Extracto
Los microARN (MIR) son una nueva clase de pequeñas moléculas de ARN, la desregulación de los cuales puede contribuir al cáncer. Se utilizó un enfoque combinatorio para identificar miRs que promueven la progresión del cáncer de próstata en un único conjunto de líneas celulares de cáncer de próstata, que se originan a partir de la línea celular de p69 de los padres y se extiende a una sublínea altamente metastásica tumorigénico /M12. En conjunto, se cree que estas líneas celulares para imitar la progresión del cáncer de próstata
in vivo
. análisis de la red anterior y matrices de miR sugieren que la pérdida de hsa-miR-125b, junto con la sobreexpresión de hsa-miR-22 podría contribuir a la tumorigénesis de próstata. La desregulación de estos dos MIR fue confirmada en muestras de tumores de próstata humanos en comparación con el epitelio glandular benigno adyacente recogida a través de la captura de microdisección por láser de prostatectomías radicales. De hecho, las alteraciones en la expresión de HSA-miR-125b, que parecía ser un evento temprano en la tumorigénesis. microarray de fase inversa análisis proteómico reveló ErbB2 /3 y los miembros de aguas abajo de la vía PI3K /AKT y vías /ERK MAPK así como PTEN ser dianas proteicas expresadas diferencialmente en la célula tumoral M12 en comparación con su celular p69 parental. Pertinentes estudios de expresión de luciferasa + 3'-UTR confirmaron una interacción directa entre hsa-miR-125b, y ErbB2 y entre hsa-miR-22 y PTEN. Restauración de hsa-miR-125b, o la inhibición de hsa-miR-22 a través de una expresión antagomir dio lugar a una alteración de la conducta de las células tumorales M12
in vitro
. Por lo tanto, la doble acción de hsa-miR-125b, como un supresor de tumores y hsa-miR-22 como un oncomiR contribuyó a la tumorigénesis de próstata mediante modulaciones en PI3K /AKT y vías de señalización /ERK MAPK, las principales vías conocidas para influir en la progresión del cáncer de próstata.
Visto: Budd WT, Seashols-Williams SJ, Clark GC, Weaver D, Calvert V, Petricoin E, et al. (2015) de doble acción de miR-125b, como un supresor tumoral y OncomiR-22 Promueve cáncer de próstata Tumorigénesis. PLoS ONE 10 (11): e0142373. doi: 10.1371 /journal.pone.0142373
Editor: Natasha Kyprianou, Universidad de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos |
Recibido: July 9, 2015; Aceptado: 21 Octubre 2015; Publicado: 6 Noviembre 2015
Derechos de Autor © 2015 Budd et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Los datos de la pantalla completa gama de microARN de estas líneas celulares de próstata ha sido presentado por SJS-W como una tesis doctoral en la biblioteca de la Universidad de Virginia Commonwealth (VCU10886). Los datos están disponibles a partir de NCBI Gene Expression Omnibus y accesibles a través de GEO como el número de acceso GSE49520
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional del Cáncer, número de concesión R21CA152349 a ZEZ. El donante prestado apoyo en forma de salarios de KOH, pero no tuvo ningún papel adicional en el diseño del estudio, la recogida de datos y análisis, la decisión de publicar o preparación del manuscrito. Las funciones específicas de este autor se articula en la sección "autores contribuciones"
Conflicto de intereses:. El apoyo financiero proporcionado no alteró la adherencia de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y compartir materiales
Introducción
Transformación, el crecimiento y la extravasación de los resultados de las células cancerosas de una variedad de modificaciones genéticas y epigenéticas. En la última década, ha habido un creciente cuerpo de literatura informa que la expresión aberrante de los microARN (MIR) contribuye al desarrollo de varios cánceres humanos [1-8]. miRs son una clase importante de los ARN no codificantes que afectan a los niveles de proteína post-transcripcional y, en presencia de señales externas y factores de estrés ambiental, tienen la capacidad de inducir cambios rápidos en el proteoma permitiendo que la célula de responder de una manera más precisa y energía de manera eficiente [2-5]. Numerosos procesos celulares se ven afectados por miRs, incluyendo la diferenciación, crecimiento /hipertrofia, el control del ciclo celular y la apoptosis [5,6].
