Extracto
El cáncer de ovario presenta retos terapéuticos debido a su detección tardía normalmente, metástasis agresiva, y la resistencia terapéutica. El factor de factor de transcripción Krüppel-como 4 (KLF4) se ha implicado en cánceres humanos como un supresor de tumores o de oncogenes, aunque su papel depende en gran medida del contexto celular. El papel de KLF4 en cáncer de ovario no ha sido dilucidado en detalle mecanicista. En este estudio, se investigó el papel de KLF4 en las células de cáncer de ovario por la transducción de las líneas celulares de cáncer de ovario SKOV3 y OVCAR3 con un vector lentiviral KLF4 inducible por doxiciclina. La sobreexpresión de KLF4 reduce la proliferación celular, la migración y la invasión. El marcador de células epiteliales gen E-cadherina se reguló de manera significativa, mientras que los genes marcadores de células mesenquimales vimentina, twist1and Snail2 (babosa) se downregulated en tanto KLF4 células que expresan SKOV3 y OVCAR3. KLF4 inhibe el factor de crecimiento transformante β (TGF) epitelial inducida a mesenquimal (EMT) en las células de cáncer de ovario. Tomados en conjunto, nuestros datos demuestran que las funciones KLF4 como un gen supresor de tumores en las células de cáncer de ovario mediante la inhibición de la EMT inducida por TGF
Visto:. Chen Z, Wang Y, W Liu, Zhao G, Lee S, A Balogh , et al. (2014) doxiciclina inducible Kruppel Como Factor 4 vector lentiviral media la mesenquimales de transición epitelial en células de cáncer ovárico. PLoS ONE 9 (8): e105331. doi: 10.1371 /journal.pone.0105331
Editor: Chunming Liu, de la Universidad de Kentucky, Estados Unidos de América
Recibido: 18 Marzo, 2014; Aceptado: July 20, 2014; Publicado: 19 Agosto 2014
Derechos de Autor © 2014 Chen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este proyecto fue parcialmente apoyado por el Instituto Nacional de Salud (HL095957, HD061420 a JY, y CA092160 a GT) y la financiación de inicio UTHSC, clínica occidental Centro del Cáncer (JY) y el Gobierno chino (2010CB530204 a CL, 112102310110 a YG, 2011DFA33290 al WG). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Junming Yue es un miembro del Consejo Editorial PLoS ONE. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas y criterios editoriales. Todos los autores tienen interés en competencia para declarar.
Introducción
El cáncer de ovario tiene una alta tasa de mortalidad, según los informes, provoca 15.000 muertes al año en los EE.UU. [1]. A pesar de las mejoras se han realizado importantes en la detección de cáncer de ovario en la última década, se diagnostican más de 20.000 nuevos casos cada año [1], [2]. Las opciones terapéuticas para el cáncer de ovario son limitadas debido a su resistencia a la quimioterapia y la radioterapia conduce a recidivas frecuentes [3], [4].
KLF4 se ha demostrado que regulan la proliferación y diferenciación celular, su papel tiene sido ampliamente investigado en varios cánceres humanos mediante el uso de enfoques ganancia y pérdida de función. En cáncer de colon y de próstata, KLF4 actúa como un oncogén [5], [6]. Por el contrario, que desempeña un papel supresor de tumor en el neuroblastoma, cáncer de pulmón, cáncer gástrico, linfoma, cáncer cervical, cáncer ductal pancreático y carcinoma hepatocelular [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13]. En el cáncer de mama, KLF4 puede funcionar tanto como un oncogén [14], [15] y un supresor de tumor [16], [17], [18]. El papel de KLF4 en cáncer de ovario no se ha abordado adecuadamente y de manera mecánica. Un estudio anterior indica que el nivel de expresión de KLF4 se redujo significativamente en el cáncer de ovario en comparación con el epitelio ovárico normal, lo que sugiere que podría potencialmente KLF4 actuar como un supresor de tumores en el cáncer de ovario [19].
