Extracto
Las células de cáncer dependiente del ciclo celular REG4 responder al estrés mediante la activación de una variedad de vías de señalización de supervivencia. Una desintegrina y metaloproteinasa (ADAM) 9 se regula positivamente durante la progresión del cáncer y la terapia hormonal, que funciona en parte mediante un aumento de especies reactivas del oxígeno. A continuación, presentamos
in vitro e
pruebas in vivo con descuento que el enfoque terapéutico de la expresión génica por ARN ADAM9 lentivirus entregado pequeña horquilla (shRNA), inhibió la proliferación de líneas celulares de cáncer de próstata humano y bloqueado el crecimiento tumoral en un modelo murino de la metástasis ósea del cáncer de próstata. estudios del ciclo celular confirmaron un aumento en la fase G1 y la disminución de la población de la fase S de las células cancerosas en condiciones de estrés de hambre, lo que se correlaciona con niveles elevados de superóxido intracelulares. los datos de microarrays mostraron significativamente los niveles disminuidos de regeneración miembro de la familia derivadas de islotes 4 expresión (REG4) en células de cáncer de próstata con la caída de la expresión génica ADAM9. Esta regulación a la baja REG4 también dio lugar a la inducción de la expresión de p21
Cip1 /WAF1, que regula negativamente la ciclina D1 y para el /S transición G1. Nuestros datos revelan un nuevo mecanismo molecular de ADAM9 en la regulación de la proliferación de células de cáncer de próstata, y sugiere una modalidad combinada de terapia génica ADAM9 shRNA y agentes citotóxicos para refractario hormonal y el cáncer de próstata metastásico óseo
Visto:. Liu CM , Hsieh CL, El YC, Lo SJ, Liang JA, Hsieh TF, et al. (2013) dirección in vivo de la expresión génica utilizando ADAM9 Delivered-lentivirus shRNA Suprime el crecimiento del cáncer de próstata mediante el control de REG4 dependiente progresión del ciclo celular. PLoS ONE 8 (1): e53795. doi: 10.1371 /journal.pone.0053795
Editor: Irina U. Agoulnik, Universidad Internacional de la Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 6 Septiembre, 2012; Aceptado: 3 de diciembre de 2012; Publicado: 16 Enero 2013
Derechos de Autor © 2013 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por NSC99-2320-B-039-029-MY3 del Consejo Nacional de Ciencia, Taiwán (http://web1.nsc.gov.tw); INDH-EX99-9902BI, INDH-EX100-9902BI y INDH-EX101-9902BI del Instituto Nacional de Investigación de la Salud, Taiwán (http://www.nhri.org.tw). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
ocurren en más del 80% de los casos de cáncer de próstata en etapa avanzada, las metástasis óseas se correlaciona con un alto nivel de morbilidad; una tasa de supervivencia a 5 años del 25% y la supervivencia media de aproximadamente 40 meses [1]. metástasis óseas, debido a la aparición de dolor de huesos, fracturas óseas asociadas con el cáncer y compresión de la médula, así como neuropatía craneal, anemia y la infección, pueden comprometer de manera significativa la calidad de vida de pacientes con cáncer de próstata [2], [3]. Actualmente, la privación de andrógenos es la primera línea de tratamiento para el cáncer de próstata metastásico; sin embargo, el cáncer de próstata a menudo progresar a una fase de hueso metastásico independiente de andrógenos. Una vez que se produce esta progresión, la quimioterapia y la radioterapia son las principales opciones terapéuticas, los cuales causan efectos secundarios desagradables y sólo proporcionan un beneficio limitado a la cantidad y la calidad de vida [4]. Por lo tanto, es importante buscar nuevos factores terapéuticos que pueden tener el potencial de mejorar la supervivencia de los pacientes con refractario hormonal y el cáncer de próstata metastásico hueso.
