Extracto
Los estudios emergentes han indicado que los microARNs están involucrados en el desarrollo y progresión del cáncer. Aquí encontramos que el miR-202-3p era frecuentemente el regulado en los tejidos de cáncer gástrico. La sobreexpresión de miR-202-3p en las células de cáncer gástrico MKN-28 y BGC-823, la proliferación celular y la apoptosis notablemente reprimida celular inducida tanto
in vitro
y
in vivo
. Además, la expresión Gli1 era frecuentemente positivos en los tejidos de cáncer gástrico e inversamente correlacionada con la expresión de miR-133b. Se demuestra que el factor transcripcional Gli1 era un objetivo de miR-202-3p y desempeña un papel esencial como mediador de los efectos biológicos de miR-202-3p en el cáncer gástrico. MIR-202-3p también inhibió la expresión de γ-catenina y BCL-2. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que el miR-202-3p puede funcionar como una novela supresor tumoral en el cáncer gástrico y su actividad antitumoral puede atribuir los ataques directos e inhibición de Gli1
Visto:. Zhao Y, Li C, Wang M, Su L, Qu Y, Li J, et al. (2013) disminución de la expresión de miR-202-3p, un supresor tumoral novela, en el cáncer gástrico. PLoS ONE 8 (7): e69756. doi: 10.1371 /journal.pone.0069756
Editor: William C. S. Cho, Hospital Queen Elizabeth, Hong Kong
Recibido: 28 Febrero, 2013; Aceptado: June 11, 2013; Publicado: July 25, 2013
Derechos de Autor © 2013 Zhao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nos. 81072012, 81101847, 81172324, 91229106 y 81272749), Comisión de Ciencia y Tecnología de la municipalidad de Shanghai (núms. 10jc1411100, 11jc1407602, 09DZ1950100, 09DZ2260200, 12XD1403700 y 12PJ1406300), Key Projects en el Programa de Pilar Nacional de Ciencia y Tecnología de China (Nº 2011BA203191), Fondo de Investigación del Programa de Doctorado de Educación Superior de China (Nº 20110073110071), Proyecto clave del Comité de Educación de Shanghai (Nos. 12ZZ102, 12ZZ105) y la Fundación para la Innovación Los graduados de doctorado de Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (BXJ201213). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico (CG) es una de las neoplasias más común y la segunda causa más común de muerte por cáncer en todo el mundo relacionadas con [1]. A pesar de los avances en el tratamiento, la tasa de supervivencia de los pacientes con GC es decepcionante, esto se debe principalmente a la escasez de dianas terapéuticas específicas. Por lo tanto, es crucial para identificar los mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo de cáncer gástrico
.
Los microARN (miRNA) son una clase de pequeños (18-25 nucleótidos), no codificante, ARN endógenos de cadena sencilla. Suprimen expresión de la proteína mediante la interacción con secuencias complementarias perfecta o imperfecta localizados en las regiones 3 'no traducida (3'UTRs) de genes diana. Los estudios en los últimos años han demostrado que miRNAs dysregulated juegan papeles importantes en varios tipos de cáncer [1] - [4], incluyendo GC [5] - [13]. Los datos del estudio de miRNAs y sus genes diana pueden ofrecer interesantes oportunidades terapéuticas [3].
Recientemente hemos identificado varios miRNAs desregulados en GC, como la regulación a la baja de miR-126 [14], el miR-409-3p [15], el miR-625 [16], y la regulación al alza de miR-21 [17], el miR-301 [18]. Aunque muchos miRNAs se han identificado asociaban con GC, el mecanismo de estos miRNAs en la tumorigénesis gástrica todavía tiene que ser investigado. En nuestro trabajo anterior, se identificaron numerosos miRNAs putativo que mostraron expresión diferencial entre los tejidos GC y sus tejidos no tumorales adyacentes de 28 pacientes [19]. Entre ellos, miR-202-3p fue uno de los miRNAs más significativamente disminuido. Sin embargo, el papel de miR-202-3p en GC casi nunca se investigan.
miR-202-3p, previa llamada hsa-miR-202, que se encuentra dentro de un sitio frágil cromosómica en 10q26. La deleción del sitio frágil se ha asociado con [20], tumores endometriales cerebro [21], [22]. MiR-202 se ha informado de que se desregulado en el cáncer de mama [23], [24], cervical de células escamosas [25], el cáncer colorrectal [26] y el linfoma folicular [27]. Petrocca et al. encontró que el miR-202 se había reducido regulado en la gastritis crónica [28]. MiR-202 se ha demostrado que las reguladas por 4-hydroxynoneal (HNE) en células HL-60 de leucemia [29]. Un reciente estudio también mostró que el miR-202 se dirige directamente a MYCN proto-oncogén, lo que resulta en la inhibición de la proliferación de células de neuroblastoma [30].