KLF4 desempeña un papel único en el tallo reprogramación celular facilitando la mesenquimales a la transición epitelial (MET) [20]. El interruptor fenotípica celular de transición epitelial a células mesenquimales (EMT) es un proceso fundamental en la metástasis tumoral que es una característica prominente de los carcinomas de ovario. El MET o EMT lleva a las alteraciones del epitelio y la expresión del gen marcador mesenquimal, que incluyen snail1 & amp; 2, Zeb 1 & amp; 2, Twist, vimentina, E-cadherina [18], [21], [22]. EMT está regulado por múltiples vías de señalización WNT, que incluyen, TGF, y Notch. [23], [24], [25]. Estudios recientes indican que los miRNAs regulan la EMT o vías MET por la orientación genes marcadores de células epiteliales o mesenquimales que incluyen el miR-194, miR-203 y miR-200c [22], [26]. KLF4 se ha demostrado que regulan EMT en varias células de cáncer diferentes. En el carcinoma hepatocelular, mama y células de cáncer de próstata, KLF4 activa la transcripción de la célula epitelial marcador de gen E-cadherina y reprime el gen marcador de células mesenquimales caracol 2 (babosa) mediante la unión a sus respectivos promotores. KLF4 en estos tipos de cáncer promueve MET e inhibe el crecimiento de células tumorales [10], [24], [27]. En el presente estudio, se investigó el papel de KLF4 en las células de cáncer de ovario usando un doxiciclina (Dox) que dependen de vector lentiviral KLF4 inducible (Tet-on) y encontramos que la sobreexpresión inducible de KLF4 reduce la proliferación celular, la migración y la invasión a través de la promoción MET en células de cáncer de ovario.
Materiales y Métodos
cultivo de células
Las líneas celulares de cáncer de ovario SKOV3, OVCAR3 y línea celular de cáncer de mama MCF7 se obtuvieron a partir de ATCC y se cultivaron en de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% FBS (Hyclone, Logan, UT), 100 U /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina (Invitrogen; Carlsbad, CA). células HEK293 FT se cultivaron en medio DMEM con 10% de SFB, 100 U /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina, 1% de glutamina, 1% de aminoácido no esencial, y la geneticina con una concentración final de 1 mg /ml.
vector lentiviral producción
El Dox-inducible KLF4, transactivador (rtTA-M3) revertir y EGFP lentiviral vectores fueron empaquetados en células HEK293FT y producidos como se describe anteriormente [28]. Las líneas celulares estables con sobreexpresión de KLF4- o EGFP fueron generados por la co-transducción de las células SKOV3, OVCAR3 y MCF7 con los vectores lentivirales KLF4, EGFP con rtTA-M3 y seleccionan con 5 mg /ml de puromicina. Para inducir la expresión de EGFP y KLF4, se añadió Dox en medio de crecimiento normal como se indica.
colonia celular ensayo de formación de
p>
MTT ensayo
Las células se sembraron 8.000 por pocillo en placas de 96 pocillos y se cultivaron durante 24 h. A partir de entonces, se añadieron 10 l de reactivo MTT a cada pocillo y se incubaron durante ~ 4 h. La reacción se terminó mediante la adición de 100 l de reactivo de detergente; las placas se incubaron a 22 ° C en la oscuridad durante 2 h; y luego se midió la absorbancia a 570 nm de longitud de onda.
