Extracto
PP2A es una serina /treonina fosfatasa fundamental para los procesos fisiológicos, incluyendo la apoptosis . Cell penetrante péptidos son moléculas que pueden translocación en las células sin causar daño a la membrana. Nuestro objetivo era desarrollar péptidos de fusión célula-penetrantes específicamente diseñados para interrumpir la caspasa-9 interacción /PP2A y evaluar su potencial terapéutico
e in vitro
in vivo
.
Diseño experimental
Hemos generado un péptido que contiene una secuencia de penetración asociada al motivo de interacción entre la caspasa-9 humana y PP2A (DPT-C9H), con el fin de orientar su asociación. El uso de líneas de células tumorales, células humanas primarias y primarias xenoinjertos de cáncer de mama humano (BC), se investigó la capacidad de DPT-C9H para provocar la apoptosis in vitro y la inhibición del crecimiento del tumor (TGI)
in vivo
. DPT-C9H se administró intraperitonealmente a dosis de 1 a 25 mg /kg /día durante 5 semanas. El tumor se calculó en relación de volumen (RTV).
Resultados
Hemos demostrado que la DPT-C9H se dirigen específicamente la caspasa-9 /interacción PP2A
in vitro
y
in vivo
y apoptosis de la caspasa-9-dependiente inducida en líneas celulares de cáncer. DPT-C9H también indujo significativa TGI en los modelos de xenoinjertos BC. El péptido ratón específicos DPT-C9 también indujo TGI en el pulmón (modelo K-Ras) y los modelos de cáncer de mama (PYMT). DPT-C9H tiene un efecto específico en células transformadas B aisladas de pacientes con leucemia linfocítica crónica sin ningún efecto sobre las células sanas primarios. Por último, no se observaron ni toxicidad ni respuestas inmunogénicas.
Conclusión
Uso de los péptidos que penetran en células bloquea las interacciones de la caspasa-9 /PP2A, hemos demostrado que DPT-C9H tuvo un fuerte efecto terapéutico
in vitro en
y
in vivo
en modelos de ratón de la progresión tumoral
Visto:. Arrouss I, Nemati F, F Roncal, Wislez H, K Dorgham, Vallerand D, et Alabama. (2013) La focalización específica de la caspasa-9 /Interacción PP2A como terapia potencial Nueva Lucha contra el Cáncer. PLoS ONE 8 (4): e60816. doi: 10.1371 /journal.pone.0060816
Editor: Ming Tan, de la Universidad del Sur de Alabama, Estados Unidos de América
Recibido: 12 Octubre, 2012; Aceptó 3 de marzo de 2013; Publicado: 23 Abril 2013
Derechos de Autor © 2013 Arrouss et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores gracias a la Inserm y el Instituto Curie para la financiación. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la apoptosis es una muerte celular programada genéticamente y su desregulación está asociada, entre otras patologías, con tipos de cáncer. Varios fosfatasas se han convertido recientemente en objetivos atractivos para el tratamiento de una variedad de enfermedades, incluyendo el cáncer [1], [2], [3], [4]. Sin embargo, los únicos fármacos clínicos dirigidos a fosfatasa son la ciclosporina immunosuppresssive A y FK506, que inhiben serina /treonina fosfatasa 2B (calcineurina) y la activación de NFAT [5], [6], [7], [8], [9]. Pero el uso a largo plazo de estos fármacos puede conducir a efectos secundarios no deseados [10].
El Ser /Thr fosfatasas PP1 y PP2A se han implicado tanto en la inducción de la muerte celular a través de 1) desfosforilación de Bad [11 ] y la caspasa-9 [12] 2) la estimulación de la citocromo
c
liberación [13], y 3) la desfosforilación de la proteína de retinoblastoma [14], [15]. Sin embargo, estas fosfatasas mayoría controlan el nivel de fosforilación de Bcl-2 y la caspasa-9, que determina sus propiedades funcionales [16], [17], [18]. A la inversa, la inhibición de la PP1 [19], PP2A [20], o PP2C [21] desencadena la muerte celular, lo que indica también una potencial función anti-apoptótica de estas fosfatasas, y apuntando a una interacción compleja de acciones de fosfatasa. Hemos demostrado previamente una interacción entre la caspasa-9 y PP1α. En este complejo, que se activa PP1α induce la caspasa-9 desfosforilación, y, como consecuencia, su activación conduce a la apoptosis [12]. Hemos detectado en este complejo, además de PP1αactivity, otra actividad enzimática sensible al ácido okadaico compatible con una actividad de PP2A, lo que sugiere una posible interacción entre la caspasa-9 y PP2A que puede estar involucrado en la regulación de la muerte celular.
