Extracto
Antecedentes
TGF-β juega un doble papel en la progresión del cáncer humano. Durante las primeras etapas de la carcinogénesis funciones, TGF-beta como un supresor tumoral. Durante las últimas etapas del desarrollo del tumor, sin embargo, el TGF-β puede promover el crecimiento tumoral y la metástasis. Un cambio en Smad2 3 fosforilación /desde el extremo carboxi al enlazador sitios es un evento clave para determinar la función biológica de TGF-β en colorrectal y carcinoma hepatocelular. En el presente estudio, hemos investigado el papel potencial de la diferencia de Smad2 /3 fosforilación en el adenocarcinoma gástrico.
Metodología
La tinción inmunohistoquímica con anticuerpos anti-P-Smad2 /3C y anticuerpos /3L P-Smad2 se realizó en 130 muestras de adenocarcinoma gástrico incluidos en parafina. Se analizó la relación entre P-Smad2 /3C y P-Smad2 /3L puntuación de inmunohistoquímica y las características clínico-patológicas de los pacientes. PCR en tiempo real se usó para medir la expresión de ARNm de Smad2 y Smad3 en el cáncer y el tejido circundante no tumoral.
Principales conclusiones
No significativo P-Smad2L y /o tinción de P-Smad3L positivo fue detectado en la mayoría de los especímenes (tinción positiva en 18/130 muestras). La tinción positiva P-Smad2 /3L no se asoció con una disminución en la tinción de la fosforilación carboxiterminal. La pérdida de P-Smad2C notablemente correlacionada con la profundidad de la infiltración de tumor y la mala diferenciación de las células de cáncer en pacientes con cáncer gástrico. No hay correlación fue detectable entre P-Smad3C y las características clínico-patológicas de adenocarcinoma gástrico. Sin embargo, un análisis de co-tinción reveló que la P-Smad3C co-localizada con α-SMA y colágeno I en células de cáncer gástrico, lo que indica un posible vínculo entre P-Smad3C y epitelio-mesenquimal transición de cáncer. PCR en tiempo real demostró la expresión de ARNm reducida de Smad2 en el cáncer gástrico en comparación con el tejido circundante no tumoral en 15/16 pacientes.
Conclusiones
Pérdida de P-Smad2C fuertemente correlacionada con la invasión del cáncer y pobre diferenciación en el cáncer gástrico. Contrariamente a colorrectal y el carcinoma hepatocelular, la fosforilación carboxiterminal canónica, pero no enlazador fosforilación, de Smad2 es crítica para el cáncer gástrico
Visto:. Wu Y, Li Q, Zhou X, Yu J, Y Mu, Munker S, et al. (2012) disminución de los niveles de activo SMAD2 se correlacionan con un mal pronóstico en cáncer gástrico. PLoS ONE 7 (4): e35684. doi: 10.1371 /journal.pone.0035684
Editor: Javier S. Castresana, Universidad de Navarra, España |
Recibido: 6 Octubre 2011; Aceptado: March 20, 2012; Publicado: 23 Abril 2012
Copyright: © 2012 Wu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio recibió el apoyo de la Oficina de Salud de la provincia de Zhejiang de China, 2009A065 (YJW); Else-Kröner Fresenius (H.L.W., S. D.); BMBF "HepatoSys" 0313082L, "hígado virtual" y "terapia celular" 01GN0987 (S. D.); Deutsche Forschungsgemeinschaft DO373 /6-1, DO 373 /8-1 (S. D.) y LA997 /5-1 (S. D.); y la Dietmar Hopp Stiftung GmbH (S. D.). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico es una causa principal de muerte por cáncer en el mundo, en segundo lugar en los varones y cuarto rango en las hembras en la frecuencia [1]. La patogénesis del cáncer gástrico se asocia a múltiples factores. Entre estos, la desregulación de las vías relacionadas con los procesos de desarrollo, incluyendo factor de crecimiento transformante-β (TGF-β) de señalización, Wnt /β-catenina, hedgehog y la señalización de Notch, desempeña un papel central en el desarrollo y la progresión de este cáncer [2].