A continuación, se demuestra una disminución general en el nivel de expresión de miR-202-3p en 150 tejidos GC comparados con los tejidos no tumorales y encuentran que los niveles de miR-202-3p están asociados con el tamaño del tumor y la edad del paciente. Además, hemos descubierto, por primera vez, que el miR-202-3p podría inhibir el crecimiento e inducir la apoptosis de las células GC tanto
in vitro
y
in vivo
apuntando directamente el factor de transcripción Gli1 y la inhibición de la expresión de genes diana Gli1 γ-catenina y BCL-2.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los participantes. El estudio fue aprobado por el Comité de Investigación Humana de Ética del Hospital Ruijin, Facultad de Medicina, Universidad de Shanghai Jiao Tong (HREC 08-028), el Comité de Animales de Laboratorio de Ética del Hospital Ruijin (LAEC 11-062). los procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con un protocolo aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) en Shanghai Jiao Tong University de Shanghai, China.
Cell Cultura y
líneas celulares GC humano SGC -7901 y BGC-823 se adquirieron de Shanghai Institutos de Ciencias Biológicas, la Academia china de Ciencias (Shanghai, china). líneas de células MKN-45 y MKN-28 se obtuvieron de la Investigación del Cáncer del Banco de Recursos japonesa (Tokio, Japón). NCI-N87, AGS, KATO III y SNU-1 líneas celulares fueron comprados originalmente de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.). línea celular de riñón embrionario humano 293T (HEK-293T) se conserva en nuestro instituto. Las células se almacenan, se recuperó de la criopreservación en nitrógeno líquido y se utiliza en los primeros pasajes. Todas las células se mantuvieron en medio RPMI-1640 más 10% de suero bovino fetal (FBS) y se cultivaron en 5% de CO2 atmósfera humidificada. Exponencialmente se utilizaron células de crecimiento para los experimentos.
tejidos del paciente
GC tejidos primarios y tejidos no tumorales emparejados se obtuvieron de 150 pacientes con cáncer gástrico sometidos a gastrectomía radical en el Departamento de Cirugía, Hospital Ruijin, Escuela de Medicina de la Universidad de Shanghai Jiao Tong. Las muestras se congelaron inmediatamente después de la cirugía. Todas las muestras fueron confirmadas por el examen patológico independiente. Ninguno de los pacientes recibió tratamiento preoperatorio. Para todos los pacientes, la información clínico-patológica estaba disponible. clasificación de los tumores de acuerdo con la Unión Internacional Contra el Cáncer (2009).
El aislamiento de ARN y cuantitativa en tiempo real PCR (QRT-PCR)
ARN total fue extraído a partir de líneas celulares y muestras de tejido utilizando Trizol reactivo (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Las concentraciones y pureza de las muestras de ARN se midieron por electroforesis y métodos espectrofotométricos. Los niveles de expresión de miR-202-3p y U6 pequeños ARN nucleares (RNU6B) se analizaron por triplicado por el método de tallo-bucle RT-PCR utilizando la horquilla-it ™ miRNAs qPCR cuantificación Kit (GenePharma, Shanghai, China) con cebadores específicos formiR-202-3p y U6 pequeños ARN nucleares (RNU6B). miARN expresión relativa de miR-202-3p se normalizó en contra del control endógeno, U6, utilizando el método DDCT. Los niveles de ARNm de GAPDH Gli1 y se midieron por triplicado utilizando el SYBR Green PCR en tiempo real (Applied Biosystems, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. La cuantificación se realizó mediante el método de cuantificación relativa DDCT con GAPDH humano como un control interno. Se utilizaron los siguientes cebadores: Gli1 (sentido: 5'-GGA AGT CAT ACT CAC CCG TCG A-3 '; antisentido: 5'-CAT TGC TGA AGG CTT TAC TGC A-3') [31] y GAPDH (sentido: 5'-GGA GAC AAC CTG TCT CCG AG-3 '; antisentido: 5' GTA GCC GCC GAT CAG CTT GA-3 '.)
transfección transitoria de los genes miARN Imita
MIR 202-3p imita oligonucleótidos (ARN de doble cadena) y mimics1 de control negativo (NC) (sentido: 5'-NVND UCC GAA UGE GUC ACG UTT-3 ', antisentido: 5'-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3') fueron adquiridos de GenePharma (Shanghai, china). Las células se sembraron en placas de 6 pocillos el día antes de la transfección para asegurar 40% de confluencia de células en el momento de la transfección. La transfección de imita miARN en las células se llevó a cabo con Lipofectamine 2000 ™ (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.), según el procedimiento del fabricante. Los imitadores miARN se utilizaron a una concentración final de 100 nM.