Cell penetrante péptidos (CPP) son moléculas que pueden translocación en las células sin causar daño a la membrana, conduciendo a su uso propuesto como vectores para la entrega de la carga terapéutico [22]. Estos péptidos pueden atravesar la membrana y alcanzar el citoplasma y /o núcleo [23]. El uso de CPP, también hemos informado anteriormente evidencia experimental como prueba de principio para la tecnología de la fosfatasa de drogas (DPT), [24], [25].
Sobre estas bases, se decidió analizar si la modulación de la PP2A y la caspasa-9 interacción podría tener un impacto sobre la inducción de deathing de células tumorales sin afectar a las células sanas, y demostró DPT-C9H y DPT-C9 correspondiente a los sitios de unión entre humanos y de ratón de la caspasa-9 y PP2A respectivamente, tienen una contra específica -tumour efecto.
Materiales y Métodos
Las células y cultivos
Daudi humano, las líneas celulares Jurkat y HeLa fueron cultivadas en RPMI suplementado con 10% de FCS. LKR10 y LKR13 se han descrito anteriormente [26] y se cultivaron en RPMI suplementado con 10% FCS. cáncer humano de mama (CM), melanoma uveal (UM), cáncer de pulmón no de células pequeñas y de células de cáncer de pulmón de células pequeñas líneas se han aislado de xenoinjertos de cáncer humanas primarias [27], [28], [29]. Las tres líneas celulares de MU han sido obtenidas directamente de los pacientes '. líneas celulares de BC se cultivaron en DMEM o RPMI suplementado con 10% a 20% de FCS, a excepción de HBCx-15, que fue suplementado con 10% de suero de caballo. líneas celulares de cáncer de pulmón de mensajería unificada y se cultivaron en RPMI suplementado con 10% o 20% de FCS, respectivamente. Las líneas celulares de BC y UM se pueden aislar directamente a partir del tumor correspondiente. Las líneas de células Daudi, HeLa y Jurkat se obtuvieron de la colección del Departamento.
inmunoprecipitación y Western Blot
La inmunoprecipitación y Western Blot se realizaron como se describe anteriormente [12]. Los anticuerpos anti-caspasa 9, y anti-PP2A se adquirieron de Santa Cruz, Señalización Celular, Sigma o Abcam. El anti-Tim 23 y anti Cyt c se obtuvieron de Transduction Laboratories.
Síntesis de péptidos y la secuencia
Los péptidos fueron sintetizados como se describe anteriormente [30].
Detección de la apoptosis por Anexina tinción
la apoptosis se detectó por tinción con Anexina V-FITC de acuerdo con el protocolo del fabricante (BD Bioscience).
caspasa-9 actividad
se detectó actividad de la caspasa-9 utilizando el kit de la caspasa-Glo 9 (Promega) y siguiendo el protocolo del fabricante.
suero de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA en suero)
se llevó a cabo la prueba de ELISA como se describe anteriormente [31], [ ,,,0],32].
membrana Miochondrial potencial de ensayo
Para la detección de los cambios en el potencial de membrana mitocondrial, se utilizó el medidor de célula JC-10 kit de ensayo siguiente de recomendaciones de los fabricantes.
análisis del ciclo celular
Un total de 1 × 10
6 células fueron fijadas en etanol al 70% durante 1 hora a 4 ° C. Las células se centrifugaron y se lavaron con tampón de tinción (DPBS /2% de FCS). Después del lavado, las células se trataron con 50 l de RNasa (1 mg /ml de stock) y se incubaron durante 30 min a 37 ° C. Las células se tiñeron con 5 mg de yoduro de propodim durante 30 min a temperatura ambiente. El contenido de ADN celular se analizó mediante FACS.