miRs desregulación han sido demostrado que contribuyen a la oncogénesis por la pérdida de miRs supresor de tumores o aumento expresión de oncomiRs [1,9,10]. De cualquier pérdida de supresores de tumores o la expresión aumentada de oncomiRs en última instancia se traduce en un aumento del crecimiento celular, la proliferación, invasión o metástasis. La expresión aberrante de incluso una sola MIR tiene el potencial de influir en un gran número de procesos celulares, como cada uno de miR puede afectar a cientos de proteínas aguas abajo, que preferentemente se regulan los nodos de señalización importante de células clave y factores de transcripción [11]. El análisis muestra que las redes objetivos de MIR tienen un nodo de grado significativamente mayor que los genes elegidos al azar [11,12]. La perturbación de ellas altamente interconectado salud de las células moléculas impactos que conduce a la enfermedad
.
Por lo tanto, parece necesaria la integración de múltiples fuentes de información biológica para entender las perturbaciones que subyacen a una patología determinada a partir de un nivel de sistemas. tecnologías de alto rendimiento como los microarrays de ADN, la secuenciación del genoma, la proteómica de fase inversa, y el perfilado QRT-PCR permiten la adquisición simultánea de miles de puntos de datos. La intersección de múltiples fuentes de datos aumenta la probabilidad de identificar vías clave que participan en la iniciación del cáncer, la progresión y la metástasis. Este trabajo describe un enfoque combinatorio única para entender el impacto de la desregulación de miR en la progresión del cáncer de próstata. Aunque se han observado MIR de estar asociado con el cáncer de próstata, no hay un consenso claro sobre miRs específicos que contribuyen a la oncogénesis [7,8].
Un nuevo modelo de progresión de las líneas de células de cáncer de próstata isogénica se utilizó como se cree que la progresión del tumor son muy semejantes, ya que se produce
in vivo
[13,14,15]. Integración de perfiles de cuantificación MIR y datos proteómicos tiene el potencial de aumentar el éxito de la identificación de nuevos miRs que afectan a la tumorigénesis. Por lo tanto, los datos generados a partir de matrices de miR, inversión de fase de microarrays proteómica (RPPA), junto con la información de un análisis de las redes anteriores se utilizó para clasificar miRs desregulados en nuestro modelo de progresión del cáncer de próstata [12,16-18]. Putativa dysregulated MIR se verificaron más en ARN aislado de radicales muestras de tumores de los pacientes que utilizan la prostatectomía láser captura microdissection [LCM] [19,20]. Se identificaron varios miRs disregulados que potencialmente conducen a la progresión del cáncer de próstata [18,21]. De estos MIR, la importancia de hsa-miR-125 ter (miR-125 ter) y hsa-miR-22 (miR-22) a la tumorigénesis fue confirmado por
in vitro
experimentos. miR-125b, y miR-22 pueden ser útiles como biomarcadores relevantes para identificar y estadificar el cáncer de próstata.
Materiales y Métodos
Derivación de próstata líneas celulares y cultivo celular
p69 , las células M2182, y M12 fueron un regalo del Dr. Alegría Ware, Virginia Commonwealth University, Richmond VA, y autenticadas utilizando el análisis de STR [13,14]. Estas líneas celulares se obtuvieron mediante la inmortalización de un epitelio de próstata no neoplásico con SV40 gran antígeno T [13]. El (P69) de la línea celular de sus padres es poco tumorigénico, y no metastásico con un número cromosómico modal más bajo que la mayoría de otras líneas celulares de cáncer de próstata por lo general aisladas de sitios metastásicos (LNCaP DU145 y PC3). Un
in vivo
proceso de selección se utilizó para crear células con aumento de la tumorigenicidad y el potencial metastásico. Después de tres rondas de inyecciones subcutáneas en ratones desnudos atímicos macho, una variante altamente tumorigénico y metastásico (M12) fue aislado, que metastatiza rutinariamente después de la inyección intra-prostática [14]. La línea celular M2182 se derivó después de dos rondas de
in vivo
selección y, por tanto, representa un fenotipo intermedio que es menos tumorigénico de las células M12 y es no metastásico. Las células se mantuvieron en cultivo a 37 ° C durante menos de dos meses en los medios RPMI1640 con L-glutamina (Gibco), suplementado con suero bovino fetal al 5%, 0,05 mg /ml de gentamicina, 5μg /ml de insulina, 5 mg /ml de transferrina, y 5 mg /ml de selenio (ITS de Collaborative Research Bedford, MA) [13,14,19]. M12 células transformadas de forma estable con un vector plásmido Psiren (Clontech) que expresa el miR-125 ter (M12 + miR-125 ter) se mantuvieron con puromicina (100 ng /ml) [19,22]. M12 células transformadas de forma estable con un miARREST
™ miR22-3p inhibidor (M12 + miR-22i) plásmido de expresión (pEZX-AM03) de GeneCopoeia (HMIR-AN0332-AM03) se mantuvieron con higromicina (200 mg /ml). Después de la tripsinización (0,25% en EDTA), se sedimentaron las células, se lavaron con PBS, se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido, y se almacenaron a -80 ° C hasta su uso.