A pesar de los recientes avances en las estrategias terapéuticas, muchos cánceres malignos todavía desarrollan resistencia a la radiación y terapias específicas [5], [6]. La resistencia se produce como resultado de la respuesta al estrés, permitiendo que las células malignas para superar el efecto citotóxico de muchas terapias [7]. Una desintegrina y metaloproteinasa (ADAM) 9 es un importante miembro de una familia de genes desintegrina y metaloproteinasa. Las proteínas codificadas por esta familia median respuestas celulares al estrés ambiental mediante la interacción con una variedad de proteínas de la superficie celular y la regulación de diversos procesos celulares incluyendo la proliferación, la unión de la matriz extracelular, y ectodominio derramamiento [8] - [12]. El trabajo previo realizado por nuestro grupo [13] y otros [14] han demostrado en estudios clínicos que los niveles más altos se correlacionan con ADAM9 un período más corto de la remisión del cáncer de próstata. Se demostró además una correlación significativa entre tumor ADAM9 tinción y el riesgo de recurrencia del cáncer de próstata y la muerte en los pacientes que se sometieron a la terapia hormonal, lo que sugiere que un aumento progresivo en la expresión ADAM9 podría ser utilizado como un biomarcador de mal pronóstico en pacientes con cáncer de próstata después de la terapia hormonal [15]. Por otra parte, desmontables de ADAM9 de expresión resulta en un aumento radiosensibilidad y quimiosensibilidad a los agentes terapéuticos [16], lo que indica que la sobreexpresión ADAM9 por las células de cáncer podría ser potencial mecanismo de escape para la superación de muerte de células cancerosas inducida por el estrés; Sin embargo, se sabe poco sobre los mecanismos de regulación aguas abajo por el cual ADAM9 promueve la supervivencia de las células cancerosas en respuesta al estrés. Dado que la expresión ADAM9 elevada se observó en muchos tumores avanzados, se plantea la posibilidad de que ADAM9 podría ser un biomarcador potencial para el cáncer dirigida la terapia génica, aunque se necesita más investigación.
En el presente estudio, se evaluará la viabilidad de vector lentiviral-parto niños pequeños ARN de horquilla (shRNA) contra ADAM9 para el tratamiento de andrógeno-independiente y metástasis ósea del cáncer de próstata humano en un modelo animal experimental. El mecanismo molecular que subyace a la acción terapéutica de ADAM9 dirigida también fue aclarada la terapia génica.
Materiales y Métodos
Materiales
Se obtuvieron vectores retrovirales que contienen shRNA que se dirige a ADAM9 y control shRNA a Open Biosystems (Lafayette, CO). Vector lentiviral shRNA ADAM9 y los controles se obtuvieron de la Instalación Nacional de ARNi Core en el Instituto de Biología Molecular /Centro de Investigación Genómica, la Academia Sinica, Taiwán. Los anticuerpos anti-ADAM9 se obtuvieron a partir amp I +; D Systems (Minneapolis, MN). EF1-α Anti-humano obtenido de Millipore (Billerica, MA) se utilizó como un anticuerpo de control.
Cultivos Celulares
La línea celular de cáncer de próstata metastásico independiente de andrógenos, PC3 y dependiente de andrógenos línea celular de cáncer de próstata, LNCaP, se utilizaron en estudios previos [13], [17] y se cultivaron en T-medio (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con 5% de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS) (Hyclone, Logan, UT), 50 UI /ml de penicilina y 50 mg /ml de estreptomicina (Invitrogen) y se mantuvo en 5% de CO
2 a 37 ° C.
Vectores y ARN de interferencia
El retroviral plásmido pSM2C y shRNA específico para ADAM9, así como el plásmido de control y pGIPZ shRNA específicamente REG4 orientación se obtuvieron de Abrir Biosystems. El lentiviral pLKO, controlar shGFP, y shRNA orientación del ARNm de la secuencia codificante ADAM9 se obtuvieron de la Instalación Nacional de ARNi Core en el Instituto de Biología Molecular /Centro de Investigación Genómica, la Academia Sinica, apoyado por el Programa Nacional de Investigación de Medicina Genómica de Subvenciones de NSC (NSC 97-3112-B-001-016). información de destino aparece en la figura S1. Estos vectores shRNA se construyeron insertando oligonucleótidos hibridados que contienen la secuencia shRNA en EcoRI y AgeI sitios aguas abajo del promotor U6 en el vector pLKO.1. lentivirus recombinante que lleva shRNA fue producido por co-transfección de 293FT células con una mezcla de ADN de plásmido que consiste en PMD-G (VSV-G) del sobre, pCMV-ψR8.91 (Gag /Pol /Rev), y los vectores pLKO /1-shRNA usando el reactivo TurboFect (Fermentas, Glen Burnie, MA) según las recomendaciones del fabricante. sobrenadantes de cultivo que contiene el virus se recogieron 2 días después de la transfección y se utilizaron para infectar PC3, LNCaP, y las células RCC52 en combinación con 8 mg /ml de polibreno (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Las líneas celulares estables fueron seleccionados por el cultivo de células en 2,5 mg /ml de puromicina (Calbiochem, La Jolla, CA) durante una semana. transferencia de Western, FACS, o qPCR se utilizó para determinar los efectos de la caída de la expresión génica.