La familia TGF-β de moléculas, incluyendo las isoformas de TGF-beta, activinas y proteínas morfogenéticas óseas (BMPs), tiene importantes funciones en diversos procesos fisiológicos y fisiopatológicos, por ejemplo, el desarrollo embrionario, enfermedades autoinmunes, fibrosis y el cáncer [3], [4]. TGF-β transduce sus señales mediante la estimulación de la formación de complejos heteroméricos de tipo TGF-β I (TGF-βRI) y tipo II (TGF-βRII) serina /treonina quinasa de receptores. Activado TGF-βRI propaga la señalización por el reclutamiento y la fosforilación de regulados por el receptor-Smads (R-Smads, incluyendo Smad2 y Smad3). La fosforilación de residuos de serina C-terminal en R-Smads es un paso crucial para la señalización de TGF-β canónica. Los dos más residuos de serina C-terminal en la serina 465/467 en Smad2 y serina 423/425 en Smad3 se fosforilan, junto con un tercer residuo de serina no fosforilada, forman un motivo SSXS conservado evolutivamente en todas las R-Smads [5], [6]. Además de la fosforilación C-terminal de Smad2 /3 (P-Smad2C y P-Smad3C) por el TGF-βRI, otras quinasas, por ejemplo c-Jun N-terminal quinasa (JNK) y quinasas asociadas-Ras, causa la fosforilación de R-Smads en los sitios de engarce alrededor de 249/254 serina en Smad2 y Smad3 en la serina 208/213 (P-Smad2L y P-Smad3L) [7 ], [8]. Fosforilados R-Smads forman un complejo con Smad común (Co-Smad, Smad4 en los mamíferos) y servicio de transporte al interior del núcleo de la transcripción de genes blanco [3]. Además de R-Smad y co-Smad, el tercer tipo de proteínas Smad es inhibidor-Smad (I-Smad; Smad6 y Smad7). I-Smads son inducidos transcripcionalmente por el TGF-β, lo que indica un mecanismo de retroalimentación negativa de esta vía de señalización [4].
TGF-β juega un doble papel en la progresión del cáncer humano [9], [10] . En las primeras etapas de cáncer, TGF-beta actúa como un supresor de tumores mediante la inhibición de la proliferación celular o mediante la promoción de la apoptosis celular. Sin embargo, en las últimas etapas, el TGF-β es compatible con la progresión del tumor, tales como invasión de células tumorales, la difusión y la evasión inmune [9]. Además, el TGF-β es bien reconocida como un mediador de epitelio-a-mesenquimal transición (EMT) en el cáncer [11]. A pesar de las perturbaciones de la señalización de TGF-β /Smad son fundamentales para la carcinogénesis en la mayoría de los órganos, la promoción de tumor resultado es altamente dependiente del contexto. Por ejemplo, la señalización de TGF-β es fundamental en el mantenimiento de la madre de cáncer de células auto-renovación y la actividad tumorigénico en el glioma y leucemia, mientras que los efectos de la señalización de TGF-β en células madre de cáncer de mama son controvertidos [12]. Un estudio demostró que el bloqueo de la vía TGF-β a través de un dominante negativo TGF-βRII aumenta el tamaño del compartimento de células madre de mama y promueve la tumorigénesis, lo que indica una supresión de la carcinogénesis de mama de esta citoquina [13]. Por el contrario, Mani y sus colegas encontraron que la vía de TGF-β nosotros crítico en el mantenimiento de las propiedades de células madre del cáncer de mama y la actividad tumorigénico a través de la inducción de la EMT [14].
En el cáncer gástrico, polimorfismos de un solo nucleótido ( SNPs) de TGF-β están asociados con la susceptibilidad a la etapa I y etapa II del cáncer gástrico [15], [16]. Se informó de los niveles séricos de TGF-β para correlacionar significativamente con invasión venosa en pacientes con cáncer gástrico [17]. Sin embargo, los mecanismos detallados de TGF-β señalización en la progresión del cáncer gástrico son todavía desconocidos. Además, no está claro cuándo y cómo TGF-β se transforma de un supresor de tumores en un promotor tumor durante la carcinogénesis.
