes histológicos se tiñeron con hematoxilina-eosina. Además, periféricos muestras de sangre venosa de 98 de estos pacientes se obtuvieron antes de la cirugía y se centrifugaron a 1500 rpm durante 15 minutos. El plasma obtenido también se almacenó a -80 ° C. fue llevado a cabo en el plasma obtenido a partir de 72 voluntarios sanos ensayo enzimático (emparejados por sexo y edad).
Preparación de la muestra
muestras de tumores explantados se homogeneizaron en tampón Tris-HCl 10 a pH 7,4, durante 30 segundos a 800 rpm usando un Heidolph PZR 50 Selecta homogeneizador, y ultracentrifuged en un aparato Centrikon T-2070 Instrumentos Kontron a 100.000
g
durante 35 minutos. Para evitar la contaminación con enzimas solubles, los gránulos resultantes se lavaron tres veces por suspensión en tampón Tris-HCl 10 a pH 7,4. Los sedimentos se homogeneizaron en tampón Tris-HCl 10 a pH 7,4, y se centrifugaron a baja velocidad (1500
g
) durante 3 min para purificar las muestras. Los sobrenadantes obtenidos de este modo se utilizaron para determinar la actividad de DPPIV y las concentraciones de proteína. Todos los pasos antes mencionados se realizaron a 4 ° C.
mediciones de la actividad de DPPIV
actividad de la DPP IV se midió por triplicado mediante el uso de H-Gly-Pro-β-naftilamida como sustrato, después de una versión modificada del método de Alponti et al. [29]. El ensayo se basa en la fluorescencia de los productos generados a partir de la hidrólisis del sustrato por la enzima. Las reacciones se iniciaron mediante la adición de 30 a 50 l de muestra a 1 ml de la mezcla de incubación apropiado (tampón de 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, y 0,2 mM aminoacil-β-naftilamida). Después de 30 min de incubación a 37 ° C, se añadió 1 ml de tampón de acetato de sodio 0,1 M (pH 4,2) a la mezcla para terminar la reacción. El producto liberado se determinó midiendo la intensidad de fluorescencia con un Shimadzu RF-540 Spectrofluorophotometer (las longitudes de onda de excitación y emisión fueron 345 y 412 nm, respectivamente). Se utilizaron los espacios en blanco para determinar la fluorescencia de fondo. La fluorescencia relativa se convirtió en picomoles de producto utilizando una curva patrón construida con concentraciones crecientes de β-naftilamina.
Para verificar que la formación de β-naftilamina (β-NA) se debió a la acción de DPPIV y no se debe a otras enzimas, hemos realizado ensayos de inhibición en el tejido CRC y de plasma con un inhibidor específico de la enzima (diprotina a, 0,2 mM). La liberación de β-NA era principalmente inhibida en los tejidos de cáncer colorrectal (82%) y en muestras de plasma (86%).
Proteína concentración se midió por triplicado mediante el método de Bradford [30], utilizando BSA (1 mg /ml) como calibrador. Los resultados de los tejidos de CRC y de las muestras de plasma se registraron como unidades de peptidasa por miligramo de proteína (UP /mg prot) y por litro de plasma (UP /L), respectivamente. Una unidad de actividad peptidasa (UP) es la cantidad de enzima requerida para liberar un pmol de β-naftilamina por minuto. Los ensayos fluorogénicos fueron lineales con respecto al tiempo de hidrólisis y el contenido de proteínas.