Ensayo de proliferación celular
A las 24 h post-transfección con imita miARN, las células (2 x 10
3 células /pocillo ) fueron sembradas en placas de 96 pocillos y se incubaron durante 72 horas. La proliferación celular se evaluó por triplicado por la sal de tetrazolio soluble en agua de ensayo (WST) usando el Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japón) y mide siguiendo las instrucciones del fabricante.
de colonias en agar suave Formación Ensayo
imita MiRNA células transfectadas se resuspendieron con 0,3% de agarosa blanda (A9045, baja temperatura de gelificación, Sigma-Aldrich, EE.UU.) en medio RPMI 1640 que contiene 10% de FBS y estratificó sobre 0,4% solidificó agar en medio RPMI 1640 que contiene 10% de FBS en placas de 6 pocillos (1 x 10
3 células /pocillo) a las 24 h después de la transfección. Las placas se incubaron durante 2 semanas. Se contaron las colonias que contienen al menos 50 células.
Análisis de Apoptosis
Un día antes de la transfección con imita miARN, 1 × 10
6 células fueron sembradas en placas de 6 pocillos. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se recogieron las células y se tiñeron con PI AnnexinV /kit de doble tinción (BD biociencias, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se evaluaron las células apoptóticas por triplicado y se repitieron tres veces de forma independiente por citometría de flujo en un FACScan (Beckman Instruments, Fullerton, CA, EE.UU.).
retroviral La transfección de líneas celulares estables
región genómica que incluye transcrito primario de miR-202-3p se clonó en el sitio EcoRI-XhoI del vector retroviral pMSCV-GW-RFA-PGK-EGFP modificado. vectores de control negativo no tenían inserción. Las células HEK 293T (1 × 10
6 /pocillo) se sembraron en placas de 6 pocillos el día antes de la transfección. Ten ug de construcción retroviral que contiene o bien miR-202-3p o ninguna inserción, 2 ug de gag /pol y 2 ug de VSVG se co-transfectaron en células HEK 293T utilizando Lipofectamine reactivo ™ 2000 y Opti-MEM I redujo medio de suero en cada plato. Los virus se cosecharon a las 48 h y 72 h después de la transfección por medio de recogida viral (RPMI-1640 con 10% de FBS inactivado por calor + 1% de glutamina Hepes 20 mM). Las infecciones de MKN-28 células se llevaron a cabo en presencia de 8 mg /ml de polibreno en cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Las células se infectaron centrifugado a 1500 rpm durante 30 min a temperatura ambiente. sobrenadante que contiene el virus se retiró después de 2 h. Se seleccionaron las células positivas para la expresión de GFP mediante FACS-clasificación y el nombre de RV-miR-202-3p y miR-control de RV, respectivamente. la expresión de miR-202-3p fue confirmada por QRT-PCR.
crecimiento tumoral en ratones desnudos
/c nu /nu ratones macho BALB, a la edad de seis semanas (Instituto de Zoología de la Academia China de Ciencias), fueron alojados en un entorno libre de patógenos específicos en la Unidad de Animales de Laboratorio, Facultad de Medicina, Universidad de Shanghai Jiao Tong, china. Los ratones recibieron cuidado humano y los protocolos de los estudios se llevaron a cabo de acuerdo con un protocolo aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) en Shanghai Jiao Tong University de Shanghai, China. Las células (100 l, 2 × 10
6 células) de las líneas transfectadas estables RV-miR-202-3p o-miR-control de RV se recogieron y se inocularon por vía subcutánea en ratones. Seis ratones se usaron para cada grupo. Los ratones fueron controlados semanalmente, y nódulos tumorales se midieron con un calibrador. El volumen del tumor (V) se estimó usando la ecuación V = 4 /3π × L /2 x (W /2)
2, donde L es la longitud eje medio, y W es el eje medio width.The las células tumorales se les permitió el crecimiento de 5 semanas y las curvas de crecimiento del tumor y se calcularon las tasas de inhibidores. Después se sacrificaron los ratones, todos los injertos tumorales se extirparon, se pesaron, se recogieron, se fijaron, y embebidos. Cada experimento se realizó dos veces.