El aislamiento de la fracción de mitocondrias
Un total de 40 × 10
6 células se lavaron con PBS enfriado. sedimento celular se resuspendió en 5 volúmenes de helado de tampón A (20 mM Hepes-KOH, pH 7,5, KCl 10 mM, MgCl 1,5 mM
2, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, DTT 1 mM, PMSF 0,1 mM , sacarosa 250 mM) suplementado con inhibidores de proteasa. Las células se rompieron en un homogeneizador Dounce, los núcleos se centrifugaron (1000xg, 10 min, 4 ° C), y el sobrenadante se centrifugó adicionalmente (10.000 xg, 10 min, 4 ° C), pellet mitocondrial se resuspendió en tampón A y se almacenaron a -80 ° C.
el aislamiento de las poblaciones de células
la sangre fresca de donantes sanos fue recogido por el Etablissement Francais du Sang. muestras de leucemia linfocítica crónica (LLC) se obtuvieron del Servicio de Hematología del hospital Pitié Salpêtrière. células mononucleares de sangre periférica (PBMC) aisladas de pacientes o donantes sanos se mantuvieron en RPMI 1640 suplementado con 10% de FCS, aminoácidos no esenciales al 1%, 1% Hepes, piruvato de sodio 1% y el 1% de glutamina. Se aislaron las células B usando el kit de aislamiento negativo Dynal (Invitrogen). La pureza de las células aisladas alcanzó hasta el 98%. Los linfocitos humanos aislados se tiñeron con los eventos tempranos de apoptosis anti-hCD19-AP y se determinaron utilizando Anexina-V-FITC.
En vivo y modelos de xenoinjertos de tumores humanos primarios
se obtuvieron los humanos cáncer de mama (BC) xenoinjertos primarios como se describe anteriormente [27], [28] los tumores de cáncer de mama de ratón se obtuvieron utilizando la transgénico
polioma Medio-T
modelo de ratón PYMT [33]. Que crece espontáneamente tumores de mama ocurren en ratones transgénicos fueron xenoinjertado en
ratones desnudos inmunodeficientes
para permitir evaluaciones farmacológicas, y mantenido de
nude
ratón para
nude
ratón pasajes en serie.
ratón del adenocarcinoma pulmonar primaria mutado para
K-ras
El K-ras
ratones LA1 fueron proporcionados por el Instituto Nacional del Cáncer modelos de ratón de los cánceres humanos Consortium (MMHCC) (NCI ratón repositorio /NIH, Rockville, MD). Llevan una latentes
K-ras
alelo con dos copias del exón 1: uno era la de tipo salvaje y el otro el mutante G12D (Tyler Jacks). El alelo latente se activa estocásticamente en las células a través de la recombinación homóloga, lo que resulta en la supresión de la copia de tipo salvaje del exón 1 y la expresión de una forma oncogénica de la
K-ras
gen. adenocarcinomas de pulmón multifocales desarrollan espontáneamente en el 100% de estos ratones.
ensayos terapéuticos
Para los ensayos terapéuticos experimentales en xenoinjertos subcutáneos trasplantado (tumores humanos primarios y tumores PYMT), de 5 a 8 semanas de edad nu suiza /ratones hembra nu recibido un injerto subcutáneo de fragmentos de tumor con un volumen de aproximadamente 15 mm
3 como se describe anteriormente [29].
Para los ensayos experimentales terapéuticos en K-ras
ratones LA1 , ratones de 16 semanas se asignaron al azar entre el control (n = 17) o grupo de tratamiento (n = 16) durante 4 semanas. Los ratones se pesaron una vez por semana. Al final del tratamiento, la autopsia se realizó para los grupos de placebo o tratamiento y los tumores de pulmón fueron contados. Los resultados se expresan como el número de tumor /ratón, media ± SEM.
Volumen
tumor se calculó mediante la medición de dos diámetros perpendiculares con pinzas. Cada volumen del tumor (v) se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula: V = axb
2/2, donde a y b son los más grandes y los más pequeños diámetros tumorales perpendiculares. volumen tumoral relativo (RTV) se calculó a partir de la siguiente fórmula: RTV = (Vx /V1), donde Vx es el volumen del tumor en el día X y V1 es el volumen del tumor en el inicio de la terapia (día 1) se obtuvieron curvas .Growth representando el volumen medio de RTV en el eje Y contra el tiempo (eje X, expresado en días después de comenzar el tratamiento), la actividad antitumoral se evaluó de acuerdo con el tumor de inhibición del crecimiento (TGI), calculado de acuerdo con las siguientes fórmulas: ciento GI = 100 -. (RTVt /RTVC) x 100, donde RTVt es el medio RTV de los ratones tratados y RTVC es la RTV mediana de los controles, tanto en un punto de tiempo determinado cuando el efecto antitumoral fue óptima
DPT- C9H y DPT-C9 péptidos diluidos en agua /glucosa (1 a 25 mg /kg) por vía intraperitoneal fueron dadas por la ruta 5 a 7 días por semana, de acuerdo con los modelos y los esquemas terapéuticos.
ensayos de bioluminiscencia
línea celular HBCx-12A se estableció a partir del xenoinjerto HBCx-12A y se mantuvo en RPMI, suplementado con suero de ternera fetal al 20% y penicilina /estreptomicina. Las células fueron transducidas con el sobrenadante que contiene luciferasa lentiviral [19] y Ds-rojo y un total de 1,9 × 10
6 células que expresan Ds-RED-Luc se implantaron subcutáneamente en
Tarjetas telefónicas ratones desnudos. El crecimiento del tumor se mide por el calibrador y por imágenes ópticas.