La migración de células de ensayo
Las células transducidas (3 × 10
5 células por pocillo) se sembraron por triplicado en placas de 6 pocillos y se cultivaron durante 24 h. La superficie celular se rascó con una punta de pipeta y se lavó tres veces con PBS. Se añadió medio de crecimiento fresco por 24 h más. La tasa de migración se calculó usando la siguiente fórmula: (área de la zona de la herida a 0 h - el área de la herida en 24 h) /área de la herida a 0 h. El ensayo de migración transwell se realizó usando una cámara modificada (BD Falcon, San Jose, CA). Estas cámaras se insertaron en una placa de 24 pocillos. Las células (3 × 10
4) en 300 l se añadieron DMEM libre de suero a la cámara superior. Se añadió el cebo químico en DMEM en la cámara inferior de cada pocillo y se incubaron las células durante 24 h. La células no migradas medio y en la cámara superior se retiraron mientras que, las células que migraron en el lado inferior de las membranas se fijaron con metanol y se tiñeron con cristal violeta. Fotos fueron tomadas en un aumento de 10X. Se contaron las células en al menos tres campos diferentes.
invasión de la célula de ensayo
células
SKOV3 y OVCAR3 (5 × 10
5) transducidas con el virus de la sobreexpresión de EGFP y KLF4 fueron sembradas en suero DMEM libre sobre insertos recubiertos previamente con Matrigel (BD BioCoat, de 24 pocillos tumor del sistema Invasion (BD Biosciences, San Jose, CA). DMEM conteniendo 10% se añadió FBS a la cámara inferior del sistema de invasión como el quimioatrayente. Después de 24 h, los insertos transwell se tiñeron usando 4 g /ml de calceína AM (Life Technologies, Grand Island, NY) a 37 ° C durante 1 h. se midió la intensidad de fluorescencia usando el BioTek Sinergia (Winooski, VT) lector de placas a excitación y emisión longitudes de onda de 485 nm y 528 nm, respectivamente.
Soft agar ensayo
en la parte inferior de agar, 0,6% de agar Noble en DMEM que contiene 10% de SFB se añadió a placas de 6 pocillos. Dos millones se añadieron células en DMEM que contenía 10% de FBS y 0,35% agar Noble al agar inferior. a continuación se añadió medio de crecimiento para el agar superior una vez que se había solidificado y las células se alimentaron con medio de crecimiento fresco cada 5 d, y las colonias se contaron bajo un microscopio de luz después de 2 semanas.
Inmunofluorescencia tinción
para detectar la expresión de genes marcadores asociados-EMT, KLF4-expresar y controlar las células SKOV3 se fijaron durante 10 min usando PFA al 4%, se lavó tres veces con 0,1% de Tween 20 en PBS (PBST), y se incubaron con tampón de bloqueo (5% de suero normal de cabra, 3% de albúmina de suero bovino y 0,1% de Triton X-100 en PBS) durante 1 h. Los anticuerpos primarios a E-cadherina, Snail2, y vimentina (1:200 dilución, Señalización Celular, Danvers, MA), se incubaron con células fijadas durante la noche. Después de enjuagar tres veces durante 5 min con PBST, Alexa 488 o 594 conjugado de cabra anti-conejo (dilución 1:200, Life Technologies) se añadieron anticuerpos durante 1 h a temperatura ambiente. Los núcleos celulares se contratiñeron con DAPI (Vector Laboratories, Inc .; Burlingame, CA). Las imágenes fueron tomadas usando un microscopio de fluorescencia invertido Nikon.