La inmunohistoquímica
Fijado en formol y tejido incluido en parafina de 20 CRC, pólipos adenomatosos y la mucosa circundante no involucrados se immunostained con un anticuerpo monoclonal anticuerpo específico para DPPIV /CD26 (Novus Productos Biológicos NB 100 a 59021, de conejo anti-humano, trabajando dilución 1: 250). El proceso de inmunotinción se realizó siguiendo los métodos de rutina en un immunostainer automática (Dako Autostainer Plus). En resumen, la actividad de peroxidasa endógena fue bloqueada por incubación de las diapositivas de peróxido de hidrógeno al 3% en metanol absoluto durante 10 minutos. La recuperación del antígeno se llevó a cabo en tampón de citrato (10 mM, pH = 6) durante 15 minutos a 100 ° C en un horno de microondas. El anticuerpo primario se aplicó durante 1 hora a temperatura ambiente. Una reacción posterior se realizó con los anticuerpos secundarios y el polímero marcado con biotina libre enzima HRP de la EnVision-Flex sistema de detección (Dako, Carpinteria, CA). No específica de IgG fue utilizado como un control negativo. Una reacción positiva se visualizó con solución diaminobenzydine seguido de tinción de contraste con hematoxilina.
Análisis en tiempo real RT-PCR cuantitativa
La expresión de
DPP-4
, el gen que codifica la DPPIV , se analizó en el tejido a partir de 20 CRCs, pólipos adenomatosos y la mucosa circundante no involucrados. Para evitar la degradación, las secciones de tejido se sumergieron en RNAlater inmediatamente después de la cirugía y se almacenaron a -80 ° C hasta su procesamiento. ARN total fue extraído a partir de 20 mg de tejido utilizando TriReagent (Sigma, St. Louis, MO). Las muestras de ARN se incubaron con RNasa libre de DNasa I y RNasin (Promega, Madison, WI) para eliminar el ADN genómico residual. Primera línea de cDNA fue sintetizado a partir de 5 g de ARN total de cada muestra humana usando el kit de primera cadena de cDNA de síntesis (Roche, Mannheim, Alemania). Las muestras de ADNc resultantes se amplificaron por PCR con pares de cebadores de oligonucleótidos específicos diseñados con el cebador de software de análisis de 3 y sintetizados por Sigma-Genosys (Cambridge, UK). Sobre la base de los experimentos anteriores en carcinoma de células renales humano [15], CRC [12] y otros tejidos humanos [31] Seleccionamos deshidrogenasa gliceraldehído-3-fosfato (
GAPDH
), la polimerasa (ARN) II (ADN dirigió) Un polipéptido (
POLR2A
), hipoxantina fosforribosiltransferasa 1 (
HPRT1
), β-actina (
ACTB
), complejo succinato deshidrogenasa, subunidad A (
SDHA
), TATA vinculante cuadro de proteínas (
TBP
) y peptidylprolyl isomerasa A (
ppia
) como referencia genes endógenos. La secuencia de los cebadores utilizados para amplificar
DPP-4
y los siete genes de limpieza se muestran en la Tabla 2.
La expresión de
DPP-4
y los genes de la casa era cuantificado en todos los ADNc por PCR en tiempo real usando el aparato de detección en tiempo real iCycler iQ (BioRad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.). Los experimentos se llevaron a cabo esencialmente como se describe anteriormente [12,15,32]. Las diluciones de la plantilla de cDNA se prepararon a partir de cada tejido y se amplificaron por triplicado utilizando SYBR SensiFAST Mix (Bioline Ltd, Londres, Reino Unido). Tres controles negativos (sin plantilla, no la transcriptasa inversa y no de ARN en la reacción de la transcriptasa inversa) también se incluyeron en cada placa para detectar cualquier posible contaminación. Después de un arranque en caliente (10 min a 94 ° C), los parámetros utilizados para la amplificación por PCR fueron: 10 s a 94ºC, 20 s a 60 ° C y 30 s a 72 ° C, durante 50 ciclos
datos en tiempo real de la PCR se expresaron como el factor de cambio de la expresión del gen diana con relación a la expresión de ARNm de la media geométrica (GM) de los genes de limpieza en cada muestra, como se describe por Vandesompele et al. [33]. El factor de cambio en la expresión génica se calculó por la fórmula: 2
-ΔΔ C
T, donde C
T es el ciclo umbral, calculado por el software iCycler,? C
T = (C
Ttarget gen-C
genes Tg.m.reference) y ΔΔC
T = (? C
Ttest muestra-? C
Tcontrol muestra).
las muestras del mismo paciente siempre se midieron en la misma serie de análisis para excluir variaciones entre distintas series. PCR datos obtenidos en una de las muestras normales CRC fueron elegidos arbitrariamente como el control, y se incluyó esta muestra en todos los experimentos de PCR para corregir las posibles variaciones interensayo.