Análisis TUNEL
El ensayo de fin de etiquetado nick transferasa mediada nucleotidyl terminal (TUNEL) se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante del kit colorimétrico DeadEnd TUNEL System ™ (Promega, ESTADOS UNIDOS). Los tejidos se fijaron en formalina al 10% neutralizada y embebidos en bloques de parafina. Secciones (4 m) A continuación se prepararon para su examen. Después de la desparafinación, las secciones se trataron con 20 g /ml de proteinasa K durante 10 min, con 0,3% H
2O
2 en metanol durante 10 min y 0,1% en 0,1% de citrato de sodio Triton-100 X para 2 min sobre hielo. A continuación, las secciones se incubaron con la mezcla de reacción TUNEL durante 60 minutos a 37 ° C. Además de la incubación con anticuerpo conjugado con peroxidasa se realizó durante 30 min a 37 ° C. Las secciones se tiñeron con una solución de diaminobenzidina durante 10 minutos a temperatura ambiente y después de contraste con hematoxilina.
La inmunohistoquímica
Secciones (6 mm de espesor) de tumor fijado en formol e incluido en parafina specimenswere deparaffinized xileno y se rehidrataron en alcohol graduado. peroxidasa endógena fue bloqueada usando 3% de H
2O
2 durante 10 minutos. Tras la recuperación de antígenos en tampón de citrato (pH 6,0), las secciones de tejido se incubaron con suero de cabra normal para bloquear la unión no específica de anticuerpos (20 min a temperatura ambiente). Las secciones fueron incubadas con anticuerpos Gli1 (1:50, sc-20687, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) a 37 ° C en humidchambers de 2 h. Después de lavar con PBS tres veces, las secciones se incubaron con IgG anti-conejo conjugado con peroxidasa durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, los portaobjetos se enjuagaron con PBS y se incubaron durante 5 min con el sustrato DAB durante menos de 30 min. Hematoxilina se utilizó para la tinción de contraste.
Construcción de los plásmidos y Ensayo de la actividad de luciferasa
Una longitud total de 203 pb de la de tipo salvaje (WT) o mutante Gli1-3'UTR Gli1-3 ' UTR (mut) que contiene el supuesto sitio de unión de miR-202-3p se sintetizó (Sangon, Shanghai, china). Después de la digestión por SpeI y HindIII, los fragmentos de tipo salvaje y mutante Gli1-3'UTR fueron clonados en los sitios SpeI y HindIII del PMIR-Informe del vector de luciferasa (Applied Biosystems) y se nombran PMIR /Gli1 y PMIR /Gli1 /mut, respectivamente. La secuenciación del ADN se utilizó para verificar las construcciones.
Las células HEK-293T se sembraron en placas de 24 pocillos 24 h antes de la realización del ensayo. En cada pocillo, 100 ng PMIR /Gli1 o PMIR /Gli1 /mut, 2 ng PRL-TK (Promega, Madison, WI, EE.UU.) que contiene luciferasa de Renilla y 100 imita nM miARN se cotransfectaron utilizando Lipofectamine reactivo ™ 2000 y Opti-MEMI reducida medio suero. la actividad de luciferasa relativa se calculó 48 h después de la co-transfección utilizando el ensayo de luciferasa Dual-Glo (Promega, EE.UU.) de acuerdo con el procedimiento del fabricante. la actividad de la luciferasa de luciérnaga se normalizó a la actividad de luciferasa de Renilla.
Análisis de Western Blot
Las células del tumor y se lisaron mediante M-PER reactivos y detener los kits de cóctel inhibidor de la proteasa (Pierce, EE.UU.). La concentración de proteína de los lisados de células se cuantificó mediante un BCA Protein Assay Kit (Pierce, EE.UU.). La proteína se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS y se transfirieron sobre membranas de 0,22 micras de difluoruro de polivinilideno (Millipore, MA, EE.UU.). Se utilizaron los siguientes anticuerpos específicos: Gli1 (1:1000, Señalización Celular Tecnología), γ-catenina (1:2000, BD Biosciences, EE.UU.), BCL-2 (1:2000, EPITMICS, EE.UU.), y GAPDH (1: 20000, Abcam, UK). Los niveles de proteína se normalizaron a GAPDH total de
Construcción de Expresión Gli1 plásmido y transfección
Al amplificar ADNc de MKN-28 utilizando los siguientes cebadores:. sentido (5'-AGT TGA ACA TGG GAT ATC AT-3 ') y antisentido (5'-ATG CGG CCG CTT AGG CAC TA-3'), de longitud completa se obtuvo Gli1, digerido por EcoR V y Not I y se clonó en pcDNA3.1 vector (Invitrogen) y nombrado pcDNA3 0,1-Gli1. La secuenciación del ADN se utilizó para verificar las construcciones.