Imágenes de bioluminiscencia se realizó con el sistema de formación de imágenes IVIS (IVIS100, Caliper Life Sciences, EE.UU.). ratones anestesiados fueron inyectados i.p. con luciferina a 150 mg /kg. tiempo de adquisición de imágenes fue de 1 s a 1 min, dependiendo de la señal de bioluminiscencia. El análisis se realizó utilizando el software de imagen viva V. 2.50 (Caliper Life Sciences).
Las pruebas estadísticas
En
in vivo
análisis experimentos ', la significación estadística de las diferencias observadas entre individuo RTV correspondiente al grupo de ratones tratados y el grupo control, en el que se han incluido 9-10 ratones por grupo, se calcularon mediante la prueba t de Student apareado [29]. Para K-ras
ratones L1 modelo, utilizamos el test de Mann Whithney
Péptidos secuencia
DPT-SH1:. VKKKKIKREIKI
C9: YIETLDGILEQWARSEDL
C9H: YVETLDDIFEQWAHSEDL
DPT-C9H: VKKKKIKREIKI YVETLDDIFEQWAHSEDL
DPC-C9: VKKKKIKREIKI YIETLDGILEQWARSEDL
DPT-C9H Mut: VKKKKIKREIKI YVETLDDIFEQAAHSEDL
Todo el péptidos se solubilizaron en agua estéril.
la carcasa de protocolo y animal experimental estaban en conformidad con las directrices institucionales propuestas por el Comité de Ética francés (Acuerdo B75-05-18, Francia). No fue necesaria ninguna autorización para este estudio. Toda la cirugía se realizó bajo zylazine /anestesia total de ketamina y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
Todos los pacientes habían dado previamente su consentimiento informado para la investigación experimental en el tejido tumoral residual disponible después anatomopatológicas y análisis citogenético. Las muestras de LLC son restos tumorales y los pacientes dado su consentimiento informado. Esta investigación no se llevó a cabo fuera de nuestro país. Los comités de ética de aprobar el presente procedimiento.
Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, la decisión de publicar o preparación del manuscrito.
Resultados
DPT bloques de péptidos -C9h la caspasa-9 /interacción PP2Ac en líneas celulares de cáncer de mama
Hemos determinado el sitio de unión de la caspasa-9 humana y el ratón para PP2A (sitio web de patente PCT-EP2010 /054134,: espacenet .com o worlwide.espacenet.com, para la secuencia de péptidos, véase Materiales y Métodos) y se asocia esta interacción motivo de servicio de transporte permeable celular [24], [25]. Con el fin de apuntar a la interacción de la caspasa-9 /PP2Ac, decidimos utilizar el péptido patentado que contiene la secuencia de penetración publicado previamente asociado con el sitio de interacción de ratón (DPT-C9) o humano (DPT-C9H) caspasa-9. Como controles, se generó la lanzadera DPT-SH1 solos, los péptidos C9 y C9H, que no contenía la lanzadera y el péptido DPT-C9H mut, con una mutación en la caspasa-9 secuencia de unión /PP2A y que no se une PP2A (datos no mostrados).
fuimos los primeros interesados en que confirma que el objetivo específico de péptido-DPT C9H era el complejo de la caspasa-9 /PP2A. A tal fin, se analiza si el péptido humano DPT-C9H wasable para apuntar a los
in vivo
y
in vitro
caspasa-9 interacción /PP2A en. Para
in vivo
competencia, lisados de células HBCx-12A no tratados o tratados con DPT-C9H de control se inmunoprecipitaron con anti-caspasa-9 de anticuerpos y la presencia del complejo /PP2A caspasa-9 se analizó mediante transferencia de western . La Figura 1A muestra que la cantidad de complejo detectado en las células tratadas-C9H DPT fuertemente se redujo en comparación con las células control no tratadas. Para el
in vitro
competencia ensayo, lisados de HBCx-8 células se inmunoprecipitaron con un anticuerpo anti-caspasa-9 y la interacción con PP2A compitieron con el péptido DPT-C9H (Fig 1A). PP2Ac se detectó en el control de la caspasa-9 inmunoprecipitados, mientras que era casi indetectable después de la competición con 1,5 mM de péptido-DPT C9H. En tanto, (
in vitro
y
in vivo
competiciones), complejo de la caspasa-9 /PP2A no fue alterada por la lanzadera DPT-SH1 (Figura 1B). Esto sugiere fuertemente que el péptido DPT-C9H se dirige específicamente a la interacción entre la caspasa-9 humana y PP2Ac.