Recientemente, un cambio en la fosforilación de Smad2 /3 de C-terminal a los sitios de engarce se demostró como un evento clave para determinar la función biológica de TGF-β en el cáncer [18], [19], [20]. Estudios previos basado en 12 años de seguimiento demostrado que la infección crónica por VHB /pacientes con VHC con P-Smad2 /3L en los tejidos del hígado tenían un mayor riesgo de avanzar con el carcinoma hepatocelular (HCC) que aquellos con P-Smad2 /3C [8], [ ,,,0],21]. Consistente con los hallazgos en el CHC, se hicieron observaciones similares en el cáncer colorrectal [7], [22].
Para examinar la contribución de la fosforilación de Smad diferencial hacia la carcinogénesis en el cáncer gástrico, se investigó P-Smad2 /3C y 3L niveles en 130 pacientes con adenocarcinoma gástrico mediante técnicas de inmunohistoquímica P-Smad2 /(IHC). Se analizaron las posibles correlaciones entre los diferentes sitios de fosforilación de R-Smads y la invasión, metástasis de los ganglios linfáticos, la diferenciación y la etapa del cáncer gástrico.
Resultados
fosforilación Enlazador de Smad2 /3 no está asociado con cáncer gástrico
En contraste con los resultados anteriores de cáncer colorrectal y carcinoma hepatocelular [7], [8], [21], [22], no detectamos significativa P-Smad2L y /o P-Smad3L positivo tinción en los tejidos gástricos de pacientes con cáncer gástrico. Sólo 18 de los 130 pacientes mostraron p-Smad3L tinción positiva principalmente en las células no cancerosas. Estos resultados sugieren que la fosforilación de serina enlazador en los sitios de Smad2 /3 no es crítica en el cáncer gástrico.
Diferentes características de los niveles en el cáncer gástrico P-Smad2C y P-Smad3C
118 de 130 tejidos gástricos mostraron P-Smad2C tinción positiva, y 91 de 130 tejidos gástricos fueron positivas para la tinción de P-Smad3C respectivamente. A diferencia de P-Smad2C tinción positiva, que sólo estaba mostrando en el núcleo de las células normales y cancerosas (Fig. 1A), P-Smad3C tinción positiva se demostró en el núcleo (59/130, Fig. 1B), en la membrana y /o en el citoplasma (73/130, Fig. 1C) de células de cáncer gástrico. Además, P-Smad3C fue visto por la tinción positiva en los fibroblastos que rodea las células cancerosas (81/130 y 91/130, la Fig. 1D).
Los patrones de P-Smad2C (A) y P-Smad3C (B tinción -D) IHC en el cáncer gástrico. tinción nuclear (B) P-Smad3; tinción (C) P-Smad3 /membrana plasmática; (D) P-Smad3 fibroblastos tinción.
Reducción de P-Smad2C correlaciona notablemente con la profundidad del tumor (T) y la diferenciación de cáncer (G) en pacientes con cáncer gástrico
Medimos tinción de P-Smad2C IHC no sólo en el tumor sino también en los tejidos circundantes no tumorales de 130 pacientes con cáncer gástrico. P-Smad2C tinción positiva en las células cancerosas, ya sea o normales inversamente correlacionada con la diferenciación de cáncer gástrico (ambos
p Hotel & lt; 0,0001, Tabla 1). Además, la disminución de la puntuación P-Smad2C IHC en las células cancerosas se correlacionaron con la profundidad del tumor (
p
& lt; 0,05, Tabla 1). los niveles de P-Smad2C en el tejido normal, así mostraron un potencial de correlación inversa con la invasión del cáncer en estos pacientes (
p
= 0,07, Tabla 1). La puntuación P-Smad2C IHC se redujo significativamente en los tejidos de cáncer en comparación con los tejidos no tumorales en 77 de 130 pacientes con cáncer gástrico. Por otra parte, dentro de los tejidos tumorales, las células cancerosas con atipia mal mostraron disminución de la tinción de P-Smad2C, en comparación con los bien diferenciados (Fig. 2). análisis de correlación Kendall-tau reveló una correlación potencial entre la reducción de la tinción de P-Smad2C y la transición de células normales a células cancerosas en el cáncer gástrico (
p
= 0,05, Tabla 2), lo que sugiere que la activación de la señalización de Smad2 es una supresor de crítica de la formación y progresión tumoral.