Detección de Proteína
extractos de proteínas de las líneas celulares se analizaron en geles de SDS-poliacrilamida (15 g por carril ) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa Hybone ECL (GE Healthcare Life Science, Piscataway, NJ). Las transferencias se sondearon con anticuerpos monoclonales de ratón anti-humanos contra ADAM9 (R & amp; D Systems), p21 y p27 (especie de regalo del Dr. Yun-pulmón Yu en China, la Universidad de Medicina & amp; hospital) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. lisado de células BT474 (células fueron tratadas con 500 nM de doxorubicina durante la noche) se obtuvo del Dr. Wei-Chien Huang en China, Universidad de Medicina & amp; Hospital. Para el control de carga, las transferencias se sondaron con un anticuerpo anti-EF1-α monoclonal (1:10,000; Millipore). Después de la incubación con un anticuerpo secundario conjugado con HRP (1:5000; GE Healthcare Life Science), se detectaron señales de quimioluminiscencia utilizando un kit ECL Plus y las transferencias se expusieron a Hyperfilm ECL (GE Healthcare Ciencias de Vida). cuantificación banda de proteína se realizó utilizando el software ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/, NIH, Bethesda, EE.UU.).
Medición de especies reactivas del oxígeno
Las células se sembraron en los platos en el 70-80% de confluencia y de hambre durante la noche. Para el análisis de la cuantificación, se tripsinizaron las células, se centrifugaron, y se resuspendieron en HBSS con o sin 5% de FBS (dependiendo de si fueron expuestos a la radiación o de hambre). El peróxido de hidrógeno se detectó utilizando dichlorofluorescindiacetate (DCF, 2 M) (Invitrogen). El superóxido se detectó utilizando dihydroethidium (DHE, 10 M) (Invitrogen). formación de imágenes de superóxido se detectó utilizando MitoSOX indicador superóxido mitocondrial Red (Invitrogen). Las muestras se incubaron durante 40 min a temperatura ambiente en la oscuridad en un rotador. Análisis de DCF y DHE fluorescencia se realizó utilizando un FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA) según las instrucciones del fabricante. Para obtener imágenes de la generación de superóxido mitocondrial, se mueren de inanición células durante 24 horas, seguido de la carga con MitoSOX Red, Alexa-488 WGA y DAPI (Invitrogen) durante 30 min y la visualización bajo un microscopio de fluorescencia.
proliferación de células de ensayo
el efecto de ADAM9 shRNA sobre la proliferación celular se midió contando directamente el número de células. Brevemente, las células se sembraron a una densidad de 1 × 10
5 en la placa de 60 mm. A tiempos designados, se retiraron las células por tripsinización, y el número de células viables se contaron en un hemocitómetro con el uso de azul de tripano (0,4%) de la tinción.
clonogénico Ensayo
Para el ensayo de proliferación celular clonogénico, las suspensiones de células se prepararon mediante el tratamiento con 0,25% de tripsina y 0,05% EDTA. Después de calcular la concentración de células utilizando un hemocitómetro, 100 células se sembraron en placas de 6 pocillos con T-medio y 5% de FBS durante 2 semanas. El número de colonias en cada pocillo se determinó contando el número de células en cada colonia. Sólo colonias con ≥ 50 células se definen como exitosa. Para identificar colonias, el medio se retiró y se añadió 3,7% de formaldehído durante 15 minutos, seguido de incubación en 1 ml de cristal violeta durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se tomaron imágenes de colonias y el número de células calcularon utilizando ImgaeJ.
Transwell invasión Ensayo
La capacidad de invasión de las células cancerosas se evaluó usando placas de 24 pocillos Transwell (Corning, Lowell, MA). En resumen, 2 × 10
5 células en medios que contienen 0,5% de FBS se añadieron a la cámara superior que contiene policarbonato 8 micras de poro recubiertos con 1 mg /ml de Matrigel; la cámara inferior se llena con un medio que contiene 5% de SFB. Después de 16 h de incubación, la superficie superior de la membrana se frotó con un hisopo de algodón. Las células invasoras en la superficie inferior de la membrana se fijaron y se tiñeron con 0,5% de cristal violeta. campos aleatorios (5 por membrana) fueron fotografiadas en un aumento de 40x para calcular el número de células. Además, las células se cuantificaron mediante la medición de la absorbancia de los extractos de colorante a 570 nm en 100 l de solución de Sorenson (9 mg tirsodium citrato, 305 ml de agua destilada, 195 ml de N HCl 0,1, 500 ml 90% de etanol).