El análisis estadístico
Kolmogorov-Smirnov y pruebas de Shapiro-Wilk se aplicaron a los datos obtenidos a partir de muestras de tejido y plasma, respectivamente, para saber si los números seguidos o no una distribución normal. Basándose en esta información (p & lt; 0,05), la actividad de DPPIV en el tejido y plasma se analizó con sondas no paramétricos: pruebas de Mann-Whitney y Kruskal-Wallis se utilizaron para detectar diferencias entre dos o tres grupos, respectivamente
por último, se realizaron curvas de Kaplan-Meier y log-rank test para evaluar la asociación entre la actividad de DPP-IV y la supervivencia a los 5 años, la comparación de los grupos creados por los puntos de corte basado en curvas características receptor de funcionamiento (ROC). Un modelo de regresión de Cox se utilizó para probar los efectos independientes de las variables clínicas y patológicas y la actividad de DPP-IV en la supervivencia. el software SPSS 21,0 se utilizó para el análisis estadístico.
Resultados
actividad DPP-IV y la expresión en tejidos de colon de pacientes de CRC
Cuando se analizó la actividad de DPP-IV en todo el adenoma colorrectal secuencia de adenocarcinoma, se encontró una mayor actividad en los CRC y adenomas que en la mucosa adyacente no afectada (prueba de Kruskal-Wallis, p = 0,015).
DPP4
expresión mRNA mostró un patrón similar, con niveles más altos en ambas neoplasias que en el tejido no tumoral (prueba de Kruskal-Wallis, p = 0,001). Estos resultados se describen en la Tabla 3.
Cuando los datos fueron estratificados por la distribución topográfica de los CCR, no encontramos ninguna diferencia significativa (prueba de Kruskal-Wallis, p = 0,965). actividad DPPIV tejido también fue similar entre los pacientes que recibieron el tratamiento preoperatorio, postoperatorio y la terapia de los pacientes que no recibieron ningún tratamiento después de la resección (prueba de Kruskal-Wallis, p = 0,842).
Fig. La figura 1 muestra la expresión inmunohistoquímica de DPP-IV en el adenocarcinoma de colon, adenoma y la mucosa normal adyacente. mucosa normal no expresó DPPIV inmunotinción. Sin embargo, tanto adenomas (tubular, y túbulo-vellosos) y CRC muestran inmunotinción citoplasmática positiva con refuerzo de membrana luminal. El componente inflamatoria en todos los casos también fue positiva.
inmunotinción DPPIV se encuentra en el citoplasma de adenomas y células de CRC que exhiben refuerzo membrana luminal.
actividad DPPIV tisú de acuerdo con 5-años la supervivencia y las características patológicas
para determinar los mejores valores de corte para la supervivencia global (OS) (Fig. 2A) y la supervivencia libre de enfermedad a los análisis (DFS) (Fig. 2B), se realizaron curvas ROC. Para la actividad de DPPIV tejido, punto /mg de proteína de corte de 2.600 UP mostró que los porcentajes más óptimos de sensibilidad y especificidad (Se = 47% y Sp = 55% para el sistema operativo, y el Se = 48% y Sp = 55% de DFS) (Fig . 2A y 2B)
No se observaron proporciones de sensibilidad y especificidad óptimas utilizando el siguiente valor de corte:.. 2600 UP /mg prot de la actividad de DPP-IV para el sistema operativo de tejido (a) y DFS (B)
Las curvas de Kaplan-Meier y log-rank test mostró que la SG a cinco años y DFS de los pacientes con CCR no se correlacionó con la actividad de DPP-IV tejido (log-rank test, p = 0.8 para el sistema operativo; y p = 0,67 para DFS) (Fig. 3A y 3B, respectivamente).
la supervivencia global (a) y curvas de supervivencia libre de enfermedad (B) de pacientes con CCR en función de su patrón de actividad de DPPIV tumor. También se incluye el número de pacientes en riesgo de cada grupo en los puntos de tiempo individuales.