inmunoprecipitación de cromatina (CHIP)
chip se realizó utilizando el kit de chip-It Express enzimática (Active Motif, Carlsbad, CA) de acuerdo con el fabricante de instrucciones. Brevemente, KLF4 que expresan y control de las células SKOV3 eran reticulado con 1% de formaldehído durante 10 min a temperatura ambiente. Las células se recogieron y se sonicaron para cizallar el ADN cromosómico. La inmunoprecipitación se llevó a cabo mediante la unión 10 g de anticuerpo de conejo anti-IgG o KLF4 (Santa Cruz Inc., Dallas, Texas) a los lisados y se incubaron a 4 ° C con rotación durante la noche. complejos de la cromatina se eluyeron de perlas magnéticas mediante inversa de reticulación. ADN de la cromatina fue purificado utilizando el QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Valencia, CA) y se eluyó en 40 l de agua. Se utilizó ADN (4 l) para la reacción de PCR cuantitativa para detectar la presencia del promotor de E-cadherina. Los cebadores usados para detectar el promotor de la E-cadherina fueron 5'-TAG AGG GTC ACC GCG TCT AT-3 '(hacia delante) y 5'-TCA CAG GTG CTT TGC AGT TC-3 (hacia atrás) como se describe anteriormente [16]. se recogieron
Western blot
células de cáncer de mama y de ovario en tampón RIPA (Thermo Scientific, Rockford, IL) que contenía 1% Halt cóctel inhibidor de proteinasa (Thermo Scientific, Rockford, IL). Una cantidad igual de proteína (40 mg /carril) se cargó en 10% de geles de SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon con leche no grasa al 5% durante 1 h y se incubaron con anticuerpos primarios contra KLF4 (Señalización Celular), GAPDH (Sigma; St. Louis, MO), vimentina, E-cadherina, o Snail2 (Señalización Celular).
El análisis estadístico
se determinaron diferencias significativas a partir de dos o tres experimentos independientes realizados por triplicado y se presentan como medias ± SD el uso de
t-test
Estudiante.
p
. & Lt; 0,05 fue considerado significativo
Resultados
La sobreexpresión de KLF4 en las células de cáncer de ovario usando el sistema Tet-en
Para determinar el papel de las KLF4 en células de cáncer de ovario, se construyó un vector lentiviral inducible, en el que el gen KLF4 fue impulsado por tetraciclina (Tet) o un promotor que responde a Dox (TRE-apretado). El activador de la transcripción inversa rtTA-M3 fue impulsado por un promotor ubicuo C humana constitutiva clonado en un vector lentiviral independiente (Figura S1A). expresión KLF4 puede ser activado por rtTA-M3 en presencia de Dox en una forma dependiente de la dosis. Un vector lentiviral EGFP inducible se construyó y sirvió como control. Para examinar la expresión inducida de KLF4 y EGFP en las líneas celulares de cáncer de ovario SKOV3 y OVCAR3, se añadió Dox a una concentración final de 1 g /ml, y la expresión de EGFP KLF4 y en diferentes puntos temporales se detectó por Western blot. La expresión de EGFP y KLF4 incrementa gradualmente durante un período de 24 h (Figura S1B). expresión de EGFP en células de cáncer de ovario SKOV3 y OVCAR3 se visualizó usando microscopía de fluorescencia 48 h después de la adición de Dox (Fig. S2A, B). tratamiento Dox provocó cambios en la morfología celular de las células SKOV3. Se observó una redondeada epitelial morfología celular similar en las células SKOV3 transducidas-KLF4 comparación con aplanado forma similar a células epiteliales multipolar de las células control EGFP o KLF4 a las 48 y 72 h (Fig. S1C y la Fig. S2C). Sin embargo, la morfología de las células transducidas OVCAR3-KLF4 no se alteró después del tratamiento Dox comparación con las células de control (datos no mostrados).
KLF4 inhibe la proliferación celular y la formación de colonias
Para investigar el papel de KLF4 en la proliferación de células de cáncer de ovario, el ensayo de MTT se realizó en las células SKOV3 y control transducidas con KLF4. Después del tratamiento Dox, la proliferación en las células que sobreexpresan KLF4-fue significativamente inhibido en comparación con EGFP o KLF4 células de control (no-Dox) (Figura 1A). También hemos realizado ensayos de formación de colonias de células SKOV3 y OVCAR3 transducidas con vectores de control KLF4 y EGFP. El número de colonias en las células KLF4 sobreexpresan se redujo significativamente en comparación con células de control EGFP y KLF4 (Figura 1B, C). Además, también se realizaron ensayos de formación de colonias en agar suave para determinar si KLF4 afecta al crecimiento celular independiente de anclaje. Del mismo modo, nuestros resultados indicaron que KLF4 inhibe la proliferación celular en los medios de cultivo semisólidos en comparación con las células control (Figura 1D).