Curación de heridas Ensayo
Las células se resuspendieron en medio de cultivo se sembraron en placas de 24 pocillos. Una sola herida fue creado en el centro de la monocapa de células de la eliminación suave de las células unidas con una punta de pipeta de plástico estéril después de cultivos de células alcanzó ≥90% de confluencia. Los restos se eliminó por lavado con medio libre de suero. Las células que migraron en la zona de la herida o aquellos que sobresale del borde de la herida se visualizaron y se fotografiaron con un microscopio Zeiss Axioplan (Carl Zeiss MicroImaging, Thornwood, NY) con un objetivo de 10 × en cinco puntos preseleccionados de tiempo (0, 2, 4 , 6, y 8 h). Cada experimento se realizó de forma independiente por lo menos tres veces.
tinción inmunohistoquímica
Cinco micras secciones de tejido incluidas en parafina de espesor fueron deparaffinized y rehidratada. Las secciones de tejido se incubaron durante 2 horas con anticuerpo anti-ADAM9 humana monoclonal de ratón (dilución 1:50, R & amp; D Systems). Después del lavado para eliminar el anticuerpo primario no unido, las secciones se trataron con una cadena principal de polímero de dextrano conjugado con anticuerpos secundarios y se marcaron con peroxidasa de rábano picante según las instrucciones del fabricante (sistema DAKO Envision para los anticuerpos de ratón y primarios de conejo, DAKO Corporation, Carpinteria, CA) durante 30 minutos . Las secciones de tejido se incubaron en sustrato de peroxidasa cromogénico, diaminobencidina, durante 5 minutos; secciones fueron counterstained con hematoxilina de automatización (DAKO) durante 15 minutos. La especificidad de etiquetado por este procedimiento se verificó mediante reacciones de control negativo usando tampón para sustituir el anticuerpo primario e IgG específico de isotipo. tinción tricrómica de Masson se realizó utilizando el kit de tinción tricrómica de Masson un (Sigma-Aldrich) siguiendo el protocolo estándar proporcionado por el fabricante.
fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRACP) La tinción de Bone
inmunotinción con TRACP se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo del fabricante (Takara Bio Inc, Shiga, Japón). Brevemente, las secciones de hueso de la tibia de ratón embebidos en parafina fueron desparafinados y rehidratados para la reacción Trac Posteolytic. Las secciones de hueso se incubaron con la solución de sustrato (0,1 volumen de tartrato de sodio en naftol-AS-BI-fosfato /solución de sustrato Red Violet LB rápida, pH 5,2) a 37 ° C durante 45 minutos. Después de lavar el portaobjetos con agua destilada y la adición de glicerol para prevenir la deshidratación, las muestras se examinaron bajo el microscopio.
Determinación del contenido de ADN celular por el análisis FACS
Las células cancerosas se sembraron a 1 x 10
6 células por placa de 100 mm y de hambre durante 24 o 48 horas. Las células se tryspinized y se sometieron a análisis del ciclo celular usando yoduro de propidio como se informó anteriormente [18]. El contenido relativo de ADN de los núcleos se midió mediante FACSCalibur (BD Bioscience).