(a) positividad inmune de P-Smad2C se redujo significativamente en los tejidos de cáncer (
b
) en comparación con los tejidos circundantes normales (
a
) en 77 de 130 pacientes con cáncer gástrico. Representante imágenes fueron tomadas de un paciente con carcinoma de células en anillo de sello. (B) En los tejidos tumorales, las células cancerosas con mala atipia (
e-h
) mostraron una disminución de la tinción de P-Smad2C comparación con aquellos con un fenotipo bien diferenciado (
a-d).
P-Smad3C se encuentra con frecuencia en el cáncer asociado fibroblastos
puntuación P-Smad3C IHC no mostró una correlación significativa con T /N /G /S de las muestras de cáncer gástrico (Tabla 1). Sin embargo, P-Smad3C tinción positiva menudo se produjo en los fibroblastos que rodean las células de cáncer en pacientes con cáncer gástrico (Fig. 1).
Las células cancerosas son de origen epitelial y no expresan marcadores mesenquimales, por ejemplo, a-SMA y el colágeno I. Si las células cancerosas expresan marcadores mesenquimales, es sugerente de epitelio-mesenquimal transición (EMT) [11]. En el presente estudio, encontramos α-SMA tinción positiva en células de cáncer en 54 de 130 pacientes con cáncer gástrico (por ejemplo, el paciente 1 en la Fig. 3). Para aclarar el vínculo potencial entre p-Smad3C y EMT, se investigó la correlación entre la tinción de p-Smad3C (cáncer y el tejido no canceroso que rodea) y tinción de α-SMA positivos en las células cancerosas. Kendall-tau coeficientes de correlación de rango entre las puntuaciones de p-Smad3C IHC en el cáncer /tejidos que rodean las puntuaciones no-cáncer y α-SMA IHC en el cáncer son 0,14 (
p
= 0,08) y -0.09 (
p
= 0,99), respectivamente (Tabla 3). Para confirmar la EMT en estos pacientes, se realizó co-tinción para el caracol, otro marcador específico de la EMT, y colágeno I /α-SMA en los tejidos gástricos. La microscopía confocal reveló co-localización de caracol y colágeno I (Fig. 4A) /α-SMA (Fig. 4B) en algunas células de cáncer gástrico. Estas células de cáncer gástrico positivos α-SMA, ya que bien se muestran P-Smad3C tinción positiva (Fig. 4C). Además de co-localización con células de cáncer gástrico positivos α-SMA, microscopía confocal reveló que P-Smad3C co-localizada con colágeno I en células de cáncer gástrico (Fig. 4D). Además, P-Smad3C tinción positiva co-localizada con α-SMA y colágeno no sólo en las células cancerosas, pero también en fibroblastos (Fig. 4C-4D). Estos resultados sugieren que P-Smad3C puede contribuir a la EMT de cáncer gástrico en algunos pacientes.
imágenes representativos de dos pacientes con cáncer gástrico muestran α-SMA y tinción P-Smad3C en el área del cáncer (tumor) y que rodea no CANCER (tejidos no tumorales).
análisis de microscopía confocal demuestra co-localización de Caracol y colágeno I (a) /α-SMA (B) en un paciente representativo con cáncer gástrico. La misma paciente, además de pantallas co-localización de P-Smad3C y de colágeno I (C) /α-SMA (D) en el cáncer gástrico.
La pérdida de expresión total de Smad2 y Smad3 en pacientes con cáncer gástrico
Además de medir P-Smad2 en el cáncer gástrico, se utilizó PCR en tiempo real para detectar la expresión de ARNm de Smad2 y Smad3 en el cáncer gástrico y los tejidos no tumorales circundantes de 16 pacientes. 15 y 12 pacientes demostraron respectivamente disminución de la expresión de ARNm de Smad2 y Smad3 en tejidos de cáncer, en comparación con los tejidos normales circundantes (Fig. 5). Estos resultados indican que no sólo activa Smad2 sino también la expresión del ARNm del total Smad2 se reduce durante la carcinogénesis gástrica.