A. La proliferación celular de células SKOV3 transducidas ya sea con EGFP o KLF4 se examinó mediante ensayo de MTT en diferentes puntos temporales después del tratamiento Dox. La sobreexpresión de KLF4 proliferación celular significativamente reducida en comparación con la de las células control tratadas-Dox (*
p
& lt; 0,05). B. 200 SKOV3 células transducidas con lentivirus vectores KLF4 o de control EGFP se sembraron en cada pocillo de una placa de 6 pocillos y se cultivaron durante 14 d. Las colonias celulares se contaron después de la tinción con cristal violeta. El número de colonias en las células KLF4 sobreexpresan fue significativamente reducido en comparación con la de las células control tratadas-Dox (***
p
& lt; 0,001). C. El número de colonias en las células OVCAR3 KLF4 sobreexpresan se redujo significativamente en comparación con la de las células control tratadas-Dox (**
p
& lt; 0,01). ensayo de formación de colonias D. Soft agar se realizó por triplicado utilizando células SKOV3. Las colonias se fotografiaron y se contaron después de 3 semanas. El número de colonias en células que sobreexpresan KLF4 fue significativamente reducido en comparación con la de las células control tratadas-Dox (***
p Hotel & lt; 0,001).
KLF4 reduce la migración celular y la invasión
Una propiedad fundamental de las células cancerosas invasivas es su mayor movilidad. Para investigar si KLF4 afecta a la migración celular en la línea celular de cáncer de ovario SKOV3, ensayo de cicatrización de la herida se realizó utilizando células SKOV3 y control transducidas con KLF4. Como se muestra en la Figura 2A, la tasa de migración celular se redujo significativamente en células KLF4 sobreexpresan en comparación con las tasas en EGFP- y control de las células transducidas con KLF4. la quimiotaxis de las células se examinó usando el ensayo de migración transwell. Como se muestra en la Figura 2B y C, las células migradas se redujeron significativamente en KLF4 sobreexpresan SKOV3 y células OVCAR3 comparación con los controles células EGFP y KLF4. Para examinar si KLF4 afecta a la invasión de células, un ensayo de invasión de células se realizó en células SKOV3 y OVCAR3 transducidas-KLF4 utilizando placas Transwell recubiertos con Matrigel. La sobreexpresión de KLF4 redujo significativamente la invasión de células en comparación con el que en los controles en ambas líneas celulares (Figura 3A, B).
A. ensayo de cicatrización de la herida se realizó para examinar la tasa de migración de las células transducidas con SKOV3 KLF4 y EGFP lentiviral vectores. Las fotografías fueron tomadas a las 0 y 24 h tras el cero inicial. Las tasas de migración se cuantificaron mediante la medición de tres áreas diferentes de heridas. Se realizaron tres experimentos separados. tasa de migración se redujo significativamente en células KLF4 sobreexpresan en comparación con la de los controles tratados con Dox (**
p
& lt; 0,01). B, ensayo de migración Transwell C. Se llevó a cabo en las células SKOV3 y OVCAR3. La sobreexpresión de KLF4 redujo significativamente la migración celular en SKOV3 (B) y células OVCAR3 (C) en comparación con la de los controles tratados con Dox (***
p Hotel & lt; 0,001).
a, B. ensayo de invasión celular se realizó utilizando placas recubiertas con Matrigel Transwell para SKOV3 (a) y las células OVCAR3 (B). La tasa de invasión se redujo significativamente en células KLF4 sobreexpresan en comparación con la de las células control tratadas-Dox tanto de células OVCAR3 SKOV3 y (**
p
& lt; 0,01). Los datos fueron recolectados a partir de tres experimentos separados y analizados mediante Estudiante
t-pruebas
.