En Vivo
modelos de xenoinjertos
Cinco semanas de edad de sexo masculino desnudos atímicos (nu /nu ratones) obtenidos de National Laboratory Animal Center en Taiwán se utilizaron para la administración subcutánea (sc), intracardíaca, y la implantación del tumor intratibial. Las células se cultivaron a 100% de confluencia, se tripsinizaron y se enumeran. Los ratones fueron sedados con 1,7% de isoflurano mezclado con aire para s.c. la implantación del tumor. tumores de xenoinjertos fueron establecidos por s.c. inyección de 10
6 células PC3 que expresan células pSM2c o shADAM9 en 100 l de PBS en ambos lados de cada ratón. Los animales fueron sacrificados después de 8 semanas. No hubo diferencias significativas entre el peso corporal de los animales con y sin s.c. tumores en el momento del sacrificio. Para la inyección del tumor intratibial, se utilizó una aguja de calibre 27 para perforar un agujero en la cavidad ósea a través de la meseta tibial en ambos lados izquierdo y derecho de la tibia. A 28 de calibre Hamilton jeringa se utiliza para inyectar 5 × 10
5 células en un volumen de 50 l en la cavidad ósea. El crecimiento tumoral se controló por tanto bioluminiscencia y las radiografías una vez por semana. Los animales fueron sacrificados después de 8 semanas. Tibias se retiraron, se lavaron en PBS y se fijaron en formaldehído al 10% a temperatura ambiente durante 24 h. muestras de hueso se lavaron con PBS seguido de descalcificación con 0,25 M EDTA en PBS (pH 7,4) a temperatura ambiente durante 6 semanas. Las soluciones de descalcificación con EDTA se cambian semanalmente. El crecimiento tumoral se controló semanalmente mediante un sistema de imágenes de bioluminiscencia (Xenogen IVIS serie 200, Calibre, Hopkinton, MA).
La extracción de RNA y análisis de microarrays de ADN
El ARN total fue aislado de las células cultivadas (Roche Ciencias Aplicadas, Mannheim, Alemania) siguiendo el protocolo del fabricante. RNA de muestras purificadas se sometieron a Falange Biotech para el análisis de microarrays utilizando el v5 Whole Genoma Humano Microarray OneArray® (falange Biotech Group, Inc., Hsinchu, Taiwán). Cada microarray contiene 29,187 sondas del genoma humano y 1088 sondas de control experimentales. Descripción detallada de los procedimientos de microarrays y su conjunto de genes del genoma & amp; listas de sonda están disponibles de http://www.phalanxbiotech.com/tech_support/general.php.
sobreexpresión de REG4
La longitud REG4 completo región codificante se amplificó por PCR usando los cebadores enumerados en Materiales y Métodos S1, y se subclonó en vectores pcDNA3.1 (Invitrogen) p3XFLAG-CMV-7,1 (Stratagene, Santa Clara, CA) o. Las construcciones REG4 se transfectaron transitoriamente en PC3
shADAM9 utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) siguiendo el protocolo estándar. REG4 sobreexpresa fue confirmada por inmunotransferencia (R & amp; D System). Se recogió REG4 secretada en el medio condicionado y se concentró utilizando Centricon YM-3 filtros de centrífuga (Millipore).
Declaración de Ética
Los estudios con animales se llevaron a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio de los Institutos nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por las directrices INSTITUCIONAL y un Comité de Investigación Animal de la Universidad Médica de China fue seguido por los estudios del ratón (IACUC#99-68-N). Toda la cirugía se realizó bajo Zoletil (tiletamina-zolazepam) a una dosis de 20 mg /kg anestesia mediante inyección intraperitoneal, y de formación de imágenes de bioluminiscencia fue tomada bajo el control de la anestesia Isoflurance. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
Análisis estadístico
Todos los datos de la
in vitro
estudios se presentan como la media ± desviación estándar. Las diferencias entre grupos se analizaron utilizando
prueba t de Student
de dos colas o como se indica en la leyenda de la figura. Un
p valor Red de menos de 0,05 se consideró significativo. En los estudios con ratones, se utilizó la prueba de suma de rangos de Mann-Whitney para el análisis.
Resultados
Desmontables de ADAM9 disminución en la expresión proliferación de células cancerosas de próstata
Para validar el papel de ADAM9 en la progresión del cáncer de próstata, que de forma estable regulados a la baja expresión en ADAM9, células de cáncer de próstata PC3 óseo metastásico andrógeno-independientes y las células de cáncer de próstata LNCaP dependientes de andrógenos con vectores retrovirales o bien lentiviral que llevan shRNA ADAM9-específica. La resultante ADAM9 líneas celulares knockdown PC3
shADAM9 y LNCaP
shADAM9, que mostró un aproximadamente 88% y 76% de reducción, respectivamente, en la expresión de proteínas ADAM9 cuando se compara con cualquiera de vector vacío (pSM2C vector retroviral) o control shRNA (lentiviral- shGFP) (Fig. S2), fueron seleccionados para el siguiente estudio. Un ensayo de proliferación celular a corto plazo de 3 días indicó que tanto PC3
shADAM9 (Fig. 1a) y LNCaP
shADAM9 (Fig. 1b) de las células mostraron una disminución significativa en la proliferación celular. Este retraso en el crecimiento de las células desmontables ADAM9 fue confirmado por ensayos por clonación en el que se observó una reducción del 40-50% en
células PC3 shADAM9 después de 2 semanas de cultivo celular (Fig. 1c y 1d).