Cell Pellet Extracción de ARN
Total se extrajo ARN de pellets de células congeladas utilizando el mirVana
™ MIR método de aislamiento (Ambion-Life Technologies) según las instrucciones del fabricante. Después del aislamiento, la concentración de ARN se calculó utilizando un BioRad
® inteligente Spec
™ 3000 espectrofotómetro, diluido a una concentración de 100 ng /ml y se almacena a -80 ° C.
Cell pellets de extracción de ADN
ADN se extrajo de los sedimentos celulares congelados utilizando el kit QIAamp DNA Mini de Qiagen (Cat. No. 51304) siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de la concentración de ADN de extracción se midió como anteriormente.
Onco Biblioteca y método de secuenciación
bibliotecas de ADN se generan a partir de las líneas celulares utilizando el Ion AmpliSeq
™ Library Kit 2.0 y el ion AmpliSeq
™ el cáncer de hotspot Grupo v2 (Cat. Nº 4.480.441 y 4.475.346). El Panel de Hotspot El cáncer es una sola agrupación de amplificación que amplifica 207 amplicones que cubren más de 2.800 mutaciones cósmicos del 50 oncogenes conocidos y genes supresores de tumores. Cada muestra se preparó utilizando 10 ng de ADN de entrada de acuerdo con el Ion AmpliSeq
™ protocolo de preparación de la biblioteca (Publicación Número de pieza MAN0006735 A.0 Revisión). Ion Xpress
™ adaptadores de código de barras 1-16 Kit (Cat. No. 4.471.250) se utilizaron para los códigos de barras de las muestras individuales, y la ligadura del adaptador. Se utilizaron perlas magnéticas Agencourt AMPure XP (Cat. No. A63882, Beckman), como se indica en el Ion AmpliSeq
™ Guía del usuario de la biblioteca de preparación. bibliotecas de muestras se cuantificaron utilizando el fluorómetro Qubit 2.0 y la alta sensibilidad dsDNA Assay Kit (Cat. No. Q32851) y normalizado a una concentración de 100 pM. Emulsión de PCR se realizó en el Ion OneTouch
™ 2 Instrumento (Cat. No. 4.474.778) como se indica en Ion PGM
™ 200 Kit Plantilla OT2 (MAN0007220 número de publicación. Versión 5.0) utilizando el Ion PGM
™ plantilla OT2 200 Kit (Cat. No. 4.480.974). 100 pM librerías de muestras normalizadas se agruparon y se combinan con los reactivos del kit y OT2 Ion Esfera Partículas (ISP). La reacción se ejecuta en el OT2 utilizando el protocolo de 200 pb. Las muestras fueron procesadas para el enriquecimiento en el Ion OneTouch
™ ES. Se logró el enriquecimiento de los ISP mediante el Ion PGM
™ Plantilla OT2 200 Kit (Cat. No. 4.480.974) y DynaBeads MyOne estreptavidina perlas C1 (Cat. No. 65001 Life Technologies) de acuerdo con los protocolos del fabricante (Ion PGM
Plantilla ™ OT2 200 Guía del usuario del kit). Las perlas de estreptavidina C1 se unen específicamente a los ISP enriquecidos, permitiendo que todos los otros para ser lavados, seguido de elución con un hidróxido de sodio y Tween funden solución. El Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) se ha inicializado usando el Ion PGM
™ 200 Secuenciación Kit v2 según las recomendaciones del fabricante (Ion PGM
™ 200 Secuenciación Kit v2: Número de Publicación MAN0007273 Revisión 3.0). Las bolas de control se les añadió a la muestra de grano enriquecido, cebadores de secuenciación fueron recocidas a los proveedores de Internet y de la polimerasa añaden. ISP se secuenciaron utilizando un Ion Torrent Ion 318
™ Chip. El Ion Torrent PGM se llevó a cabo de acuerdo con las especificaciones de Ion Torrent 200 Kit v2 que utilizan flujos de 500 nucleótidos, seguida de la alineación de la referencia HG19 y analizado por el plugin Ion Torrent variante de llamadas.