PCR en tiempo real se realizó para determinar la expresión de ARNm de Smad2 (A) y Smad3 (B) en 16 tejidos de cáncer gástrico y los tejidos no tumorales circundantes (No. 1-5: cáncer diferenciado media; No. 6-13: cáncer poco diferenciado y No. 14-16: anillo de sello cáncer de células) guía empresas
Discusión
en adenocarcinoma colorrectal y carcinoma hepatocelular, un cambio en la fosforilación de carboxi-terminal al enlazador regiones se ha sugerido como un acontecimiento crítico asociado con el interruptor de TGF-β de un supresor de cáncer a un factor oncogénico [ ,,,0],8], [18], [19], [20], [21], [22]. En el presente estudio, hemos examinado esta asociación potencial en el cáncer gástrico. No se detectó importantes niveles de P-Smad2L y P-Smad3L en 130 pacientes con cáncer gástrico. 112 de los 130 pacientes no mostraron P-Smad2L o P-Smad3L tinción en células de cáncer gástrico, lo que sugiere que el cambio propuesto en la fosforilación de R-Smad puede no contribuir a TGF-β carcinogénesis mediada en este tipo de cáncer. En contraste con P-Smad2 /3L, tanto P-Smad2C y P-Smad3C se detectó tinción positiva en la mayoría de pacientes con cáncer gástrico. análisis de correlación de rangos Kendall-tau reveló que la puntuación P-Smad2C IHC se correlaciona inversamente con la profundidad del tumor (T) y la diferenciación de cáncer (G).
El papel de Smad2 durante la formación y la progresión de diferente tipo de cáncer sigue siendo controvertido . Consistente con el hallazgo actual, los estudios anteriores sobre el carcinoma esofágico de células escamosas, cáncer de mama y cáncer colorrectal demostraron que la pérdida de expresión Smad2 se correlaciona con el desarrollo tumoral y mal pronóstico [23], [24], [25], [26]. Recientemente, pitido y sus colegas encontraron que Smad2, pero no Smad3, con frecuencia se pierde en 83 pacientes con carcinoma de células escamosas de la piel. Además, los ratones con-queratinocitos específico eliminación Smad2 muestran la formación acelerada y progresión maligna de tumores de piel de ratón inducido químicamente en comparación con ratones de tipo salvaje [27]. Sin embargo, en un estudio de 52 pacientes con glioma, se informó de una puntuación positiva P-Smad2 IHC para correlacionar con la proliferación de los gliomas y mal pronóstico [28]. Antes de este estudio, Shinto y sus colegas midieron la tinción de P-Smad2C en 135 pacientes con cáncer gástrico. Ellos encontraron que los niveles de P-Smad2C eran más altas en el cáncer-pobremente diferenciado en comparación con los bien diferenciados [29]. No está claro aún por qué no son completamente opuestas resultados en el cáncer gástrico.
En la señalización de TGF-β canónica, que se activa TGF-βRI generalmente induce la fosforilación carboxi-terminal de Smad2 y Smad3 tanto. Activado Smad2 y Smad3 juegan diferentes papeles en el crecimiento celular, la diferenciación y otras funciones biológicas [30]. En el hígado, Smad2 es fundamental en la mediación de crecimiento de hepatocitos y la diferenciación, mientras que Smad3 juega un efecto clave en la maduración morfológica y funcional de las células estrelladas hepáticas [31], [32]. En el cáncer, es controvertido si la interrupción del gen Smad3 contribuye a la tumorigénesis. Zhu informó que los ratones con deficiencia de Smad3-desarrollan carcinoma de colon [33]. Sin embargo, otros estudios que utilizan ratones deficientes en Smad3 sugieren que la pérdida de Smad3 por sí sola no es suficiente para iniciar la tumorigénesis [34], [35], [36], [37]. En el cáncer gástrico, Han encontrado niveles bajos de Smad3 en 3 de cada 8 pacientes y en nueve líneas celulares de cáncer gástrico humano [38]. Introducción de un vector de Smad3 en líneas celulares gástricas restauró la capacidad de respuesta TGF-β. Además, la inyección de Smad3-expresión de las células gástricas en ratones desnudos mostró retrasó la tumorigénesis, en comparación con los controles, lo que indica una correlación de pérdida de Smad3 con la carcinogénesis [38]. En el presente estudio, no se encontró una correlación significativa entre la tinción de P-Smad3C en células de cáncer gástrico y cáncer de invasión, la diferenciación y el escenario. A diferencia de P-Smad2C, que sólo se expresa en núcleos de las células, P-Smad3C tinción positiva es detectable en el núcleo, en la membrana y en el citoplasma de células de cáncer gástrico. La relevancia biológica de los diferentes patrones de tinción de P-Smad3C en las células cancerosas es actualmente aún se desconoce.