la proliferación celular se redujo a partir de 2 días después de la siembra (1 × 10
4 células /pocillo) de ADAM9-desmontables PC3 (a) y LNCaP (b) (* t de Student,
p
≤0.05) . (C) clonogénicos ensayos de proliferación celular de PC3, PC3
shGFP, PC3
pLKO y PC3
shADAM9-46978 revelado disminuyeron colonias en PC3
shADAM9-46978. análisis de los estudios clonogénico (d) Quatitative demostró que el número de colonias de células fue menor en caída lentiviral de expresión ADAM9 en comparación con el de tipo salvaje, infectados de forma simulada, y los controles no objetivo (** t de Student,
p
≤0.001).
para evaluar la diferencia de crecimiento entre las células cancerosas ADAM9 con dominio y ADAM9 deficientes en la médula, el sitio metastásico primario para el cáncer de próstata, la luciferasa de etiquetado PC3
y shGFP PC3
shADAM9 se inyectaron intratibialmente en el mismo ratón desnudo pero en diferentes piernas (Fig. 2a, n = 10). Los datos de imágenes bioluminiscentes colectivos mostraron que la incidencia de PC3
shGFP el desarrollo de tumores fue del 80%, y los tumores fueron detectables a los 15 días después de la inyección. En contraste, sólo el 10% de los ratones inyectados con PC3 tibias
shADAM9 tenía el crecimiento del tumor detectable. La intensidad de la bioluminiscencia fue de aproximadamente un log menor que la mayor parte del PC3
shGFP tumores a los 40 días después de la inyección (Fig. 2b). Un resultado similar se obtuvo también con xenoinjertos subcutáneos (Fig. S3), lo que indica un papel importante de ADAM9 en la proliferación de células de cáncer de próstata y el crecimiento tumoral.
(a) PC3
shGFP y PC3
shADAM9 se inyectaron en la tibia izquierda y derecha de la misma de ratón (n = 10). (B) Imágenes de bioluminiscencia a los 40 días después de la inoculación. Las flechas negras muestran la única señal detectada en un
lesión ósea shADAM9 PC3. (C) la exploración radiográfica computarizada de área de la lesión. Imagen superior: La destrucción ósea es extensa en la pierna izquierda que en la pierna derecha; Imagen inferior: ratón con una lesión ósea destructiva en la pierna izquierda y ninguna lesión en la pierna derecha. (D) la imagen histológica que muestra que tanto trabecular y cortical fue reemplazado por el PC3
tumor shGFP. Por el contrario, el hueso trabecular y cortical estaba intacta en el PC3
tumor shADAM9 (H & amp; E). tinción con tricrómico de Masson indicó sólo trazas de los huesos que quedan en PC3
shGFP comparación con PC3
tumores shADAM9 (tricrómico). (E) análisis TRACP de actividad de los osteoclastos. La flecha indica osteoclastos observados en un PC3
shGFP tumor. detalle en color rojo indica loci de 40 × ampliada.