Las células se sembraron en placas de 6 pocillos el día antes de la transfección para asegurar el 80-90% de confluencia celular en el momento de la transfección. En cada pocillo, las células se transfectaron con 250 pmol de imita o control de miR-202-3p, junto con 4 ug de pcDNA3.1-Gli1 o el vector vacío pcDNA3.1, usando Lipofectamine 2000. ensayo WST se realizó a 24 h después de la transfección, mientras que el análisis de la apoptosis se llevó a cabo a las 48 h después de la transfección.
análisis estadístico
las variables continuas se compararon mediante
t
prueba de Student para variables distribuidas normalmente y Wilcoxon la suma de rangos para las variables distribuidas nonnormally. La relación entre los niveles de expresión de miR-202-3p y parámetros clínico se analizó mediante la prueba de Chi-cuadrado de Pearson. Todos los valores se presentan como medias ± desviaciones estándar. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SPSS 18.0 (IBM, EE.UU.). Un valor de dos colas de
P
. & Lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
La expresión de miR-202-3p disminuye en GC y se correlaciona con clínico-patológico parámetros
las expresiones de miR-202-3p fueron examinados por QRT-PCR en los tejidos tumorales y los tejidos no tumorales de 150 pacientes emparejados GC (fig. 1A). Los resultados muestran que la expresión de miR-202-3p se downregulated significativamente en los tejidos tumorales en comparación con tejidos emparejados no tumorales en el 68% (102/150) de los pacientes GC. (P & lt; 0,001; Fig. 1A, B)
(a) expresión relativa de miR-150 en 202-3p tejidos del paciente GC en comparación con sus tejidos no tumorales adyacentes. QRT-PCR se muestran como valores -ΔΔCT. (B) Las cajas representan el 25 por percentiles 75. Las líneas horizontales representan las medianas. Los bigotes representan los percentiles 10 y 90. ***,
P
. & Lt; 0,001
Para aclarar aún más la correlación entre el nivel de expresión de miR-202-3p y los factores clínico-patológicos en GC humana, los 150 casos eran más analizadas (Tabla 1). Sobre la base de la expresión de miR-202-3p relativa, los 150 casos fueron estratificados en 3 grupos: el miR-202-3p baja expresión (/proporción de tumores no tumoral y lt; 0,66, n = 85), moderada expresión de miR-202-3p (tumor /relación de 0,66 a 1,5 no tumoral, n = 34) y de alta expresión miR-202-3p (/relación no tumoral del tumor & gt; 1,5, n = 31). Los niveles de expresión de miR-202-3p se correlacionaron negativamente con el tamaño del tumor y positivamente correlacionada con la edad en estos pacientes, con el grupo de miR-202-3p baja expresión exhibieron significativamente mayor tamaño del tumor (p = 0,013) y la edad en comparación con el anciano o moderada grupos de expresión altos (p = 0,028). Sin embargo, los niveles de expresión de miR-202-3p no mostraron ninguna relación con el género, la diferenciación, la localización del tumor, invasión local de tumores, metástasis de ganglios linfáticos o el estadio TNM.
inhibe la sobreexpresión de miR-202-3p GC proliferación de células
Dado que miR-202-3p se redujo significativamente en GC, puede funcionar como un supresor de tumores. Por lo tanto, se examinó si la sobreexpresión de miR-202-3p en las células GC afectado el crecimiento celular. líneas MKN-28 y BGC-823 células, cuya expresión de miR-202-3p fueron los más bajos en las ocho líneas celulares ensayadas GC (Fig. 1C), fueron elegidos para los expreiments posteriores. imita el miR-202-3p sintéticas y moléculas imitan control negativo (NC) se transfectaron en MKN-28 y BGC-823 células, respectivamente. La expresión ectópica de miR-202-3p en las células fue confirmada por QRT-PCR.