A)
In vivo
competencia de la caspasa-9 /PP2Ainteraction. La línea celular de cáncer de mama HBCx-12A se cultivó durante 24 h en presencia o ausencia (control) de DPT-C9H (100 mM); las células se lisaron y se inmunoprecipitaron extractos citoplásmicos con anticuerpo anti-caspasa-9 y a inmunotransferencia con anti-PP2Ac y anti-caspasa-9 anticuerpos.
in vitro
la competencia de la interacción de la caspasa-9 /PP2A. lisados citoplasmáticos de células HBCx-12A se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-caspasa-9; Se compitió la caspasa-9 interacción /PP2Ac
in vitro
con 1,5 mM de DPT-C9H péptido durante 30 minutos a temperatura ambiente; inmunoprecipitados se lavaron y a inmunotransferencia con anti-PP2Ac y anti-caspasa-9, este último como control interno de la carga de proteínas. B) La línea celular HBCx-12A se cultivó en presencia o ausencia (control) de la lanzadera DPT-SH1 (100 mM) durante 24 h y el
in vitro
y
in vivo
la competencia de la caspasa-9 interacción /PP2A se analizó como anteriormente.
los péptidos penetrantes DPT-C9 y DPT-C9H inducen la apoptosis específica de la especie
se analizó la capacidad de la dos péptidos penetrantes DPT-C9H y DPT-C9, así como los péptidos de control negativo C9, C9H y DPT-SH1 para inducir la apoptosis. Como se muestra en la Figura 2A, la apoptosis inducida por DPT-C9H, como se detecta por Anexina-V tinción en líneas de células Daudi, Jurkat, y HeLa humanas sobre 20 h de tratamiento, mientras que los péptidos C9 y C9H sin lanzadera y la lanzadera solo, no lo hicieron inducir la apoptosis en líneas celulares humanas. Del mismo modo, el péptido DPT-C9H no tenía ningún efecto apoptótico en la líneas celulares de cáncer de pulmón de ratón LKR10 y LKR13, mientras que el péptido DPT-C9, específico para la caspasa-9 ratón, la apoptosis inducida en ambas líneas celulares en 24 h de tratamiento ( Fig 2B). Por otra parte, no se observó ningún efecto de apoptosis tras el tratamiento de líneas celulares con el servicio de transporte (figura 2B). También se muestra el nivel basal de la apoptosis en las células control no tratadas. Estos resultados apoyan firmemente la especificidad de especie 'de ambos péptidos DPT-C9 y DPT-C9H.
A) líneas de células Daudi, Jurkat, y HeLa se cultivaron en presencia de DPT-C9H, DPT-SH1, C9H, o péptidos C9 para 20 horas a 100 M y apoptosis se estimó mediante tinción con Anexina-V. B) Las líneas celulares de cáncer de pulmón de ratón y LKR10 LKR13 se cultivaron en presencia de DPT-C9H, DPT-C9, o DPT-SH1 a 100 mM. Después de 24 h de incubación, la apoptosis se estimó mediante tinción con anexina. Se muestra el nivel basal de la apoptosis de células no tratadas de control. Los valores de p se muestran también (* & lt; 0,05; ** & lt; 0,001; *** & lt; 0,0001). líneas de células C) de mama, melanoma uveal y cáncer de pulmón aisladas de xenografs humanos primarios se cultivaron en presencia o ausencia de péptido DPT-C9H (100 mM) durante 24 h y la apoptosis fue estimado por Anexina V-FITC. Se muestra nivel basal de la apoptosis, sin adición de péptidos (color gris) se muestran los valores de p. RE). líneas celulares de cáncer de mama derivados de los xenoinjertos humanos primarios, se incubaron con C9H en medio de cultivo a 150 mM y la inducción de apoptosis se estimó en diferentes momentos. E) líneas celulares de cáncer de mama aisladas de xenoinjertos humanos primarios BCx-3 y BCX-12 se cultivaron en presencia o ausencia (control) del péptido DPT-C9H para 24 h y la apoptosis se estimó.