ADAM9 Disminución de silenciamiento génico in vivo osteolíticas del hueso lesiones causadas por tumores en ratones PC3 Hoteles en
Dado que, se sabe que las células PC3 para inducir lesiones osteolíticas
in vivo
, determinamos si desmontables expresión ADAM9 podría atenuar la resorción ósea inducida por el tumor. Computarizada de exploración radiográfica de las patas afectadas reveló defectos óseos osteolítica graves en la tibia izquierda (inyectados con PC3
shGFP), mientras que la masa parecía normal en la tibia derecha (inyectados con PC3
shADAM9) (Fig. 2c). tinción de Tricrómico de Masson de pierna izquierda confirmó que tanto trabecular y cortical ósea en la metáfisis tibial proximal había sido destruido, y la cavidad de la médula había sido sustituido por tumores. Por el contrario, los trabeculares y corticales huesos se mantuvo intacta en PC3
inyectado-shADAM9 tibia derecha y, a excepción de un incidente en el que las señales de bioluminiscencia débiles tenían tumores relativamente pequeños en el espacio medular con la destrucción ósea leve (Fig. 2d). Además, el número y el alcance de los osteoclastos maduros en la interfase hueso-tumor de PC3
tibias inyectados con shGFP eran mucho más altos que los de PC3
tibias inyectados con shADAM9, según lo determinado por la fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRACP) tinción (
p Hotel & lt; 0,01). (Fig. 2e), lo que indica que el silenciamiento de la expresión de ADAM9 reduce la capacidad de las células de cáncer de próstata para inducir la osteoclastogénesis en el hueso
Orientación de expresión ADAM9 por intratumoral Entrega de shRNA Suprime próstata el crecimiento del cáncer en ratones
para examinar si la inhibición mediada por shRNA de expresión ADAM9 representa una estrategia prometedora para terapia génica del cáncer de próstata, las células PC3 se inocularon por vía subcutánea en ambos flancos de ratones desnudos. Los tumores se dejaron crecer a un tamaño de aproximadamente 200 mm
3. Diez de los quince ratones que tenían se seleccionaron tumores PC3 en ambos flancos de recibir la inyección intra-tumoral de 1 × 10
5 lentiviral vectores ufc (LV) que lleva shGFP (flanco sitio de la izquierda) o shADAM9 (sitio flanco derecho) semanales para un total de 6 semanas (Fig. 3a), y los 5 ratones restantes sirvieron como controles recibiendo inyecciones de PBS. Disminución del crecimiento del tumor de próstata se observó en los tumores tratados con LV-shADAM9 en comparación con los tratados con LV-shGFP o PBS (Fig. 3b). El tamaño medio de los tumores después de 6 semanas de tratamiento con PBS o LV-shGFP fue 782.7 ± 174.6 mm
3 y 1027 ± 272,2 mm
3, respectivamente. Por el contrario, el tamaño de los tumores tratados con la terapia de LV-shADAM9 fue 135,9 ± 72,4 mm
3. El nivel de expresión ADAM9 se redujo en los tumores tratados con la terapia LV-shADAM9, como se confirma por tanto la tinción de tejidos (Fig S4d-f.) E inmunotransferencia (figura 3c;.
p
≤0.05).
(a) Esquema del experimento de terapia ADAM9 caída. Los ratones fueron inyectados por vía subcutánea con células PC3 en ambos flancos, y el tamaño del tumor se midió dos veces a la semana hasta que el tamaño alcanzó aproximadamente 200 mm
3. Los ratones recibieron a continuación inyecciones de PBS en ambos sitios de tumor (n = 5) o shGFP lentivirus en el tumor del lado izquierdo y shADAM9 en el lado derecho (n = 10). Los virus fueron inyectados y los tumores midieron semanalmente durante 6 semanas consecutivas. (B) Después de la terapia shADAM9, los volúmenes tumorales no aumentó en comparación con la terapia shGFP o los controles de PBS (**
p
≤0.01,
t de Student
). (C) Ensayo de inmunotransferencia de expresión ADAM9 confirma disminución de la expresión ADAM9 después de la terapia shADAM9. EF-1α se utilizó como control de carga (*
p
≤0.05; **
p
≤0.01,
t de Student
). (D) Análisis estadístico de tinción Ki67. terapia shADAM9 disminuyó significativamente las actividades de proliferación celular en tumores PC3. PBS y terapia shGFP no mostraron diferencias en el índice de proliferación (**
p
≤0.001, one way ANOVA). (E) El análisis estadístico de la tinción de TUNEL mostró ninguna diferencia significativa (NS) entre tratamientos (
p
≥0.05, one way ANOVA).
Para determinar las respuestas celulares asociadas con LV terapia -shADAM9, la proliferación tumoral (índice Ki-67, Fig. S4G-i) y el marcador de apoptosis tinción (índice de TUNEL, la Fig. S4J-l) de secciones de tumores se llevaron a cabo. No se encontró una diferencia significativa entre el número de células apoptóticas en los controles y LV-shADAM9 (Fig. 3e y la Fig. S4J-l). En contraste, el tratamiento con LV-shADAM9 resultó en una disminución dramática en el número de células Ki-67-positivas en comparación con ambos tratamientos LV-shGFP PBS y (Fig. 3d y la Fig. S4G-i). Estos datos demostraron que
in vivo
entrega de LV-shADAM9 una regresión de manera eficaz el crecimiento de tumores mediante la inhibición de la proliferación celular en lugar de la inducción de la muerte celular apoptótica.