El ensayo de crecimiento celular WST mostró significativas inhibiciones del crecimiento celular en células MKN-28 transfectadas con el miR-202-3p (fig. 2.A). Resultados similares se observaron en el BGC-823 células (Fig. 2.B). Para caracterizar adicionalmente el efecto miR-202-3p sobre el crecimiento celular, se realizó un ensayo de formación de colonias en agar blando en las células transfectadas. Se encontró que el número de colonias a partir de células MKN-28 transfectadas con los imitadores de miR-202-3p era casi la mitad de los que desde el control y el grupo parental (Fig. 2C). Resultados similares se observaron en el BGC-823 células (Fig. 2.D). Estos resultados demuestran que el miR-202-3p puede suprimir la proliferación celular de las células GC
in vitro
.
La proliferación celular se evaluó mediante el ensayo WST en células MKN-28 (A) y BGC -823 células (B). Las células fueron transfectadas con imita el miR-202-3p o NC a las 24 h después de la transfección se sometieron al ensayo de WST junto con las células parentales. Los resultados son la media de tres experimentos independientes ± S.D. *,
P Hotel & lt; 0,05. El efecto de miR-202-3p sobre la proliferación celular se evaluó mediante el ensayo de formación de colonias en MKN-28 células (C) y células BGC-823 (D). Las células transfectadas con 100 Nm de miR-202-3pmimics o de control fueron sembradas en placas de 6 pocillos junto con las células parentales. El número de colonias se contó el día 14 después de la siembra. fotografías representativas de las colonias se muestran en paneles de la izquierda. la cuantificación de los resultados relevantes se muestra en los gráficos de barras (paneles de la derecha). Los resultados son la media de tres experimentos independientes ± S.D. *,
P
. & Lt; 0,05
La sobreexpresión de miR-202-3p células GC induce la apoptosis
Dado que la inhibición del crecimiento podría debido a la progresión del ciclo celular o bloqueado aumento de la apoptosis, el próximo preformados ensayo de ciclo de división celular y la apoptosis por citometría de flujo. Nuestros datos indican que las tasas de apoptosis tanto en células MKN-28 y BGC-823 transfectadas con imita el miR-202-3p se upregulated significativamente (Fig. 3A, B). Sin embargo, no hubo diferencia significativa en el ciclo celular entre los grupos tratados de manera diferente (datos no muestran). Estos resultados indicaron que la sobreexpresión de miR-202-3p induce la apoptosis en células de GC puede contribuye a las propiedades inhibidoras del crecimiento de miR-202-3p.
(A) Histogramas representativos que muestran apoptosis de las células MKN-28 transfectadas transitoriamente con 100 nm imita el miR-202-3p o células NC y parentales (paneles de la izquierda). El porcentaje de células apoptóticas de tres experimentos independientes ± S.D. se muestran en los gráficos de barras (paneles de la derecha). (B) Histogramas representativos que muestran la apoptosis de BGC-823 células transfectadas transitoriamente con 100 Nm imita el miR-202-3p o células NC y parentales (paneles de la izquierda). El porcentaje de células apoptóticas de tres experimentos independientes ± S.D. se muestran en los gráficos de barras (paneles de la derecha).
La sobreexpresión de miR-202-3p Inhibe tumorigenicidad y aumenta la apoptosis
in vivo
Dado que miR 202-3p inhibe el crecimiento de células de GC e induce la apoptosis
in vitro
, el próximo examinó si miR-202-3p podría suprimir el crecimiento tumoral e inducir la apoptosis
in vivo
. Se obtuvieron células de MKN-28, RV-miR-202-3p (28-MKN células con retrovirus mediada por la expresión estable de miR-202-3p) (28 MKN-células con el vector vacío) o-miR-RV de control tal como se describe en material y Métodos. Las células se inyectaron por vía subcutánea en ratones desnudos. La formación de tumores se controló. El tiempo de latencia tumoral mostró una diferencia significativa entre los ratones inyectados con células RV-miR-NC y células RV-miR-202-3p (Fig. 4A). Es de considerable interés que los tumores derivados de células RV-miR-202-3p crecieron sustancialmente más lentamente que el grupo de control de miR-RV en todo el crecimiento del tumor (Fig. 4B). El peso medio de los tumores resultantes de RV-miR-202-3p fue significativamente menor que los tumores derivados de RV-miR-control (Fig. 4C, D).