Del mismo modo, la estratificación de la actividad de DPP-IV por varias variables patológicas no arrojó ningún resultado estadísticamente significativo (Tabla 4).
actividad DPP-IV en muestras de plasma de pacientes con CRC
en el plasma de CRC actividad DPP-IV pacientes fue significativamente menor que en los individuos sanos (175 ± 7,2 UP /L vs 218 ± 10.1 UP /L, Mann-Whitney p & lt; 0,01) (Fig 4).. Sin embargo, la estratificación de los datos de acuerdo con las variables patológicas no dió ningún resultado significativo (Tabla 5).
Los valores son medias ± SE de unidades de peptidasa por litro de plasma (UP /L). (*) Prueba de la t de Student, p. & Lt; 0,01
En las muestras de plasma se realizaron curvas ROC tanto para la actividad de DPP-IV y los niveles de antígeno carcinoembrionario (CEA). Para la actividad DPP-IV plasmática, valor de corte de 165 UP /L mostró las proporciones de sensibilidad y especificidad más óptimas (Se = 64% y Sp = 63% para el sistema operativo, y el Se = 65% y Sp = 58% para DFS) (fig. 5A y 5B). Un valor de corte de 5 ng /ml para CEA, que se sabe que tienen un impacto pronóstico en el CCR [34], mostró menor sensibilidad (44% para el sistema operativo, y el 39% para DFS) pero mayor especificidad (68% para el sistema operativo y el 64% de SSE) que DPPIV (figura 5A y 5B)
No se observaron proporciones de sensibilidad y especificidad óptimas utilizando el siguiente valor de corte:.. 165 UP /L para la actividad plasmática DPP-IV, tanto para el sistema operativo ( A) y DFS (B). Un valor de corte de 5 ng /ml para CEA, mostró menor sensibilidad, pero mayor especificidad que DPPIV.
Las curvas de Kaplan-Meier y log-rank test mostraron que tanto OS (Fig. 6) y DFS (Fig. 7) se correlaciona inversamente con la actividad DPP-IV plasmática. Por lo tanto, cuando la actividad de DPP-IV plasmática fue superior a 165 UP /L de la SG y SLE fueron significativamente peores (log-rank p = 0,009 y = 0,018, respectivamente) (Figs. 6A y 7A).
(A) curva de Kaplan-Meier y la prueba de log-rank. (B) Análisis multivariado de las variables clínico-patológicas y la actividad DPP-IV plasmática en la predicción del sistema operativo. También se incluye el número de pacientes en riesgo de cada grupo en los puntos de tiempo individuales.
(A) Curva de Kaplan-Meier y log-rank test. (B) Análisis multivariado de las variables clínico-patológicas y la actividad DPP-IV plasmática en la predicción de DFS. También se incluye el número de pacientes en riesgo de cada grupo en los puntos de tiempo individuales.
Por otro lado, el análisis multivariante mostró que la actividad DPP-IV plasmática (p = 0,001), el grado histológico (p = 0,02 ) y la invasión local (p = 0,01) fueron factores independientes que influyen OS paciente (Fig. 6B), y que la actividad DPPIV plasmática (p = 0,005), la invasión vascular (p = 0,02) y la etapa agrupadas (p = 0,02) fueron pronóstico independiente factores de DFS (Fig. 7B).