KLF4 promueve MET en células de cáncer de ovario
Para investigar si KLF4 regula la EMT en las células de cáncer de ovario, el gen marcador de células e-cadherina y marcadores mesenquimales genes epiteliales Snail2 y vimentina se examinaron en las células transducidas SKOV3 y OVCAR3-KLF4 mediante Western blot. El marcador epitelial E-cadherina se reguló de manera significativa, mientras que la vimentina y Snail2 marcadores mesenquimales se redujeron significativamente en células que sobreexpresan KLF4 comparación con los controles EGFP y KLF4 (Figura 4A, B). También se realizó la inmunotinción de las células que sobreexpresan KLF4 y control para examinar los marcadores MET. Tanto E-cadherina y vimentina tinción fueron prominentes en las membranas celulares, mientras que Snail2 tiñeron los núcleos celulares. De manera similar a las transferencias de Western, la inmunotinción demostró que la expresión de E-cadherina se upregulated, mientras que se downregulated vimentina y Snail2 (Figura 4C, D, y E). También se examinó la expresión de TWIST1 utilizando en tiempo real RT-PCR en células transducidas SKOV3 KLF4 y encontramos que TWIST1 se downregulated significativamente en las células que expresan KLF4 SKOV3 en comparación con el control (Fig. S4). Estos resultados apoyan la hipótesis de que KLF4 promueve MET en células de cáncer de ovario. Para examinar si la regulación al alza de E-cadherina fue causado por la activación transcripcional, se realizó la inmunoprecipitación de la cromatina en KLF4-expresar y controlar las células SKOV3, y la región del promotor de la E-cadherina se amplificó a partir de ADN cromática enriquecido por PCR en tiempo real tal como se describe anteriormente [ ,,,0],dieciséis]. expresión KLF4 en las células SKOV3 condujo a un enriquecimiento de aproximadamente 15 veces de E-cadherina en comparación con los controles (Figura 4F), lo que indica que KLF4 se une al promotor de E-cadherina y activa la expresión de E-cadherina en células de cáncer de ovario.
A. borrones B. Western se realizaron en KLF4- y células SKOV3 (A) y OVCAR3 EGFP transducidas (B) con o sin inducción de Dox. E-cadherina expresión se reguló significativamente (***
p Hotel & lt; 0,001), mientras que la vimentina (**
p Hotel & lt; 0,01) y Snail2 (***
p
& lt; 0,001) se downregulated en KLF4- que sobreexpresan las células SKOV3 en comparación con células de control (a). E-cadherina (**
p Hotel & lt; 0,01) se upregulated, mientras que la vimentina (*
p Hotel & lt; 0,05) y Snail2 (***
p Hotel & lt; 0.001) se downregulated en KLF4 sobreexpresan OVCAR3 células en comparación con células de control tratadas con Dox (B). E-cadherina (C) y vimentina (D) se inmunotiñeron en las membranas celulares en KLF4-expresión y control de las células SKOV3. E. Snail2 estaba manchada en los núcleos de células que expresan en KLF4 y control de las células SKOV3. F. vinculante para el promotor de E-cadherina en las células SKOV3 KLF4 fue examinada por inmunoprecipitación de la cromatina utilizando anticuerpo KLF4 y detectada por PCR en tiempo real utilizando cebadores E-cadherina específica. Los niveles de ADN del chip enriquecida se normalizaron al ADN de entrada, seguido por sustracción de la unión no específica determinada por el control de IgG (***
p Hotel & lt; 0,001) guía empresas
KLF4. EMT inhibe TGF-inducida en células de cáncer de ovario
Para examinar si el mecanismo KLF4 regula EMT inducida por TGF en las células de cáncer de ovario, células SKOV3 y OVCAR3 fueron tratados con diferentes dosis de TGF. La expresión de las proteínas marcadoras EMT E-cadherina, vimentina, y Snail2 se examinó mediante Western blot. Nuestros datos indican que el TGF promovió la EMT en las células de cáncer de ovario mediante la regulación negativa de E-cadherina y la regulación al alza Snail2 y vimentina (Figura 5 A, B). Además, cuando se trataron KLF4-expresión y control de las células SKOV3 y OVCAR3 con dosis crecientes de TGF, la expresión KLF4 inhibió significativamente EMT inducida por TGF en ambas líneas celulares (Figura 6A, B).