(A) La latencia tumoral fue el número de días a la aparición de tumores palpables y los valores se expresan como media ± SD *,
P Hotel & lt; 0,05. (B) Curvas de crecimiento de los tumores se midieron después de la inyección. diámetros de los tumores se midieron cada 7 días. (C) El peso del tumor; los valores se expresan como media ± S. D. *,
P Hotel & lt; 0,05. (D) La fotografía muestra las características representativas de xenoinjertos tumorales 35 días después de la inoculación. (E) (paneles de la izquierda) Imágenes representativas de ensayo de TUNEL de xenoinjertos de tumores de ratones. El porcentaje de células apoptóticas fue contado (paneles de la derecha). Los resultados son la media de tres experimentos independientes ± S.D. *,
P
. & Lt; 0,05
Además, se realizaron ensayos de TUNEL de los tejidos tumorales. Como se muestra en la Fig. 5E, las células RV-miR-202-3p mostró una más de las células tumorales tinción positiva y un índice de apoptosis significativamente mayor que las células-miR-de control de RV (
P
& lt; 0,01). Estos resultados sugieren que la inhibición de miR-202-3p de tumorigenicidad se atribuye al aumento de la apoptosis
in vivo
.
(A) Expresión relativa de miR-202-3p y Gli1 en líneas celulares de ocho GC se llevó a cabo mediante qRT-PCR. Los resultados son medias de tres experimentos independientes ± S.D. (B) Secuencia de la Gli1 3'UTR que muestra el sitio de unión de miR-202-3p y la mutación de la Gli1 3'UTR sitio para crear Gli1-mut vinculante. imita (C) miR-202-3p-regulado por las actividades de luciferasa controladas por los de tipo salvaje Gli1 3'UTR (
P Hotel & lt; 0,01), pero no afectó la actividad de la luciferasa mutante controlado por Gli1 3'UTR. Los resultados son la media de tres independentexperiments ± S.D. (D) ARNm Gli1 en MKN-28 células se analizó mediante qRT-PCR a las 48 h post-transfección con imita el miR-202-3p y Carolina del Norte. (E) un representante imágenes de transferencia Western de la proteína indicada en MKN-28 células (paneles de la izquierda), con la cuantificación correspondiente (panel derecho). Los resultados son la media de tres experimentos independientes ± S.D. *,
P Hotel & lt; 0,05. proteína (F) Gli1 se detectó en las células RV-miR-202-3p de tumor subcutáneo en ratones desnudos (paneles de la izquierda) RV-miR-control o, con cuantificación relevante (panel derecho). Los resultados son la media de tres experimentos independientes ± S.D. *,
P
. & Lt; 0,05
miR-202-3p Directamente Objetivo Gli1
Para comprender el mecanismo subyacente a las propiedades inhibidoras de tumores de miR-202 -3P en GC, se realizaron búsquedas de sus genes diana putativos con posibles funciones pro-oncogénicos utilizando herramientas de búsqueda en línea (RNAhybrid y Miranda algoritmos), y los genes predichos por tanto de las herramientas bioinformáticas fueron elegidos como los genes candidatos objetivo de miR-202 -3P. Entre los cientos de genes candidatos predichos, el activador de la transcripción Gli1 es de particular interés (Figura S1). La estructura secundaria putativa de híbrido de ARN de miR-202-3p humana y Gli1 se muestra en la Figura S2. Gli1 ha informado altamente expresado en GC [32], [33]. Se sugiere que la disminución de la expresión de Gli1 resultó en la inhibición del crecimiento líneas celulares GC y la apoptosis [33].
Otra pista sobre el posible papel de miR-202-3p en la regulación de la expresión Gli1 llegó a partir del análisis de ocho líneas celulares de cáncer gástrico diferentes (MKN-45, SGC-7901, AGS, NCI-N87, SNU-1, KATO III, BGC-823 y MKN-28). El análisis estadístico mostró una expresión significativa entre los patrones invertida miR-202-3p y Gli1 ((r = -0,345,
P Hotel & lt;.. 0,001, Figura 5A)
Para evaluar la relevancia clínica de estos hallazgos, se analizó la correlación entre las expresiones de Gli1 con la expresión de miR-202-3p en los tejidos GC. hemos encontrado que Gli1 y miR-202-3p exhibición inversa patrón de expresión en los tejidos GC (Tabla 2). estos resultados apoyan la premisa de que la regulación a la baja de miR-202-3p aumenta el nivel de gen Gli1 en el cáncer gástrico.