TaqMan
® ensayo basado MIR
Verificación de la expresión de miR madura se confirmó utilizando TaqMan
® metodología MIR (Life Technologies, Grand Island, NY). El ADNc se sintetizó en un volumen de reacción de 25 l de ARN total (20 ng) utilizando el TaqMan
® kit MicroARN transcripción inversa. Las reacciones se incubaron a 16 ° C durante 30 min, 42 ° C durante 30 min, y se inactiva a 85 ° C durante 5 min. Cada ADNc se analizó por triplicado mediante PCR cuantitativa (QRT-PCR) utilizando los cebadores específicos de secuencia hsa-miR-125 ter-1 (ID 000449), hsa-miR-22-3p (ID 000398) o RNU48 (ID 001006) en una Applied Biosystems 7300 en tiempo real instrumento PCR (Life Technologies). Cada ensayo individuales se realizó en un volumen de reacción de 20 l con 1,33 l de cDNA, 1,0 l ensayo de miR específica, 10 l TaqMan
™ PCR Universal Master Mix II sin AmpErase UNG y 7,67 l de agua libre de nucleasa. Las reacciones se incubaron a 50 ° C durante 2 min, seguido de 10 min a 95 ° C y 40 ciclos con desnaturalización durante 15 segundos a 98 ° C, y recocido /extensión para 60 seg a 60 ° C. Los datos se analizaron usando SDS v1.3.1 software (Life Technologies). Los ajustes de umbral y de referencia se establecen de acuerdo con las recomendaciones del protocolo, con la corrección de línea de base entre los ciclos 3 y 12, y un umbral automático.
Análisis estadístico de QRT-PCR datos
Se determinaron las cantidades relativas de los niveles de miR utilizando el
-ΔΔCT método de Livak et al 2 después de la normalización con RNU48 como una referencia estándar [23]. Todas las muestras se realizaron por triplicado y el umbral de ciclo medio (C
T) valor se determinó a partir C
valores de T en el rango de 25 a 35. El promedio de C
T se normalizó restando la media C
T de RNU48 (? C
T). Todas las muestras se compararon con la línea celular parental P69 restando el experimental? C
T de la? C
valor T de la línea celular p69 como calibrador. Los datos se presentan como la media ± desviación estándar de 3 experimentos independientes. Los análisis estadísticos se realizaron en Microsoft
® plataforma de software Excel, utilizando la prueba t de un estudiante independiente, asumiendo igualdad de varianza entre los dos grupos. La significación estadística se definió como p ≦ 0,05.
Captura láser microdisección (LCM)
Los tejidos tumorales y de próstata benigna se obtuvieron a partir de muestras de prostatectomía radical, después de la aprobación de la Virginia Commonwealth University (VCU), Oficina de la Investigación y la Innovación, la Junta de Revisión Institucional (IRB), Panel A. Cuatro muestras se congelaron tejido del tejido del VCU y Adquisición de datos y Análisis de Núcleos (TDAAC en http://www.pathology.vcu.edu/research/TDAAC) y uno archivado de muestras FFPE era del Departamento de Patología de la UCV [19,22]. Los tejidos humanos, consentimientos de pacientes y datos clínicos fueron proporcionados por la facilidad de la base de VCU TDAAC y el Departamento de Patología de la paciente dé su consentimiento. Todas las muestras de pacientes fueron des-identificarse para proteger la confidencialidad del paciente. Diapositivas (10-20) se generaron y revisado por una junta certificada patólogo (ED) especializado en el diagnóstico del cáncer de próstata para identificar focos de adenocarcinoma de próstata en comparación con el epitelio glandular normal, así como hiperplasia de epitelio glandular (BPH), neoplasia intraepitelial prostática (PIN) y estroma de una muestra única paciente. adenocarcinoma de próstata fue clasificado de acuerdo al sistema de clasificación de Gleason [24]. Brevemente, 8 micras rodajas de tejido se colocaron en portaobjetos de vidrio no cargados, se deshidrataron con concentraciones progresivamente crecientes de etanol, y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & amp; E) [19,20,25-29]. LCM se realizó utilizando un Arcturus Veritas
™ sistema láser de microdisección de captura (Life Technologies). Las áreas de interés (benignos en comparación con tumor de estroma además, la HPB y el PIN de una muestra FFPE) fueron capturados individualmente sobre CapSure
® tapas LCM Macro (Life Technologies, Grand Island, NY).