Uso de las líneas celulares de mama humano, melanoma uveal, no microcítico de pulmón de células y el cáncer de pulmón de células pequeñas obtenidas a partir de modelos de xenoinjertos humanos primarios, probamos el efecto apoptótico de ambos péptidos DPT-C9H y C9H. La apoptosis también se analizó en las líneas celulares de cáncer de mama comerciales. En todas las líneas celulares analizadas, la apoptosis inducida DPT-C9H, que van de 20 a 75% a las 24 h de cultivo (Figura 2C), mientras que no se observó efecto después del tratamiento C9H de líneas celulares de cáncer de mama (Fig 2D). La apoptosis de las células de control no tratadas varió de 3 a 8%. Además complementaria de la DPT-C9H péptido 27h después del tratamiento inicial aumentó considerablemente el nivel de apoptosis (datos no mostrados). La Figura 2E muestra dos parcelas apoptosis histogramme representativos de dos líneas de células aisladas de xenoinjerto de cáncer de mama humano modelos HBCx-12A HBCx-3 y tratada 24 h con o sin (control) péptido DPT-C9H. Tomados en conjunto, estos resultados muestran una fuerte
in vitro
efecto antitumoral del péptido DPT-C9H en varias líneas celulares humanas.
La inhibición de la actividad de caspasa bloques de efectos apoptóticos de la DPT-C9H
Dado que la caspasa-9 iniciador es un importante mediador de la apoptosis, se analizó la capacidad de DPT-C9H para activar la caspasa-9 en la línea celular de cáncer de mama humano HBCx5. Las células se incubaron con el péptido y la actividad de la caspasa-9 se estimó en diferentes momentos. Hemos observado un aumento de la actividad caspasa-9 en DPT-C9H línea de células tratadas (Figura 3A). Se obtuvieron resultados similares usando líneas de células de melanoma uveal y el cáncer de pulmón no de células (datos no presentados). Además, utilizando el inhibidor de caspasa Z-VAD, se observó una disminución en la actividad de la caspasa-9.
) HBCx 3 células
A se cultivaron durante 3 o 6 h con medio (control), 100 M de DPT- C9H o 10 M del inhibidor de caspasas Z-VAD (incubación previa de 1h) y 100 M de DPT-C9H. Actividad de la caspasa-9 se estimó utilizando un sustrato luminógeno. Los resultados se representan en relación con las células control no tratadas como unidades arbitrarias. se muestran los valores de p. B) HBCx 3-células se cultivaron durante 24 h con medio (control), DPT-SH1 (100 mM), DPT-C9H (100 M) o Z-VAD (10 M, la incubación previa de 1h) y DPT-C9H ( 100 M). La apoptosis se calcula mediante la unión de anexina-V-FITC. C) HBCx-3 células fueron tratadas durante diferentes periodos de tiempo con DPT-C9H (100 mM) y después se incubaron durante 30 min a 37 ° C protegido de la luz con la sonda fluorescente JC-10. Se midió la fluorescencia verde y rojo. Los datos se representan con respecto a las células control no tratadas. se muestran los valores de p. D) HBCx-12A y celulares HBCx-3 líneas fueron tratadas durante 24 h con 100 M de DPT-C9 h. fracción mitocondrial se separó a partir de lisados de células enteras y immunoblotted de citocromo
c
. El BM también se hibridó con el marcador mitocondrial Tim23 como control interno de la carga de proteínas. E) HBCx-3 células fueron no tratado (control) o tratadas con 10 o 25 mM de DPT-C9H durante 24 o 48 horas y el ciclo celular se analizó mediante FACS.
Para determinar si activa la caspasa-9 está implicada en la acción apoptótica de DPT-C9H, se analizó el efecto del inhibidor de caspasas Z-VAD sobre la apoptosis de células detectado por la unión de anexina-V-FITC. Como se muestra en la figura 3B, el inhibidor de caspasa reduce notablemente la apoptosis inducida por el péptido. El tratamiento de las células con el servicio de transporte o el inhibidor sola no induce la apoptosis (Figura 3B).