Discusión
la transformación maligna de normal a los tejidos cancerosos se asocia con modificaciones glicoproteína de superficie celular. Estos cambios fenotípicos pueden jugar un papel crucial en la oncogénesis y pueden ser marcadores tumorales malignas útil para distinguir entre tejidos benignos [8]. En cuanto a CRC, la secuencia adenoma-carcinoma en el intestino grueso describe que la progresión gradual de normal a epitelio displásico, y por lo tanto a carcinoma, es el resultado de la acumulación sucesiva de mutaciones genéticas que conducen a niveles alterados de varias glicoproteínas, como algunas peptidasas [6,8].
el primer resultado relevante en nuestro estudio fue que DPPIV mostró mayor actividad y los niveles de mRNA en las lesiones preneoplásicas y adenomatosos en el CCR en comparación con la mucosa circundante no afectado, aunque no se correlacionó con patológica variables y con una supervivencia a los 5 años de los pacientes con CCR. Anteriormente, se informó que la actividad y la expresión de otros dos serina peptidasas, proteína de activación de fibroblastos alfa (FAP) y la prolil endopeptidasa (PEP), fue mayor en los adenomas y en etapas tempranas del CRC, respectivamente [22,24]. Además, la expresión de FAP correlaciona con peor supervivencia [22,23] y la actividad PEP lo hizo con una mejor supervivencia global y libre de enfermedad [25]. A pesar de estas influencias divergentes sobre la Convención pronóstico sugieren diferentes roles de actuación para estos serina peptidasas en esta enfermedad, la expresión y actividad de estos aumentos de peptidasas en los tejidos neoplásicos y preneoplásicas deben tenerse en cuenta en el diseño de nuevos enfoques terapéuticos para el cáncer colorrectal.
Debido a su expresión variable en tumores sólidos y de sus diversas funciones biológicas, el papel exacto que desempeña la DPPIV en el cáncer aún no se ha dilucidado. Se ha descrito que DPPIV puede promover o impedir el desarrollo de tumores en función del tipo específico de tumor o en la fase de desarrollo del tumor es [13]. Este fenómeno de la especificidad del tumor establece dificultades prácticas en la aplicación de inhibidores de peptidasas en terapias contra el cáncer, y este punto está siendo investigado activamente hoy en día [35,36]. Una nueva tendencia en este tema consiste en el uso de profármacos citotóxicos activados para ser activado por peptidasas específicas únicamente cuando estas peptidasas son más activos o altamente expresado, con el fin de dañar la célula neoplásica sin modificar la funcionalidad de la enzima [35,36]. Algunos investigadores están trabajando en profármacos con FAP como diana [35]. Desde su homólogo DPP-IV también es muy activa en los adenomas y CRC, se sugiere que esta serina peptidasa podría ser el blanco de profármacos similares.
glicoproteínas de la superficie celular pueden ser liberados al espacio extracelular, aparecen en diversos fluidos corporales y se han convertido en suero útil o biomarcadores plasmáticos para ayudar en la detección, diagnóstico, estadificación, pronóstico y seguimiento de la terapia del cáncer. El ejemplo más relevante en la siguiente clínico de los pacientes con CCR es el antígeno carcinoembrionario (CEA) [34]. Sin embargo, el análisis de DPPIV en el plasma o suero de estos pacientes ha resultado ser un método fiable en la detección temprana del CRC, siendo complementaria a la examen de sangre clásico oculta en heces y otros biomarcadores séricos que están bajo investigación clínica hoy en día [14, 17-20].
Varios autores [14,17,19] han descrito disminuciones en los niveles circulantes de DPPIV de CRC pacientes en comparación con los sujetos sanos. Además, los aumentos de esta enzima se han observado en el suero de metastásica
vs
. pacientes no metastásicos [14,17,19,20]. Estos datos se obtuvieron mediante inmunodetección, lo que sugiere su utilidad potencial para el diagnóstico precoz y el seguimiento clínico. También se detectó que la actividad de DPPIV medida por métodos fluorométricos se redujo significativamente en el plasma de pacientes con CRC. Por el contrario, se encontró que esta actividad no se correlacionó con el estado metastásico o con cualquier otra variable patológica.