La extracción de RNA de LCM las muestras
ARN total fue extraído de LCM material capturado usando el Arcturus
® PicoPure
® Kit de Aislamiento de RNA (Life Technologies, Grand Island, NY) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de la disección de tejidos, las tapas de LCM se incubaron durante 30 min a 42 ° C en 50 l de tampón de extracción y se almacenaron a -20 ° C hasta el momento de la extracción de RNA. lisados celulares a partir de diapositivas sucesivas se combinaron en un solo tubo y se mezclaron con 1 volumen de etanol (70%). La solución de lisado /etanol se cargó en una alta recuperación miracol
™ columna y se centrifugó a 1.000 xg durante 2 min seguido de 16 000 xg durante 30 seg. ARN se recuperó en un volumen de 11 l. concentración de ARN y la calidad se midieron utilizando un chip Pico RNA Agilent 6000 con el Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies) utilizando las instrucciones del fabricante. Todas las muestras utilizadas para QRT-PCR muestran RNA de buena calidad según la evaluación de su integridad Número de ARN (RIN) y de la cantidad suficiente para no requerir una etapa de amplificación previa para su posterior análisis de PCR. ARN (40 ng) se transcribe de forma inversa para el análisis de miR utilizando las condiciones de QRT-PCR descritos anteriormente.
luciferasa + 3'-UTR del reportero ensayos
El 3'-UTR del gen ErbB2 humana (-1 a -576 aguas abajo del codón de terminación) y se hace referencia como pErbB2wtUTR fue proporcionado amablemente por el Dr. Christopher C. Benz [30]. Todo el 3'UTR (-1 a -576), así como las subregiones de -44 a -576 o -110 a -576 fueron recuperados por PCR utilizando los cebadores 3 'UTR apropiados y el plásmido pErbB2wtUTR como plantilla y se clonó en el sitio Xba de la luciferasa dual vector de expresión pmirGLO (Promega) para generar pErbB1 /576, pErbB44 /576 y pErbB110 /576, respectivamente. La secuencia de 3 'UTR de la de tipo salvaje y subclones eliminados se verificó mediante secuenciación de ADN. células M12 (200.000 células por pocillo en una placa de 6 pocillos sembraron el día antes) se transfectaron por triplicado con 1 g de pmirGLO vector vacío o plásmido que contiene las regiones individuales 3'-UTR de pErbB2 como se describe anteriormente. La transfección se realizó utilizando el tránsito
®-LT1 reactivo de transfección (Mirus Bio LLC) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Una mezcla de reactivo (2 l TransIT
®-LT1 ADN /ng), plásmidos y medios RPMI libre de suero se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente antes de la adición a las células y se incubaron en condiciones de cultivo de células normales durante 48 horas seguido por preparación de recogida y lisado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La actividad de luciferasa de Renilla y se midieron en 30 l de lisado celular utilizando el Sistema Dual de ensayo de luciferasa (Promega Corporation) y un GloMax
® 20/20 luminómetro (Promega Corporation). reportero de la actividad se expresa como la relación de luciérnaga a la actividad de Renilla. Cada ensayo se repitió tres veces y se tomó nota de la desviación estándar dentro de cada muestra.
A sitio de unión de miR-22 dentro de PTEN se identificó por Bar et al. [31]. Una cadena superior (56 bases de la secuencia 5'-CATATTGG
TGCTAGAAAAGGCAGCTAAAG
GAAGTGAATCTGTATTGGGGTACAGGT
) y la cadena inferior (62 bases de la secuencia
5 '(
62 bases) con el miR-22 región de destino situado en el centro (
en cursiva
) se sintetizó y direccionalmente clonó en el sitio Sac /AccI de pmirGLO (Promega). a PTEN mutante secuencia 3'-UTR que contiene un C (rojo) a una mutación que se ha demostrado para abolir la regulación por miR-22 se sintetizó de manera similar la unión y se clonó [31]. Ambas secuencias 3'-UTR de tipo salvaje y mutante PTEN se confirmaron por secuenciación de ADN. las transfecciones transitorias en el M12 línea celular se completaron como se ha descrito anteriormente, excepto 250 ng de los diversos plásmidos pmirGLO se encontró óptima para la transfección.
se prepararon inmunotransferencia
los extractos celulares como se describe anteriormente [22]. la proteína ( 30 g) se analizó en un Novex
® 4-12% Bis-Tris gel de poliacrilamida de gradiente y análisis de inmunotransferencia realizaron como se describe anteriormente [32]. Los anticuerpos primarios utilizados fueron β-actina (1: 200) producido en ratón (C4: Santa Cruz Biotecnologías Inc.) y PTEN (1: 1000) producido en conejo (D4.3: Señalización Celular). Después de la incubación en anticuerpo primario durante la noche, la transferencia se lavó como se describe anteriormente [32] y se incubaron primero en secundario anti-IgG de ratón-HRP (1: 1000) producido en cabra (Santa Cruz biotecnologías) y después con anti-IgG de conejo-HRP (1: 1000) producido en cabra (Señalización celular) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavarse las bandas fueron desarrolladas utilizando los reactivos quimioluminiscentes desde Lightning Occidental
® (Perkin Elmer, Boston, MA). Western blots fueron expuestos y las bandas de cuantificación mediante la Odisea
® Sistema Fc Imaging (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE).
Ensayo de proliferación celular
La proliferación de M12 contra el establo líneas celulares transformadas, M12 y M12 + miR125b + miR-22i se comparó. Las células se tripsinizaron, se lavaron libre de la tripsina con medio que contiene suero, y se sembraron por triplicado (20.000 células /pocillo) en placas de 9 pocillos. El número de células viables se cuantificó a los 0, 48, y 72 horas con un analizador de viabilidad celular Beckman Coulter Vi-CELL-XR automatizada usando una solución de azul de tripano. El número de células viables media se representó gráficamente en una curva exponencial con la desviación estándar observó. El crecimiento celular se comparó en puntos de tiempo 0, 48 y 72 horas usando un test t de Student obteniéndose un valor de p de 0,11 y 0,009, respectivamente.
ensayos de migración Ensayo
migración y la invasión eran realizado como se ha descrito anteriormente [19,22]. Las células se separaron de la placa usando 2,0 ml de CellStripper
™ (CellGro
®, Manassas, VA), se sedimentaron, se lavaron en suero libre de RPMI 1640 y se resuspendieron a una concentración de 2,5 x 10
5 células /ml. Se añadió una suspensión de células (50.000 células en 200 l) a la cámara superior de un tamaño de 6,0 micras de poro ThinCert
™ inserción de cultivo de tejido (Greiner Bio-One BVBA /SPRL, Monroe, NC). Se añadió medio que contenía suero (ml O.5) suplementado con 10 ng /ml de EGF a la cámara inferior. Las células se incubaron a 37 ° C durante 20 horas. Se eliminó el medio de las dos cámaras y las células que no invaden (superficie superior) fueron removidos con un aplicador de algodón estéril. Las células en la superficie inferior se fijaron en glutaraldehído al 0,025% en PBS durante 20 min. Después de la fijación, los insertos se tiñeron con 0,1% violeta leucocrystal en 10% de etanol y PBS durante 30 min y se lavaron con agua desionizada estéril. Las membranas fueron extirpados y se montaron en un portaobjetos de microscopio de vidrio. Las células se contaron en 10 campos aleatorios con un aumento de 200 X. Los datos se presentan como la suma media de las células migratorias en 10 campos al azar ± error estándar.
Invasion Ensayo
Invasión ensayos se llevaron a cabo en una manera similar a los ensayos de migración. Por lo menos 30 minutos antes de la extracción de células, 60 l (diluido 1:10) de Culturex
® reducción del crecimiento de la membrana basal del factor (factor de crecimiento reducido) fue introducido en la cámara superior de la ThinCert
™ inserción de cultivo de tejidos y se incubaron a 37 ° C para la gelificación. El resto del protocolo es idéntico al del ensayo de migración descrito anteriormente. Los datos se presentan como la suma media de las células invasivas en 10 campos al azar ± error estándar.
Fase Inversa de microarrays (RPPA)
RPPA experimentos se llevaron a cabo en el Centro de la Universidad George Mason de Proteómica y Aplicadas Medicina molecular bajo la supervisión del Dr. Emanuel Petricoin III [16,17]. Para minimizar la variación de los sedimentos celulares duplicados se utilizaron para la extracción de RNA para MIR de perfiles y para la proteómica [18]. Para RPPA, sedimentos de células fueron cosechadas por desguace, se lavaron con PBS, se congelaron rápidamente y se almacenaron a -80 ° C hasta su uso. Los sedimentos se lisaron directamente en un tampón de extracción de tejido y manchados en un portaobjetos de vidrio recubierto de nitrocelulosa (Grace Bio-labs, doblar o) en una curva de dilución en miniatura (1: 1, 1: 2, 1: 4, 1: 8 y 1 : 16) utilizando un arrayer Aushon 2470 (Aushon BioSystems Billerica, MA) para asegurar la cuantificación exacta de cada proteína medido [16]. Tres pasos sucesivos para cada línea celular se analizaron con cada muestra impresa por triplicado junto con las curvas de calibración para el control de calidad interno. matrices seleccionadas se tiñeron con proteína Sypro Rubí Blot Stain (Molecular Probes, Eugene, OR) siguiendo las instrucciones de fabricación para cuantificar la cantidad de proteína presente en cada muestra. Antes de la tinción de anticuerpos las matrices restantes fueron tratados con solución Reblot Anticuerpo Stripping (Chemicon, Temecula, CA) durante 15 min a temperatura ambiente, se lavaron con PBS, y se incubaron durante al menos una hora en I-bloque (Tropix, Bedford, MA) . El uso de un sistema automatizado (Dako Cytomation, Carpinteria, CA), las matrices se probaron primero con un 3% de peróxido de hidrógeno, el sistema de bloqueo de biotina, y luego un bloque de proteína sin suero adicional para reducir la unión no específica entre proteínas endógenas y el sistema de detección. Los anticuerpos fueron validados para su uso en la matriz mediante la verificación de una sola banda de Western Blot y la inducción péptido finalización /ligando. 3, pBAD, gratificación y atendidas son anticuerpos monoclonales ErbB2 /conejo, PI3K un conejo policlonal, todos suministrados por la señalización celular, Inc. biotinilado anti-conejo (Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA) o anti-anticuerpo secundario del ratón (CSA; Dako Cytomation Carpinteria, CA) junto con la señal catalizada Sistema de amplificación (CSA; Dako Cytomation Carpinteria, CA), un kit de amplificación de avidina /biotina a base de tiramida disponible en el mercado, se emplearon para amplificar la detección de la señal. se obtuvo usando la detección fluorescente IRDye 680RD estreptavidina (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Anticuerpos y Sypro Rubí manchadas diapositivas fueron digitalizadas en un escáner láser Tecan (TECAN, Mönnedorf, Suiza) utilizando el canal de longitud de peso 620 nm y 580 nm, respectivamente. Las imágenes se analizaron con MicroVigene Software Version 5.1.0.0 (Vigenetech, Carlisle, MA) como se describe anteriormente [16]. En general, el lisado celular fue descubierto en 111 diapositivas y cada incubó con un anticuerpo único. Los datos se volvió en una hoja de cálculo de Microsoft Excel que contiene cada tipo de célula analizada con cada anticuerpo de interés.
Análisis estadístico de los datos RPPA
Microsoft Excel se utiliza para realizar una muestra de dos t de igualdad de varianza -test para comparar los datos de expresión de proteínas entre las líneas de células P69 y M12. Un total de 45 valores se promedió para cada muestra de proteína de anticuerpo sondeado. Un valor de probabilidad estricta de p & lt; = 0,001 se utilizó para corregir la variación entre muestras múltiples y para identificar cambios verdaderamente significativos. El informaron cambios significativos se convirtieron en los cambios veces dividiendo el promedio de expresión de la proteína en la línea de células M12 por el medio de expresión de la proteína en la línea celular p69 comparativa.
Resultados
Siguiente Secuenciación generación de líneas celulares de cáncer de próstata
El p69, las líneas celulares M2182, M12 y representan un conjunto único de líneas celulares de cáncer de próstata genéticamente relacionados propuesto como un modelo de progresión duplicar los eventos moleculares que ocurren durante la tumorigénesis de próstata
in vivo [13,14,15]. La línea celular M12 es una variante altamente tumorigénicas /metastásica derivada de la línea celular p69 de los padres con la línea celular M2182 presentan un fenotipo intermedio, pero no metastásico. Por el contrario, otras líneas celulares de próstata humana establecidos, como Du145 o PC3 representan puntos finales celulares derivadas de tumores secundarios y, por tanto, no pueden ser vistos como un modelo de progresión.
Generación de la secuencia siguiente se llevó a cabo (NGS) análisis para identificar variaciones de nucleótidos potenciales en genes que se sabe que están asociados con la progresión del cáncer que podría dar cuenta de las diferencias fenotípicas mostradas por estas líneas celulares. Más de 200.000 lecturas se obtuvieron para cada sublínea con una longitud media de leer ~ 110 nts de longitud (Tabla 1). El catálogo de mutaciones somáticas en el Cáncer (cósmica) describe más de dos millones de codificación de secuencias de mutaciones puntuales identificadas en varios tipos de cáncer. Sin embargo, sólo había tres mutaciones genéticas identificadas en todos los COSMICAS sublíneas (STK11-COSM29005, PGFRA- COSM22413 y APC-COSM19099) (Tabla 2). Curiosamente, todas las mutaciones COSMICAS más un adicional de 11 nuevas mutaciones fueron consistentes a través de todos los miembros (P69, M2182 y M12) del modelo de progresión de células de cáncer de próstata. No había un solo paso de una timidina a una citosina en el STK11 * gen, que no estaba presente en la línea celular M12, pero ya que esta no es una mutación conocida que se correlaciona con el riesgo de cáncer, es poco probable que sea el único responsable de las propiedades únicas de esta sublínea. Por lo tanto, el análisis mostró que no NGS no se conocían previamente las mutaciones del gen del cáncer que podrían explicar las grandes diferencias en la tumorigenicidad y metástasis mostrados por estas líneas celulares relacionados.
Análisis de Expresión en el miR líneas celulares de cáncer de próstata
para identificar los genes que podrían contribuir a las diferentes propiedades tumorigénicas /metastásico de estas células, una pantalla de matriz de miR utilizando el miRCURY LNA
™ sistema universal RT PCR microARN (Exiqon, Dinamarca) era llevado a cabo por duplicado [18,21]. Aunque se encontraron varios miRs que están alteradas, más notable fue la expresión diferencial de miR-125b, y miR-22 [18,21]. Como las líneas celulares de próstata se volvieron más tumorigénicas progresando desde la p69 parental a la M2182 y en última instancia la célula M12, el nivel de miR-125 ter disminuyó sustancialmente, ≈ una caída de 6 veces en la expresión (Fig 1). Por el contrario, miR-22 probable funcionado como un oncomiR con el nivel de miR-22 el aumento de 3,5 veces cuando las células se volvieron más tumorigénicas y finalmente metastásico. Curiosamente, en ambos casos, el incremento mayor se produjo durante las primeras etapas de la tumorigénesis de P69 a M2182 con solamente ligeros cambios adicionales en la transición de la M2182 a las células M12.
Comparación de miR-125 ter (gris) y MIR -22 (negro) niveles en ARN extraído de p69, QRT-PCR M2182 y M12 líneas celulares de SYBR base como se describe en Materiales y Métodos. veces de diferencia se calculó como la media de tres experimentos independientes se analizaron por triplicado y normalizado a RNU48 (? C
T) como control interno y se expresó en relación con la línea celular de p69 parental utilizando el comparativo C
método T [23] . prueba de ANOVA indica una diferencia significativa con un valor de P & lt; 0.05.
MIR expresión en el ARN del tumor tejido extraído por LCM
Para confirmar estos hallazgos observados con líneas celulares de cáncer de próstata, MIR desregulación se evaluó en los tumores humanos obtenidos después de la prostatectomía radical. Determinación de cambios moleculares que contribuyen a la patogénesis en la próstata se complica por la heterogeneidad del tejido. Con frecuencia, tumor de diferentes puntuaciones de Gleason están rodeados por tejido glandular normal, todo incorporado en el estroma como se ha señalado (Fig 2). poblaciones de células puras sólo se pueden obtener a partir de un tejido tan heterogéneo con técnicas como LCM [19,20,25-29], que permite la visualización directa y la recogida de las células seleccionadas, proporcionando una fuente pura de ARN para análisis aguas abajo. 0.05.