ensayos de reportero luciferasa se realizaron para verificar una interacción directa entre el miR-202-3p y la 3'UTR Gli1. reporteros de luciferasa se construyen contiene ya sea una secuencia de tipo salvaje Gli1 3'UTR que incluye el sitio de unión de miR-202-3p (PMIR /Gli1), o una mutado Gli1 3'UTR (PMIR /Gli1 /mut) (Fig. 5B ). el PMIR /Gli1 y PMIR /Gli1 /luciferasa mut reportero construcciones fueron transfectadas en células HEK-293T, junto con imita miR-202-3p o NC. la actividad de luciferasa relativa del reportero PMIR /Gli1 fue marcadamente suprimida comparada con la de PMIR /Gli1 /mut de manera miR-202-3p-dependiente (Fig. 5C). Este resultado indica claramente que 3'UTR de Gli1 lleva a los sitios de unión directa de miR-202-3p.
Para determinar a nivel de ARNm o el nivel de proteína de miR-202-3p las reguladas Gli1, detectamos expresión Gli1 por QRT-PCR y Western blot. Como se muestra en la Fig. 5E, el nivel de proteína Gli1 se redujo en el miR-202-3p imita transfectadas MKN-28 células en comparación con NC imita-transfectaron células parentales y MKN-28. Mientras tanto, no hubo ningún efecto de miR-202-3p en el nivel Gli1 ARNm (Fig. 5D). Estos resultados sugieren fuertemente que el miR-202-3p regula negativamente la expresión Gli1 a nivel de traducción.
Entre los genes informó de inhibir la apoptosis de GC, γ-catenina (Plakoglobin) y BCL-2 son dianas transcripcionales directas de Gli1 [34], [35]. Como se muestra en la Fig. 5E, los niveles de proteína de γ-catenina y BCL-2 se redujo notablemente en las células MKN-28 transfectadas con imita el miR-202-3p.
Además, hemos examinado la expresión de la proteína Gli1 en los tumores subcutáneos derivados de RV-miR-control y RV-miR-202-3p en ratones desnudos por Western blot. El nivel de proteína en los tumores de Gli1 RV-miR-202-3p demostró regulación a la baja en comparación con la de RV-miR-control (Fig. 5F). Estos resultados sugieren fuertemente que el miR-202-3p regula negativamente la expresión Gli1 post-transcripcionalmente.
La sobreexpresión de Gli1 rescates Efecto de miR-202-3p en células GC
Dado que el miR-202-3p downregulated Gli1 para inhibir la proliferación celular e inducir la apoptosis, se razonó que la sobreexpresión de Gli1 podría revertir este fenómeno al menos en parte. De hecho, cuando Gli1 sobreexpresan plásmido (pcDNA3.1-Gli1) se introdujo en células MKN-28 o BGC-823 transfectadas transitoriamente con imita miR-202-3p, el efecto inhibidor de miR-202-3p sobre el crecimiento celular se invirtió parcialmente, que se observó mediante un ensayo de crecimiento celular WST (Fig. 6A, B). Por otra parte, la progresión hacia la apoptosis también se vio obstaculizada cuando se sobreexpresa en Gli1 MKN-28 o células BGC-823 transfectadas transitoriamente con miR-202-3p imita (Fig. 6C, D) .Estos datos proporcionan evidencia de que la inhibición del crecimiento y la apoptosis celular inducida por miR-202-3p es al menos parcialmente relacionada con su efecto sobre la expresión Gli1.
a transfectadas con vector de expresión Gli1 (pcDNA3.1-Gli1), MKN-28 células (a) y células BGC-823 ( B) fueron rescatados parcialmente a partir de las propiedades de crecimiento de miR-202-3p inhibitoria. Las células fueron transfectadas con el control imita o miR-202-3p, junto con pcDNA3.1-Gli1or pcDNA3.1 vector vacío (pcDNA3.1) a las 24 h después de la transfección se sometieron al ensayo de WST. Los resultados son la media de tres experimentos independientes ± S.D. *,
P Hotel & lt; 0,05. histogramas representativos que representa la apoptosis MKN-28 células (C) y las células BGC-823 (D) transfectadas con imita el miR-202-3p o control, además del pcDNA3.1- Gli1) o pcDNA3.1 por citometría de flujo (paneles de la izquierda). El porcentaje de células apoptóticas de tres experimentos independientes ± S.D. se muestran en los gráficos de barras (paneles de la derecha).
desregulación Discusión
La acumulación de evidencias han demostrado específica de miARN en GC [4], [13], [36].