EMT de las células cancerosas es un requisito previo para avanzar a los tumores metastásicos avanzados [11]. Se ha reconocido que el TGF-β es un jugador importante en la EMT. Smad3, pero no Smad2, es un mediador clave en TGF-β EMT dependiente [39]. Por ejemplo, el TGF-β falla para inducir EMT en las células epiteliales tubulares primarios derivados de los riñones de los ratones con deficiencia de Smad3-[40]. La inhibición de TGF-β de señalización por Ki26894, un inhibidor de TGF-βRI, disminución de la invasión y EMT de cáncer gástrico escirro
in vitro
[41]. Nuestros resultados muestran que parte de células de cáncer gástrico expresan marcadores de EMT, por ejemplo Caracol, colágeno I y α-SMA. Co-localización de P-Smad3C con α-SMA /colágeno I se encuentra en un subconjunto importante de pacientes. Además, α-SMA tinción positiva en células de cáncer tiene una correlación potencial con la puntuación de P-Smad3C IHC de las células cancerosas, pero no los tejidos circundantes no cancerosas. Estos resultados indican que la P-Smad3C podría desempeñar un papel en la EMT de cáncer gástrico.
En resumen, el presente estudio sugiere que Smad2 es un mediador importante para defender las células gástricas de progresar hacia el cáncer poco diferenciado. De acuerdo con nuestros resultados, Smad3 no está directamente relacionada con las características de cáncer gástrico, sin embargo, nuestros datos indican que puede desempeñar un papel en los fibroblastos asociados con el cáncer y EMT de células de cáncer gástrico.
Métodos
los pacientes
las muestras quirúrgicas fueron examinados a partir de pacientes con cáncer gástrico primario en el Departamento de Cirugía general, el primer hospital Afiliado, Facultad de Medicina, Universidad de Zhejiang, se recogieron china a partir de 2003 a 2009. muestra de tejido gástrico cuando cirugías disecados el cáncer gástrico. Los tejidos recogidos incluyen tumor y zonas no tumorales circundantes (tejidos al menos más de 5 cm lejos del tumor). Una parte de los tejidos se fijaron con formaldehído al 4% y se incrustó en parafina para la histología y la medición IHC. tejidos frescos permanecido se pusieron en nitrógeno líquido inmediatamente para la medición de ARNm. Se reclutó un total de 130 pares de tejidos gástricos incluyendo cáncer y tejidos no tumorales circundantes. diagnóstico y clasificación patológica se estimaron de acuerdo con la clasificación de tumores-nódulo-metástasis (TNM) propugnado por la Unión Internacional contra el Cáncer (séptima edición) [42]. Características básicas de los pacientes incluidos se muestran en la Tabla 4. El protocolo de estudio se ajusta a las directrices éticas de la Declaración de Helsinki (1975). El estudio fue aprobado por el comité de ética del Hospital Afiliado En primer lugar, la Facultad de Medicina, Universidad de Zhejiang. consentimientos informados escritos se obtuvieron de todos los participantes involucrados en el estudio.
Los anticuerpos
anticuerpos policlonales de conejo contra P-Smad2C (SER 465/467), P-Smad3C (Ser 423 /425), P-Smad2L (Ser 250/255), y P-Smad3L (Ser 208/213) fueron descritos en estudios anteriores [43], [44]. Mouse anti-humano α-SMA (M0851), anticuerpos policlonales anti-CARACOL (ab-17732), y monoclonal anti-colágeno I (C2456) anticuerpos fueron adquiridos de DAKO, Abcam y Sigma, respectivamente.