Desmontables ADAM9 induce la detención del ciclo celular en la transición G1 /S transición bajo condiciones de estrés
Para definir con mayor precisión el mecanismo de inhibición del crecimiento tumoral inducida por el tratamiento LV-shADAM9, la distribución del ciclo celular entre PC3 ADAM9-competente
shGFP y PC3 ADAM9 deficientes
células shADAM9 cultivan en condiciones suplementado con suero (5% de FBS) de suero de inanición o se analizaron. Mientras PC3
shGFP y PC3
shADAM9, en condiciones normales, no mostraron un cambio en los perfiles del ciclo celular, la población de la fase S se redujo significativamente con el tiempo (de 24 a 48 horas) en PC3 suero de hambre
células shADAM9 en comparación con la de PC3
shGFP. Esta reducción fue acompañado por el aumento del porcentaje de células en la fase G1 (Fig. 4a). Un resultado similar se obtuvo mediante el uso de células LNCaP (Fig. 4b). Por otra parte, los estudios de inmunotransferencia G1 /S proteínas relacionadas con la transición revelaron un nivel significativamente más alto de p21
Cip1 /WAF1. Además, se indujo un nivel más bajo de la ciclina D1 en PC3
shADAM9 que en PC3
shGFP bajo condiciones de inanición de suero (Fig. 4C). A pesar de que la privación de suero no causó ningún otro cambio en el nivel de expresión de p27
Kip1 en cualquiera PC3
shADAM9 o PC3
shGFP, el nivel basal de p27
Kip1 fue mayor en PC3
shADAM9 . Tomados en conjunto, estos resultados indican que la exposición de PC3
shADAM9 a privación de suero provoca una detención del ciclo celular G1. El aumento de expresión de p21
p27 Cip1 /WAF1and
Kip1 también se detectaron en LNCaP
shADAM9 en condiciones normales de cultivo (Fig. 4d).
El hambre reduce la población de células en fase S en ADAM9 células de cáncer de desmontables en comparación con la de los controles en PC3 (a), LNCaP (b). (C) Los niveles de expresión de p21
Cip1 /WAF1, p27
Kip1 y ciclina D1 aumenta en las células shADAM9 bajo condiciones de estrés de hambre en las células PC3. (D) Los niveles de expresión de p21
Cip1 /WAF1 y p27
Kip1 aumentó en LNCaP
shADAM9, tanto en condiciones normales y de hambre.
Debido a nuestra anterior conclusión de que es ADAM9 una proteína de respuesta al estrés que pueden apoyar la supervivencia de células de cáncer de próstata y la progresión bajo intensas condiciones de estrés oxidativo [13], [19], hemos tratado de determinar si la privación de suero, un
in vitro condición de Windows que imita el tumor hostil microambiente [16], [19], puede inducir estrés oxidativo intracelular en el que las células deficientes en ADAM9 no pudieron superar. Se detectó un aumento en los niveles de superóxido endógenas tanto en PC3
shGFP y PC3
células shADAM9 después de 24 horas de privación de suero en comparación con las células cultivadas en condiciones de suero suplementado como se mide por imágenes de células vivas con una sonda fluorescente roja MitoSOX ( Fig. 5a), así como la citometría de flujo con el tinte fluorescente, dihydroethidium (DHE) (Fig. 5b). Notablemente, PC3
shADAM9 exhibió significativamente mayor contenido de superóxido de PC3
shGFP, ya sea en el nivel basal o inducida por la privación de suero. En contraste, no hay cambios en el nivel de peróxido de hidrógeno intracelular se encontraron en cualquiera de PC3
shGFP o PC3
células shADAM9, como se ensayó por citometría de flujo con sondas DCFH-DA (Fig. 5c). Estos datos demuestran que el suero inanición inducida por el estrés oxidativo en células de cáncer de próstata está mediada, al menos en parte, a través de superóxido, pero no el peróxido de hidrógeno, un resultado similar a nuestra observación anterior que implica ionizantes especies de oxígeno reactivo inducidas por la radiación (ROS) generación [16 ].
(a)
células PC3 shADAM9
shGFP y PC3 se cultivaron en ya sea 5% de FBS o bajo la privación de suero durante 24 horas, seguido de tratamiento con 0,5 M de fluorescencia MitoSOX. Igual intensidad de la fluorescencia se utilizó en cada captura de imagen para la cuantificación de los niveles de superóxido. H & amp;