Las altas diferencias en el número de pacientes entre los grupos con y sin metástasis podrían estar en el origen de este parcial discrepancia. Otras causas también deben ser considerados porque se ha descrito que varios fenómenos biológicos pueden influir en la actividad de circulación DPPIV /CD26 sin afectar el nivel de proteínas. En este sentido, la presencia de moléculas que alteran la actividad de esta enzima en circulación ha informado [37,38]. Nazarian et al. [38] han demostrado en un estudio muy reciente que los pacientes con cáncer de próstata metastásico se presentan disminución de la actividad de DPPIV circulando mientras que los niveles de proteína fueron similares con respecto a los pacientes con tumor primario localizado. Este hallazgo se refirió a un pequeño péptido que circula como una posible causa de esta inhibición [38] y abre nuevas perspectivas para estudios adicionales para aclarar la posible utilidad del análisis combinado de la actividad y los niveles de proteína de DPPIV en el suero /plasma de los pacientes con cáncer.
Dado que los niveles y actividades de la PEP y FAP plasmáticas también se han correlacionado con la supervivencia de los pacientes con CCR [19,25], un objetivo principal de nuestro estudio fue analizar de forma prospectiva la correlación entre la actividad plasmática de su homóloga DPPIV y la supervivencia a los 5 años de los pacientes. Los datos mostraron que los pacientes con actividades de mayor DPPIV plasmáticas tenían una supervivencia global y libre de enfermedad más pobre. Estos datos mostraron mejor sensibilidad pero peor especificidad que los obtenidos con CEA. El análisis multivariado demostró que la DPP-IV es un factor pronóstico independiente influir en la supervivencia del paciente CRC. Por lo tanto, existen evidencias convincentes de que la determinación de la circulación de DPPIV puede ser útil en el diagnóstico precoz [14,17-19,21] y también en el pronóstico de la CRC.
El origen de circulación de DPPIV en pacientes con el cáncer es un tema controvertido. Las hipótesis actuales sitúan su origen en el hígado y las células del sistema inmune [14] y en el microambiente tumoral [8,14,19,38]. Se realizó el análisis inmunohistoquímico través de la secuencia adenoma-carcinoma conocer la ubicación de DPPIV en los tejidos colorrectales. Las células no neoplásicas de la mucosa colorrectal no se tiñen con DPPIV. Por el contrario, adenoma y células CRC mostraron inmunotinción citoplasmática positiva con refuerzo de membrana luminal. Este patrón inmunohistoquímico está de acuerdo con la mayor actividad y los niveles de mRNA también hemos encontrado en neoplasias. Además, se encontró inmunotinción con DPPIV en las células inflamatorias de lámina propia de la mucosa normal y neoplásico. Este hallazgo podría sugerir que DPPIV es liberada de ambas células inmunológicas y neoplásicas en los CRC.
En conclusión, el presente estudio demuestra que la DPP-IV es hasta reguladas en los tejidos adenomatosos y CRC en comparación con la mucosa no afectada. la actividad DPP-IV plasmática es menor que en sujetos sanos y se asocia de forma independiente con una peor supervivencia a 5 años en pacientes con CCR. La determinación de la actividad de DPPIV en el plasma es un método seguro y mínimamente invasiva y de bajo costo, y puede ser complementario a la determinación de los niveles de proteína CD26 pacientes con CRC. Nuevos estudios con mayor número de pacientes, recogiendo el preoperatorio y postoperatorio muestras de plasma en varios puntos temporales [21], deben llevarse a cabo para confirmar el valor predictivo de estos resultados a la hora del diagnóstico y durante los pacientes de seguimiento.
Reconocimientos
queremos agradecer a Arantza Pérez (UPV /EHU), por su contribución técnica a este estudio y profesor Juan Bilbao (UPV /EHU) por su apoyo estadístico.