DPT-C9H induce la despolarización de la membrana mitocondrial y el citocromo
c
liberación sin afectar el ciclo celular
con el fin de caracterizar la apoptosis inducida por la vacuna DPT-C9H, se determinó la participación de las mitocondrias. En un ensayo basado en fluorescencia, la exposición de HBCx-5 células a péptido indujo una marcada disminución del potencial de membrana mitocondrial (Fig 3C). Para confirmar el papel de la mitocondria en la apoptosis inducida por la vacuna DPT-C9H, analizamos si el tratamiento DPT-C9H induce el citocromo
c
liberación. El uso de proteínas mitocondriales de control no tratados células tratados con péptido o, se observó la liberación de citocromo
c
de la mitocondria en la DPT-C9H células tratadas, mientras que en la no tratada con células de control, el citocromo
c
es retenido en la fracción mitocondrial (Fig 3D). La relación del citocromo
c
/Tim 23 se utilizó como control interno para la normalización y la cuantificación de la cantidad de liberación de Cit
c.
Estos resultados confirman la implicación mitocondrial de la apoptosis inducida por la vacuna DPT-C9H .
por último, analizamos si el péptido DPT-C9H podría interferir en la secuencia del ciclo celular. Las células fueron no tratadas (control) o se trataron con diferentes dosis de péptido para diferentes períodos de tiempo y la distribución del ciclo celular se analizó (Fig 3E). Con
in vitro
sub-apoptóticos dosis de péptido, que mostró que la DPT-C9H no indujo la acumulación de células tumorales en cualquier fase del ciclo celular, sea cual sea la concentración utilizada y el tiempo analizado (Figura 3E).
DPT-C9H tiene efecto sobre las células tumorales, pero no en las células sanas
leucemia linfocítica crónica (LLC) se caracteriza por la acumulación de células B CD5 + monoclonal en los órganos hematopoyéticos, lo que refleja un defecto en la apoptosis. Con el fin de evaluar el efecto apoptótico de péptido DPT-C9H en las células sanas y tumorales primarias de origen similar, hemos utilizado las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de donantes sanos y pacientes con leucemia linfocítica crónica (CLL). PBMC de donantes sanos o pacientes con LLC fueron tratados durante 3 horas con el péptido DPT-C9H, se lavan, se resuspenden en medio completo sin péptido durante 6 horas y luego se analizaron para la apoptosis. La figura 4A muestra que DPT-C9H tiene un efecto apoptótico sobre las células B de pacientes con LLC, pero no en las células B de donantes sanos con relación a las células control no tratadas. DPT-C9H no tiene efecto en T, NK y monocitos de donantes sanos o de pacientes con LLC. El servicio de transporte péptidos C9H DPT-SH1 o solo no tuvo ningún efecto (datos no mostrados). Por último, se observó un efecto pro-apoptótica similar de péptido DPT-C9H cuando se aislaron células B de la médula ósea de pacientes con LLC (Fig 4B). Este resultado sugiere que las células tumorales solamente B se ven afectados por el tratamiento DPT-C9H sin ningún efecto sobre las células de donantes sanos, lo que subraya el efecto tumoral específico de DPT-C9H.
A) las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de donantes o pacientes con LLC sano se cultivaron en presencia de DPT-C9H (150 mM) durante 3 h, después se lavaron, se transfirieron a completar 6h medio y la apoptosis se estimó más tarde. La selección de las células B se hizo por el anticuerpo anti-CD19 antes de la tinción con anexina V-FITC. Se utilizaron células no tratadas como control. B) Las células aisladas de médula ósea de pacientes con LLC y donantes sanos se trataron como en A y se analizaron para la apoptosis. se muestran los valores de p.
La falta de actividad inmunogénica y
in vivo
toxicidad de DPT-C9H y DPT-C9 péptidos
Dado que nuestro interés final es demostrar un efecto antitumoral de la DPT-C9H en los cánceres humanos, hemos decidido analizar la actividad inmunogénica
in vivo
del péptido.
ratones de células T
inmunodeficientes Desnudos se trataron cinco días por semana durante 6 semanas por inyecciones intraperitoneales de DPT-C9H. Los sueros fueron recogidos en diferentes momentos y se analizó la producción de anticuerpos dirigidos contra la DPT-C9H o DPT-SH1. Mediante la prueba de ELISA, que no detectó ninguna en los anticuerpos contra DPT-C9H o DPT-SH1 en todo el cinética analizada en dos dosis diferentes de péptido (Figura 5A). Del mismo modo, la respuesta de anticuerpos también se analizó utilizando ratones inmunocompetentes, demostrando una vez más la falta de producción de anticuerpos ni contra DPT-C9H ni péptidos DPT-SH1 (figura 5B). Este resultado sugiere que el péptido DPT-C9H es inmunogénica incluso después de prolongados
in vivo en modelos
Administración inmunocompetentes o de ratón immunodefficient.