inmunohistoquímica (IHC )
Después de revisar los H & amp; E-manchado diapositivas de 130 pacientes inscritos con cáncer gástrico, se seleccionaron los bloques de parafina representativos de cada paciente para la sección. Las diapositivas se deparaffinised en xileno y rehidratada en una serie de diluciones de etanol clasificado a agua destilada. La recuperación del antígeno se llevó a cabo por tratamiento con microondas en tampón de EDTA (1 mmol, pH 8,0). Los portaobjetos se trataron entonces con 3% de H
2O
2 durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar con PBS tres veces, los portaobjetos se incubaron con anticuerpo policlonal de conejo contra P-Smad2C (1:100), P-Smad3C (1:100), P-Smad2L (01:50), P-Smad3L (1:50 ), y α-SMA (1:200), respectivamente, a 4 ° C durante la noche. El día siguiente, los portaobjetos se lavaron con PBS tres veces. Después del lavado, se incubaron con EnVision peroxidasa (Dako) marcado con anti-conejo o anticuerpo anti-ratón de 1 h a temperatura ambiente. se detectó actividad de la peroxidasa con diaminobencidina (DAB). Las diapositivas se counterstained con hematoxilina. La inmunorreactividad se visualizó con microscopía de luz
Para el análisis semicuantitativo, las secciones de tejidos teñidos fueron evaluados en una escala de 4 puntos de la siguiente manera: los recuentos de células positivas, los grados 0-3 (0, no hay células positivas; 1, & lt. ; 25% de células positivas, 2, 25% -50% de células positivas; 3, & gt; 50% de células positivas); intensidad de la tinción positiva, los grados 1-3 (1, tinción positiva débil, generalmente de color amarillo; 2, fuerte tinción positiva, generalmente de color marrón; 3, muy fuerte tinción positiva, por lo general de color marrón oscuro a negro). El marcador final tinción inmune se calculó como el número × intensidad.
inmunofluorescencia tinción
Las diapositivas se deparaffinised en xileno y rehidratada en etanol clasificado hasta que el agua destilada. A continuación, la recuperación de antígeno se llevó a cabo por tratamiento con microondas en tampón de EDTA (1 mmol, pH 8,0). Los portaobjetos se trataron entonces con 3% de H
2O
2 durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar con PBS, tanto anticuerpos primarios, de conejo anti-P-Smad3C /Snail y el ratón anti-α-SMA /colágeno I, se aplicaron a 4 ° C durante la noche. Entonces, los anticuerpos secundarios, Alexa633-inmunoglobulina de conejo anti-ratón de G y Alexa488-burro anti-inmunoglobulina G de conejo (Molecular Probes /Invitrogen, Karlsruhe, Alemania), se aplicaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las muestras fueron montadas utilizando Dako-Cytomation fluorescente medio de montaje. Las diapositivas fueron inspeccionados y fotos fueron tomadas en un microscopio confocal (Leica, Heidelberg). Secciones sin anticuerpos primarios fueron utilizados como controles negativos.
PCR en tiempo real
El ARN total se purificó a partir de tejidos gástricos con el kit de aislamiento de ARN High Pure (Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Alemania) de acuerdo con el protocolo del fabricante, y la concentración se midió espectrofotométricamente. El ADNc se sintetizó a partir de 1 g de ARN con el Transcriptor primer kit de síntesis de cDNA Strand (Roche Diagnostics). Quantitative PCR en tiempo real se realizó con un sistema de detección de secuencia ABIPrism 7700 (Applied Biosystems) usando una mezcla maestra TaqMan PCR Universal No AmpErase UNG (parte. No 4.324.018). Se utilizaron los siguientes ensayos de expresión de genes: Smad2 (adelante: CAAACCAGGTCTCTTGATGG; inversa: GAGGCGGAAGTTCTGTTAGG), Smad3 (adelante: GGAGAAATGGTGCGAGAAGG; inversa: GAAGGCGAACTCACACAGC) y peptidylprolyl isomerasa A (gen de mantenimiento; sin Mm02342429_g1 parte..). Todos los reactivos se compraron de Applied Biosystems. Las muestras se realizaron por triplicado en las siguientes condiciones: desnaturalización inicial durante 2 minutos a 50 ° C y durante 10 minutos a 95 ° C seguido de 40 ciclos de 15 s a 95 ° C y 1 minuto a 60 ° C. Los niveles de expresión de genes en cada muestra se determinaron con el método de ciclo umbral comparativa.
Análisis estadístico
Para evaluar la asociación entre los marcadores inmunohistoquímico seleccionados y parámetros tumorales, se realizó un análisis de correlación de rango de Kendall-tau utilizando SAS versión 9.2 (Cary, NC, EE.UU.). Un
p
. & Lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo