Extracto
Una de las preguntas clave acerca de las alteraciones genómicas en el cáncer es si son funcionales en el sentido de contribuir a la ventaja selectiva de las células tumorales. La frecuencia con que se produce una alteración podría reflejar su capacidad para aumentar el crecimiento de células de cáncer, o alternativamente, una mayor inestabilidad de un locus puede aumentar la frecuencia con la que se encuentra para ser aberrante en tumores, independientemente de impacto oncogénico. Aquí hemos tratado esta en un genoma de gran escala para deleciones focales asociadas con el cáncer, que son conocidos para identificar tanto los genes supresores de tumores (supresores tumorales) y loci inestables. Basado en el análisis del número de copias de ADN de más de un millar de cánceres humanos que representan a diez tipos de tumores diferentes, observamos cinco loci con frecuencias de deleción focales por encima del 5%, incluyendo el
A2BP1
gen en 16p13.3 y el
MACROD2
gen en 20p12.1. Sin embargo, ni la expresión de ARN ni estudios funcionales apoyan un papel supresor de tumores, ya sea para génica. Otros análisis sugieren en cambio que estos son los sitios de mayor inestabilidad genómica y que se asemejan a sitios frágiles comunes (SFC). análisis de todo el genoma reveló propiedades de las deleciones recurrentes CFS-como que las distinguen de las deleciones que afectan a los genes supresores de tumores, incluyendo su aislamiento en loci específicos lejos de otros sitios de deleción genómica, un tamaño eliminación considerablemente más pequeño, y la dispersión a lo largo del locus afectado en vez de ensamblaje en un sitio común de solapamiento. Además, las supresiones CFS-al igual que tienen un menor impacto sobre la expresión génica y se enriquecen en líneas celulares en comparación con los tumores primarios. Se demuestra que los loci afectados por supresiones CFS-como a menudo son distintos de los sitios frágiles comunes conocidos. En efecto, nos encontramos con que cada tipo de tejido tumoral tiene su propio espectro de deleciones CFS-como, y que los cánceres de colon tienen muchas más CFS-como supresiones que otros tipos de tumores. Presentamos reglas simples que puedan localizar supresiones focales que no son CFS-like y más probabilidades de afectar a los supresores de tumores funcionales
Visto:. Rajaram M, Zhang J, Wang T, Li J, Kuşçu C, H Qi, et al. (2013) dos categorías distintas de Focal Las deleciones en el cáncer de genomas. PLoS ONE 8 (6): e66264. doi: 10.1371 /journal.pone.0066264
Editor: William B. Coleman, Universidad de Carolina del Norte Facultad de Medicina, Estados Unidos de América
Recibido: 28 Enero, 2013; Aceptado: 3 Mayo 2013; Publicado: 21 de junio 2013
Derechos de Autor © 2013 Rajaram et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por subvenciones NIH CA124648 y RC2CA148532. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
en el cáncer humano es generalmente el caso de que las mutaciones puntuales altamente recurrentes, como las que ocurren en
KRAS
o
TP53
, contribuyen a la ventaja selectiva de las células tumorales. Sin embargo, el caso es menos clara con alteraciones en el número de copias de ADN, en los que algunas alteraciones frecuentes, tales como la amplificación de la
erbB2 /HER2
locus proporcionan claramente una ventaja selectiva, mientras que otros, como las deleciones frecuentes de ADN en los extremos de teloméricas cromosomas probable es que no lo hacen. Esto significa que la frecuencia de alteración por sí sola no es suficiente para determinar si o no un determinado número de copias de ADN de alteración afecta directamente oncogenicidad. En ninguna parte ha sido esto más difícil de desentrañar que para los genes supresores de tumores candidatos situados en sitios frágiles comunes. sitios frágiles comunes se encuentran en todo el genoma humano y son propensos a roturas en el ADN cuando la célula se expone a la tensión de replicación parcial [1], [2]. Las células de cáncer muestran frecuentemente deleciones hemizygous o homocigotos en estos loci y, además, a menudo hay expresión alteraciones del gen subyacente [3]. funciones supresoras de tumores se han encontrado algunos de estos genes, incluyendo
WWOX
,
FHIT
, y
PARK2
, y estas funciones incluyen efectos supresores del crecimiento de la restauración de expresión en deficientes líneas celulares y mutaciones de pérdida de función que conducen a la mejora de cáncer inducidos por carcinógenos o ingeniería genética en ratones [3], [4], [5]. Otros estudios han hecho observaciones que no apoyan un papel supresor de tumores para estos genes, incluyendo la incapacidad para detectar la inactivación de mutaciones puntuales [6], [7] y el fracaso frecuente de las supresiones de afectar ARN o proteína de expresión subyacente [7], [ ,,,0],8], ambos de los cuales son características comunes de otros genes supresores de tumores.
Anteriormente hemos descubierto y validado 26 oncogenes mediante el cribado funcionalmente conjuntos de genes que se amplifican focalmente en el cáncer humano y de manera similar se han validado los genes supresores tumorales que 10 fueron encontrados en deleciones focales que afectan el cáncer de hígado [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15]. Comenzamos este estudio con el objetivo de validar los candidatos de genes supresores tumorales dos que se han eliminado de manera focal a alta frecuencia sobre todo en el cáncer colorrectal,
A2BP1
y
MACROD2
. En contraste con los resultados obtenidos mediante el cribado de deleciones focales en el cáncer de hígado, no hemos encontrado que estos genes eran supresores tumorales, que nos han conducido a adoptar una mirada de todo el genoma en las propiedades de los genes focalmente eliminados en una gran base de datos de ADN el número de copias alteraciones que afectan a más de 1000 muestras de cáncer. Esto llevó al descubrimiento de dos clases de supresiones focales en el cáncer humano, uno que se parece a deleciones que afectan a los sitios frágiles comunes y el otro que se parece a deleciones que afectan a
CDKN2A /B Opiniones. Desde entonces, un examen de todo el genoma de las pequeñas deleciones homocigóticas en 270 líneas celulares de cáncer humano ha informado de que también se encuentra dos clases de supresiones focales [16], y mientras nuestras conclusiones son muy similares a los de ellos, hay algunas distinciones y matices importantes sobre las dos clases y los hallazgos adicionales que se describen a continuación.
resultados
los sitios comunes de deleciones focal en el cáncer humano
Nuestro conjunto de datos se generó por array CGH análisis de 850 primaria tumores y 304 líneas celulares de cáncer o xenoinjertos de diversos tipos de tejidos, incluyendo cerebro, mama, colon, hígado, pulmón, ovario, páncreas, próstata y piel (melanoma) (Tabla S1). Tras la normalización de datos y segmentación que hemos detectado un total de 10.835 supresiones focales (& lt; 10 Mb) en estos 1.154 muestras (Tabla S2). El tamaño medio de deleciones, tanto focal y grande, es la más corta en los telómeros como se esperaba (Figura 1A, Figura S1 en S1 de archivos) y por lo tanto un porcentaje sustancial (13%) de deleciones focales involucrados extremos teloméricas, en particular los dos extremos de la X el cromosoma y el brazo p del cromosoma 4 (Tabla S3). La Figura 1 muestra la distribución de la otra 87% de deleciones focales en todo el genoma, agrupadas en intervalos de 2-MB. Había cinco loci que mostraron frecuencias de deleción focales superior al 5% y que correspondían a la
CDKN2A /B Opiniones,
FHIT
y
WWOX
loci, supresor de tumor conocido o sospechado genes, y el
MACROD2
y
A2BP1
loci (Figura 1B). Las deleciones que afectan a
A2BP1
(también conocidos como
RBFOX1
) eran muy frecuentes en el cáncer colorrectal (21%), pero considerablemente menos frecuente o ausente en otros tipos de tumores (1-4% en ovario, hígado y los cánceres de pulmón y ausente en mama, melanoma, próstata, y cánceres de páncreas). Del mismo modo, las deleciones que afectan a
MACROD2
fueron más frecuentes en el cáncer colorrectal (17%), pero considerablemente menos frecuente o ausente en otros tipos de tumores (0,5 a 3% en mama, hígado y pulmón y ausente en ovario, melanoma, próstata y cáncer de páncreas). supresiones frecuentes que afectan a
A2BP1
y
MACROD2 Hoteles en cáncer de colon han sido observados por otros [17], [18].
(A) Tamaño medio segmento de ADN como una función de la posición en el cromosoma 1 se muestra. (B) las 9.401 supresiones focales que no eran telomérica se binned en intervalos de 2 Mb y se utilizan para generar una distribución de frecuencias en todo el genoma. El intervalo genómico afectadas con mayor frecuencia correspondió a la
CDKN2A /B Opiniones locus y los próximos seis intervalos genómicas afectadas con mayor frecuencia se indican con flechas rojas y el gen correspondiente.
El examen de
A2BP1
y
MACROD2
como genes supresores de tumores potenciales
Hemos examinado los efectos de
A2BP1
y
MACROD2
supresiones sobre la expresión genética subyacente en los cánceres de colon y los tejidos de colon normales. la expresión del ARN de
A2BP1
no se pudo detectar en tiempo real por RT-PCR en cualquiera de los tejidos de colon, tumores o líneas de células cancerosas normales que hemos examinado (Figura 2A). Para ayudar a confirmar este resultado negativo, se diseñaron tres sondas adicionales para tiempo real RT-PCR y RT-PCR estándar, pero en cada caso se logró detectar
A2BP1 Hoteles en muestras de colon, a pesar de ser capaz de detectar fácilmente su expresión en el cerebro (Figura 2A). Estos resultados son consistentes con un informe previo que la expresión de
A2BP1 /RBFOX1
, que codifica un factor de splicing alternativo, se limita al corazón, los músculos y el cerebro [19]. Aunque no podemos descartar de muy bajo nivel, pero la expresión fisiológicamente relevante de
A2BP1 Hoteles en muestras de colon, no observamos ningún supresores tumorales crecimiento o efectos supresores de expresar
A2BP1 Hoteles en líneas celulares de cáncer de colon supresiones que albergan (Figura 2B). Además, aunque
MACROD2
se expresa en células de cáncer de colon, deleciones no tuvieron ningún efecto sobre la expresión tal como se mide por RT-PCR cuantitativa usando cuatro sondas diferentes, incluyendo tres dentro de las secuencias de codificación y uno en la región no traducida 3 '. Tampoco supresiones tienen ningún efecto apreciable sobre la expresión de la proteína MacroD2 (Figura 2C). Aunque aparentemente paradójico, todas estas supresiones se produjo dentro de los intrones de
MACROD2
y por lo tanto no se espera necesariamente afectan a la expresión.
(A) Umbral de ciclos de PCR para la detección de RT-PCR de
ACTB
(control) y
A2BP1
en dos muestras diferentes de tejido cerebral normal, cuatro muestras diferentes de tejido normal del colon y líneas celulares de cáncer de colon 19. Los valores por debajo de 40 indican que no hay detección de la señal. (B) El efecto de la expresión ectópica forzada
A2BP1
en la formación de tumores de la línea celular de cáncer de colon HCT-15, que alberga una deleción de 250 kb dentro de
A2BP1
. La detección de la expresión por inmunotransferencia utilizando un anticuerpo policlonal que reconoce la proteína A2BP1 [38] se muestra en el inserto. La falta de efectos supresores tumorales, también se observaron para las líneas celulares de cáncer de colon HCT-116 y SW480, tanto albergar deleciones en
A2BP1
. (C) La expresión de
MACROD2 Hoteles en líneas celulares de cáncer de colon según lo determinado por TaqMan RT-PCR utilizando cuatro sondas diferentes (tres de las secuencias de codificación y uno a un 'UTR 3, todos los afectados por supresiones), comparando celular líneas que albergan deleciones en el
MACROD2
génica para los que no lo hacen. Expresión relativa se calculó por la? C
método T utilizando
GADPH
niveles de expresión como la referencia. (D) La expresión de
MACROD2 Hoteles en líneas celulares de cáncer de colon como se determinó por inmunotransferencia utilizando un anticuerpo para MacroD2.
Los patrones de deleciones que afectan a
A2BP1, MACROD2, CDKN2A /B Opiniones y
PTEN
Hemos observado algunas diferencias en los tipos y patrones de deleciones que afectan a
A2BP1
y
MACROD2
loci en comparación con supresiones focales que afectan a
CDKN2A /B Opiniones y
PTEN
loci (Figura 3). Mediante el examen de todas las eliminaciones focales (& lt; 10 Mb) que se extendió por un locus de cuatro Mb centrado en el gen diana, se encontró que las deleciones que afectan a la
A2BP1
y
MACROD2
loci eran en promedio más pequeño ( 0.6 Mb vs. 1,6 Mb, p = 1.5E-04). Además, las deleciones que afectan a la
A2BP1
y
MACROD2
loci fueron más separaron y la mayoría no convergen en un solo sitio de recubrimiento común, en contraste con
CDKN2A /B
y
PTEN
loci (Figura 3). Se midió el grado en que cada eliminación estaba separado (no superpuestos) de otras deleciones ( "Supresión de Separación", véase Materiales y Métodos) y se encontró que había una diferencia significativa entre el
A2BP1
y
MACROD2
del lugar y de la
CDKN2A /B Opiniones y
PTEN
loci (0,4 vs 0,16, p = 0,03).
Cada uno de los cuatro espectáculos paneles (arriba ) un ideograma del cromosoma en el que se encuentra el gen de las funciones y (abajo) una vista ampliada de una región de 4 Mb centrado en el gen de las funciones, que muestra otros genes en la zona (de localización basado en la UCSC Genome Browser). Si el gen es lo suficientemente grande, la estructura exón-intrón y /o la dirección de la transcripción del gen se indican. Para la mayoría de los genes, en particular en los paneles C y D, los genes se muestran como rectángulos, debido a su tamaño más pequeño. Muestran debajo de cada zona expandida son barras horizontales que indican la extensión y los límites de deleciones individuales en los tumores de colon (Paneles A y B;
A2BP1
y
MACROD2
, respectivamente), los tumores de pulmón (Grupo C;
CDKN2A /B Opiniones), o múltiples tipos de tumores (Panel D;
PTEN
). Los genes destacados en paneles C y D están resaltados en verde.
A continuación, pretendemos determinar si estas dos distinciones entre las deleciones que afectan a
A2BP1
y
MACROD2
loci por una parte, y
CDKN2A /B Opiniones y
PTEN
loci en la otra tenían cierto cuando se comparan las deleciones que afectan a los sitios frágiles comunes conocidos y genes supresores de tumores recesivos del gen de censo de cáncer [20] , [21]. En nuestro conjunto de datos, había 11 sitios frágiles comunes y 24 genes recesivos supresores de tumores que contenían un tamaño de muestra suficiente de deleciones (& gt; 14) para este análisis estadístico (Tabla S4). De manera similar a lo que hemos observado anteriormente, en este conjunto más grande de loci el tamaño medio de deleción que afecta a los sitios frágiles comunes fue significativamente menor que las que afectan a los supresores tumorales recesivos (0,6 Mb vs. 3.3 Mb, p = 9e-06, figura 4A). Del mismo modo, la "Supresión de Separación" métrica fue significativamente mayor en los sitios frágiles comunes de lo que era en los genes supresores de tumores recesivos (Figura 4B). Este último resultado sugiere que las deleciones que afectan a estos dos grupos se presentan por diferentes mecanismos. Las deleciones en los genes sitio frágil comunes pueden ser inducidos por el estrés replicativa y posterior daño y reparación del ADN [22], las deleciones que afectan a
CDKN2A /B
se ha sugerido que surgen de la recombinación aberrante o la reparación del ADN por unión de extremos no homóloga [ ,,,0],23]. En apoyo de la idea de que estos dos tipos de deleciones surgen por mecanismos separados, se encontró que la frecuencia de co-ocurrencia de deleciones en genes diferentes del sitio y co-ocurrencia de deleciones en diferentes genes supresores de tumores frágil común era mayor que la de co -deletion de SFC y genes supresores de tumores (Figura 4C)
.
(a) Caja y bigotes parcelas para "tamaño de eliminación", que mide el tamaño medio de deleciones dentro de una ventana de 2 Mb centrado en el gen, genes comunes frágiles sitio (naranja) y genes supresores de tumores (azul) (B) Box y parcelas bigotes para "separación Supresión", que mide la separación (no superpuestos) de deleciones dentro de una ventana 2-Mb centrado en el gen, ( C) el codeleción tendencia de los genes comunes frágiles sitio (naranja) y los genes supresores de tumores (azul) con respecto al co-supresión de genes de diferentes clases (gris).
Propiedades adicionales que distinguen supresiones afectan a los sitios frágiles comunes
a continuación, pretendemos determinar si la incapacidad de las deleciones afectan a la expresión de
MACROD2
era una observación más generalizable que podría ser utilizado para distinguir los genes frágiles sitio similar comunes de genes supresores de tumores. Se determinó la correlación de la expresión del ARN y el número de copias de ADN de 115 muestras de cáncer en los que tuvimos tanto los datos ROMA aCGH perfiles de expresión génica y. En comparación con las correlaciones del grupo supresor de tumor, había muy poco efecto del número de copias de ADN en la expresión de genes en el grupo de sitio frágil común (p = 0,003, Figura 5A), lo que indica que esta característica podría ser útil en la predicción de si o no un sitio determinado de deleciones era CFS-similares. A continuación, examinó si el valor medio de copias de ADN número fue significativamente diferente, que refleja el grado en que las deleciones eran homocigotos frente a heterocigotos. A pesar de que no hubo una diferencia estadísticamente significativa entre los valores promedio del número de copias de ADN (p = .09), no parecía haber una mayor gama de valores más bajos para el grupo supresor de tumores, lo que indica que algunos de estos genes tienen más deleciones homocigóticas que lo hacen los genes sitio frágil comunes (Figura 5B).
gráficos de puntos de dispersión de los valores de las estadísticas que distinguen supresiones focales que afectan sitio frágil común (CFS) genes (naranja) de los genes supresores de tumores (azules). (A) "Correlación de ARN /ADN", que corresponde al coeficiente de correlación de Pearson de los valores del número de copias de ADN log2-transformado y los valores de expresión de ARN relativos para las 115 muestras tumorales con tanto CGH array y el ARN de perfiles de expresión de datos, (B) de ADN de copia número es el valor de la mediana de los valores de número de copias de ADN segmentado. (C) Proporción línea celular ", que proporciona una medida relativa de la frecuencia con deleciones de un gen dado se encuentran en líneas de células en lugar de tumores primarios. Los paneles (D) y (E) muestran el número de supresiones que se encuentran en cada gen dentro de una región de 10 Mb centrado en el
MACROD2
locus (D) y TP53 y
MAP2K4
loci (E) . (F) Caja y bigotes parcelas de "Supresión de aislamiento", que mide la frecuencia con que los genes vecinos se eliminan con respecto al gen ofrecido.
También encontramos que las deleciones que afectan a los sitios frágiles comunes eran más comunes en el cáncer líneas celulares que en los tumores primarios cuando se compara con deleciones que afectan a los supresores de tumores (p = 7e-05, Figura 5C). Esto es particularmente evidente en el cáncer de mama, donde
MACROD2
y
¿Cuáles son FHIT elimina en un 28% y un 15% de las líneas celulares de cáncer de mama, respectivamente, pero o no en absoluto (
FHIT
) o sólo en uno de cada 255 tumores primarios (
MACROD2
) (cuadro S5).
FHIT
fue co-suprimen,
MACROD2
en el 75% de las líneas celulares con
FHIT
eliminación, lo que indica que para ciertas líneas celulares de cáncer de mama, el estrés replicativo seguido de ADN la rotura y reparación se pueden producir durante la adaptación al cultivo celular y afectar a múltiples genes sitio frágil comunes.
al observar genoma coordenadas parcelas de frecuencias de deleción focales, se observó que las supresiones frecuentes que afectan a
MACROD2
eran relativamente aislada a lo largo del genoma y que el cálculo de la frecuencia cayó en picado a los genes inmediatamente a la izquierda ya la derecha de
MACROD2 gratis (Figura 5D). Esto era muy diferente de la zona del genoma de deleciones focales que afectan a los genes supresores de tumores
TP53
y
MAP2K4
, que ambos picos formados de recuentos de deleción, pero menos espectacularmente en el contexto de las regiones genómicas con una mayor tasa global de deleciones (Figura 5E). Queríamos determinar si esta distinción era una característica que distingue a los genes generalizables sitio frágil comunes de los genes supresores de tumores, y desarrolló una métrica "Supresión de aislamiento" que mide la cantidad de la frecuencia de la eliminación de un determinado gen era mayor que los genes vecinos. Esta métrica fue considerablemente mayor en sitio común genes frágiles que los genes supresores de tumores (& gt; 40 veces, p = 0,00001). (Figura 5F)
Análisis Computacional y clasificación de los centros de coordinación deleciones
querido utilizar estas seis propiedades para analizar las deleciones en un genoma de gran escala. Nos limita nuestra atención a los genes con deleciones suficientes con el fin de obtener resultados estadísticamente significativos (& gt; 14; supresiones 4.823 genes). En primer lugar, exploramos si alguna de las seis propiedades eran redundantes mediante la determinación de si estaban altamente correlacionados con cualquiera de los otros cinco. Aunque el tamaño de eliminación se correlacionó moderadamente con separación deleción (r = 0,39), todas las otras correlaciones por pares fueron insignificantes (entre -0,13 a 0,18), y se procedió a incluir todas las seis propiedades para el análisis no supervisado. entonces hemos hecho las seis propiedades mediante el análisis de componentes principales y trazan los 4.823 genes utilizando los tres primeros componentes principales. El gráfico resultante mostró que la mayoría de los genes eran más similares a los genes supresores de tumores recesivos (Figura 6A). Con una excepción, los genes sitio frágil comunes estaban bien separados del grupo principal y fueron similares a sólo un pequeño número de genes adicionales (Figura 6A). Este resultado indicó que la mayoría de los genes que están dirigidos por deleciones focales son similares a los genes supresores de tumores, mientras que un número considerablemente menor genes son similares a los genes sitio frágil comunes. Para probar esta idea de forma independiente, utilizamos métodos de aprendizaje supervisado (máquinas de vectores soporte y el bosque al azar [RF]) para clasificar los 4.823 genes supresores en categorías similares a CFS o tumorales. Los resultados de estos dos métodos se correlacionaron significativamente (r = 0,72) y ambos clasifican mayoría de los genes como supresor de tumores como, de acuerdo con el análisis no supervisado (Figura 5B). Las tres variables que eran más importantes en la clasificación de RF eran de un tamaño eliminación, separación eliminación, y el aislamiento deleción (Tabla S6). El uso de sólo estas tres variables, hemos generado un nuevo clasificador RF que produjo resultados que eran 99% idénticos con el clasificador inicial, el establecimiento de estas tres propiedades que los determinantes más críticos en cuanto a si un determinado patrón de deleciones focal es CFS-como o supresor de tumor -como.
los genes que tenían 15 o más supresiones focales (4.823) se analizaron por el método de aprendizaje no supervisado de Análisis de componentes Principales (PCA) y se clasifican por dos métodos de aprendizaje supervisado, máquinas de vectores soporte (SVM) y al azar bosque (RF). (A) Gráfica de los 4.826 genes basadas en sus valores para los tres primeros componentes principales derivadas de los siete propiedades de deleción que distinguen genes sitio frágil comunes de genes supresores de tumores. genes sitio frágil comunes conocidos se muestran en azul, supresores tumorales conocidos se muestran en rojo, y todos los demás se muestran en verde. supresores de tumor más conocidos están enterrados dentro de la gran grupo de genes, mientras que los genes conocidos sitios frágiles comunes, con una excepción (
GRANDE
), están claramente separados del grupo principal de los genes por su primer y segundo componente principal valores. Hay sólo un puñado de otros genes que se encuentran cerca de los genes conocidos sitios frágiles comunes. (B) Representación gráfica de la clasificación de los 4.826 genes en función de su probabilidad de ser genes sitio frágil comunes Por casualidad Forestal (
y
eje y) o Apoyo Vector Machine (
x
eje x ) clasificadores. Tanto los clasificadores se capacitó en los 35 genes conocidos con SFC o supresores tumorales (Tabla S4). La probabilidad de ser un supresor tumoral es uno menos la probabilidad de síndrome de fatiga crónica. La mayoría de los genes se agrupan en el cuadrante inferior izquierdo; Por lo tanto, ambos clasificadores predicen con alta probabilidad de que la mayoría de estos genes son los supresores de tumores.
Validación de
MACROD2
como un sitio frágil Común de Gene
Para probar si nuestra clasificación podría predecir con éxito nuevos genes de genes sitio frágiles comunes, hemos determinado si la inducción de estrés replicativo en una línea celular de cáncer de colon puede generar deleciones en
MACROD2
o
A2BP1
, que, junto con el conocido gen gen sitio frágil común
FHIT, ¿Cuáles son los tres genes más frecuentemente afectados por supresiones focales en el cáncer de colon. Se diseñó una matriz de mosaicos personalizados para estos tres genes y luego realizó aCGH, comparando el ADN de línea celular original de ADN a partir de ocho clones diferentes aislados después de una breve inducción de estrés replicativo. Cuatro de los ocho clones mostraron deleciones en
MACROD2
, y dos de los ocho clones mostraron deleciones en
FHIT gratis (Figura 7). Este establece que
MACROD2
, que no ha sido previamente demostrado ser un gen sitio frágil común en los linfocitos, es de hecho un sitio frágil gen común cuando se ensaya en una línea celular de cáncer de colon. El hecho de que
MACROD2
se detectó fácilmente como un gen sitio frágil común en células de cáncer de colon, pero no en los linfocitos es consistente con la evidencia previa de que diferentes tipos de células muestran diferentes perfiles de sitios frágiles comunes [24].
(a) un esquema del experimento, que utilizó un suelo de baldosas gama personalizada para determinar si la inducción de estrés replicativo afidicolina podría generar deleciones focales en tres loci (
A2BP1
,
MACROD2
, y
FHIT
) en células de cáncer epitelial del colon. No hay deleciones que afectan a
A2BP1
se observaron en los 8 clones examinados; 4 de 8 clones tenían deleciones que afectan a
MACROD2
; y 2 clones tenían deleciones que afectan a
FHIT
. (B) Un ejemplo de una deleción focal inducida afecta a la
MACROD2
locus. El
x
eje y representa una región de aproximadamente 1 Mb que abarca
MACROD2
. Las líneas azules representan los valores de número de copias de ADN normalizados, y las líneas de color naranja representan los valores de número de copias de ADN segmentados. (C) Un ejemplo de una deleción que afecta focal inducida
FHIT
. (D) Un ejemplo de un locus afectado (el locus HLA en el cromosoma 6p).
diferentes tipos de tumores tienen diferentes frecuencias y espectros de deleciones en CFS-como genes
Curiosamente, encontramos que los tumores de colon eran, con mucho, el más frecuentemente afectado por supresiones focales en los genes similares a CFS, con frecuencias de deleción de hasta el 21% de
A2BP1
, el 17% de
MACROD2
, 9 % para
FHIT
y 9% para
PARK2 gratis (Figura 8A). Ninguno de los otros nueve tipos de tumores fueron tan frecuentemente afectado. El cáncer de pulmón fue el siguiente más afectada, pero curiosamente tenía un espectro diferente de frecuencias, con
LRP1B sobre ser el gen CFS-como más frecuentemente suprimido en el 4% (Figura 8A). Varios tipos de cáncer no parece verse afectado en absoluto, incluyendo glioblastomas, LLC, y los cánceres de próstata, y muchos tenían muy baja frecuencia de deleciones de genes similares a CFS, incluyendo cáncer de mama, que mostró
PARK2
como su mayor parte con frecuencia suprimido gen CFS-al igual que en poco más de 2% (Figura 8A).
(a) la frecuencia con la que se elimina el sitio frágil común indicada o gen CFS-como en diferentes tumores primarios. (B) La frecuencia con la que se elimina el gen se indica común frágil sitio o CFS-como en líneas celulares de cáncer.
La frecuencia y el espectro de deleciones en los genes CFS-como fue diferente para todos los tipos de tumores cuando se comparan las líneas celulares a los tumores primarios (Figura 8B). En líneas celulares de cáncer de colon, deleciones afectados
FHIT
en más de 60% de las líneas celulares en comparación con el 9% de los tumores primarios. En líneas celulares de cáncer de mama,
FHIT
ha sido eliminada en el 10% de las muestras, pero no a todos en tumores primarios (Figura 8B). Parece posible que esto puede reflejar la plasticidad del genoma a
FRA3B gratis (
FHIT
sitio frágil) bajo condiciones de cultivo, y lo mismo puede decirse respecto a la mayor incidencia de deleciones en otra CFS-como los genes cuando se comparan las líneas celulares a los tumores primarios.
Los genes-sitio como frágiles eliminados más frecuentes y genes supresores de tumores similares a
La capacidad de predecir nuevos supresores de tumor es más pertinente la biología del cáncer que la capacidad de predecir nuevos genes sitio frágil. Nosotros razonamos que esos genes supresores tumorales como más frecuentemente afectados por supresiones focales serían entre los candidatos más fuertes (Tabla 1). Curiosamente, las supresiones focales en sólo dos de los diez mejores genes se han descrito previamente (
CDKN2A /B Opiniones y
MAP2K4
[25]). De los otros ocho genes, uno es un supresor de tumores que se sabe que es inactivado por otros mecanismos genéticos [26] (
NEM1
), y cuatro son los supresores de tumores candidatos, ya sea basado en el análisis mutacional (
CSMD1
[27]), el análisis funcional (
CDKN2AIP /CARF
[28],
mad1l1
[29]), o específica del cáncer hipermetilación del promotor (
DARL
[30]). Por otro lado, dos genes propuesto recientemente para ser supresores de tumores en función de su eliminación focal en cáncer,
PDE4D
[31] y
LRP1B
[32], se encuentran entre los diez primeros con mayor frecuencia CFS-como los genes afectados y, en consecuencia, no pueden ser supresores de tumores funcionales (Tabla 1) guía empresas
Discusión
Hemos iniciado este estudio para conciliar dos resultados dispares:. la ausencia de candidatos supresores de tumores a partir de dos loci frecuentemente afectados por supresiones focales, y la capacidad de deleciones focales para enriquecer para los supresores de tumores en una pantalla funcional. A través de análisis computacional y estadístico de supresiones focales presentes en más de 1000 muestras de cáncer, definimos dos clases distintas de deleciones en el cáncer que resuelven esta incongruencia: una clase que representa genes similares a los genes sitio frágil comunes, y otro que es el tumor supresor similar . Estos dos tipos de supresiones es probable que surjan a partir de diferentes mecanismos, basados en sus diferentes tamaños de deleción y su tendencia a ocurrir al mismo tiempo. La una clase de deleciones, cuando altamente recurrente, se superponen un sitio común y afectar de manera significativa la expresión de los genes subyacentes, lo que indica que la recurrencia es impulsado por ventaja selectiva a las células tumorales en evolución. Por el contrario, las deleciones en los genes sitio similar frágiles comunes no se superponen un sitio común ni tienen efectos significativos en la expresión génica subyacente, todo lo cual es coherente con su recurrencia siendo impulsado por la inestabilidad inherente del locus genómico en lugar de por selectiva ventaja.
Nuestros resultados establecen que la mayoría de las supresiones focales pertenecen a la clase que representa los genes supresores de tumores similar y no los genes sitio frágil comunes. Este es el único desacuerdo que tenemos con un estudio reciente que sugiere que la mayoría de las supresiones focales en el cáncer son frágiles como basado en parte en, en parte, en su tendencia a ser heterocigotos en lugar de homocigotos [16]. Sin embargo, creemos que esta propiedad no es útil como un clasificador debido a que varios supresores de tumores, incluyendo
TP53
y
CDH1
, se ven afectados por supresiones heterocigotas focales. Puede haber muchas supresores tumorales haploinsufficient, como
p27KIP1
[33], aún no se han descubierto, y herramientas computacionales que descuentan estos serían equivocada. En algunos casos, la deleción homocigótica de un supresor tumoral podría ser letal, lo que podría ser el caso para el gen conjunto de husillo puesto de control
mad1l1
que encontramos aquí para ser muy frecuentemente afectados por supresiones focales heterocigóticos. Aunque
mad1l1
aún no está en la base de datos cósmico de los supresores de tumores, deleción heterocigota de
mad1l1
se ha demostrado que aumenta la incidencia de tumores causados por la pérdida parcial de
TP53