Una anticuerpos) de suero tomadas de ratones desnudos tratados por diferentes períodos de tiempo fueron detectados por ELISA a dos diferentes concentraciones de péptido-DPT C9H (10 y 50 mM). anticuerpos B) de suero de los ratones de tipo salvaje tratados por diferentes periodos de tiempo fueron probados por ELISA contra DPT-C9H y DPT-SH1 (50 mM). C) DPT-C9H se administró por vía intraperitoneal en ratones portadores de tumores HBCx-12A en 1, 5, o 25 mg /kg una vez al día durante 5 semanas; la mediana del peso de los ratones de cada grupo experimental se representa en diferentes momentos. Un total de 10 ratones fueron incluidos por grupo. Del mismo modo, DPT-C9H se administró por vía intraperitoneal en ratones que llevan tumores HBCx-8 a 10 mg /kg dos veces al día durante 4 semanas. DPT-C9 se administró IP en ratones modelo de modelo de PYMT en dosis de 5 mg /kg. El peso medio de los ratones de cada grupo experimental se representa en diferentes momentos. Diez ratones fueron incluidos por grupo.
Antes de
in vivo
evaluación terapéutica, se evaluó la toxicidad de la DPT-C9H en ratones portadores de tumores HBCx-8 y HBCx-12A después de varios horarios de la administración, es decir, inyecciones intraperitoneales en 1, 5, o 25, mg /kg una vez al día, o 10 mg /kg dos veces al día, durante 4 a 5 semanas. Cualquiera que sea la dosis, no se observó ningún efecto secundario en todos los ratones tratados, así como una estabilidad de peso completo de los ratones tratados (figura 5C). Además, no se observó muerte en todo el experimento. Finalmente, para confirmar la ausencia de toxicidad del péptido específico de ratón, se evaluó la tolerabilidad del péptido DPT-C9 se administra a 5 mg /kg una vez al día en el transgénico
polioma medio-T
ratones PYMT (Fig 5C) . En todos los experimentos, no se observaron efectos secundarios, incluyendo la pérdida de peso.
DPT-C9H y DPT-C9 inducen
in vivo
inhibición del crecimiento tumoral en modelos de cáncer de pulmón y de mama
Para confirmar la primera
in vivo
inducción de apoptosis específica de la especie, se evaluó la eficacia del péptido DPT-C9 en el K-ras
modelo LA1 adenocarcinoma de ratón transgénico y en
polioma Medio -T
ratones (PYMT). Administrado por vía intraperitoneal a una dosis de 5 mg /kg durante 5 días /7 durante 4 semanas, DTC-C9 indujo una disminución significativa en la carga tumoral de pulmón como el número de tumores por ratón era 24,6 ± 2,8 (media ± SEM) en el grupo placebo en comparación con 15,4 ± 1,9 en el grupo tratado (p = 0,01) (Fig 6A). La Figura 6B muestra el análisis histológico del tejido pulmonar de ratones control y tratados con representativas DPT-C9H. Por otra parte,
ratones desnudos portadores de tumores de mama de ratón PYMT xenoinjertados fueron tratados por vía intraperitoneal con el péptido DPT-C9-ratón específica a una dosis diaria de 5 mg /kg. A pesar de un crecimiento tumoral muy rápido de manera espontánea, DPT-C9 indujo una significativa TGI de 46% (p & lt; 0,03) (Fig 6C). El volumen tumoral relativo (RTV) se calculó como se describe en detalle en Materiales y Métodos.
A) El péptido DPT-C9 se administró IP a 5 mg /kg una vez al día, 5 días a la semana durante 4 semanas en el K-Ras
LA1 adenocarcinoma modelo de ratón, que muestra una disminución significativa en la carga del tumor de pulmón en comparación con el control de la formulación de los ratones tratados con vehículo (p = 0,01). B) El análisis histológico de los tumores de pulmón de control tratados sólo con el vehículo de la formulación y los ratones tratados con DPT-C9. C) DPT-C9 se administró IP como para la K-Ras
modelo LA1 en ratones portadores de tumores de mama PYMT ratón xenoinjertados, con una TGI significativa de 46% después de 11 días de tratamiento en comparación con los ratones control tratados con el vehículo la formulación.