líneas celulares de cáncer de ovario humano SKOV3 (A) y OVCAR3 (B) fueron tratados con diferentes dosis de TGF durante 48 h. Los genes marcadores de EMT-asociado, incluyendo la E-cadherina, Snail2, y vimentina fueron examinados mediante Western blot. Significaciones se determinaron mediante la comparación de TGF tratada a no tratamiento (* p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001).
líneas celulares de cáncer de ovario SKOV3 (A) y OVCAR3 (B) transducidas con lentiviral KLF4 sobreexpresión y el control de vectores se trataron con TGF durante 48 h, y las expresiones de proteínas de genes marcadores asociados-EMT e-cadherina, Snail2 y vimentina se examinaron mediante Western blot. Se compararon las diferencias significativas entre KLF4 expresar y grupo control (** p & lt; 0,05, *** p & lt; 0,001) guía empresas
Discusión
En este estudio, se investigó el papel de. KLF4 en las células de cáncer de ovario utilizando vector lentiviral mediada por la expresión inducible. Estudios anteriores demostraron que KLF4 se downregulated en los cánceres de ovario en comparación con los controles y que KLF4 no afectó a la proliferación celular, pero aumentó la relación de Bcl-2 /Bax y inhibieron la apoptosis [19]. En contraste, encontramos que KLF4 inhibe la proliferación de las células SKOV3 en la formación de colonias y ensayos de MTT (Fig. 1A, B, y C). La discrepancia puede ser causada por la baja eficiencia de transfección en este estudio en comparación con nuestro altamente eficiente transducción lentiviral inducible. También se encontró que KLF4 inhibe la proliferación celular en las células OVCAR3 (Fig. 1C). Nuestros datos demuestran que KLF4 inhibe la proliferación celular, la migración y la invasión, por lo tanto funciona como un supresor de tumores tanto en las células SKOV3 y OVCAR3.
KLF4 puede tener un efecto dual, ya sea como un oncogén o un supresor de tumor en la mama las células del cáncer [14], [16], [18], [30]. Para comparar las acciones de KLF4 en cáncer de mama MCF7 con la de las células de cáncer de ovario, hemos realizado experimentos similares con el mismo lentiviral Tet-en-inducible vector transducido en células MCF7. Se encontró que KLF4 inhibe la proliferación celular MCF7 (Fig. S3A). Nuestro hallazgo es similar a los resultados mostrados en las células MCF10A por Yori et al. [dieciséis]. Yu et al., Sin embargo, mostraron que las funciones KLF4 como un oncogén en las células MCF7 [14], que es opuesta a nuestro hallazgo.
La morfología en KLF4 células que expresan SKOV3 en presencia de Dox estaba claramente alterada de las células de control sin Dox en los diferentes puntos de tiempo (Fig S2C); Sin embargo, no se observaron alteraciones morfológicas evidentes en las células OVCAR3 después de la inducción de la expresión KLF4. Una de las razones causantes de este fenómeno es que KLF4 también indujo la apoptosis celular en células de cáncer de ovario en base a nuestros datos no publicados. Las diferencias morfológicas pueden ser causados por las diferentes respuestas a la apoptosis inducida KLF4 en ambas líneas celulares. En tanto las células SKOV3 y OVCAR3 se upregulated el marcador de células epiteliales gen E-cadherina, y los genes marcadores mesenquimales vimentina y Snail2 se downregulated después de la inducción de la sobreexpresión KLF4 (Fig. 4A, B). En conjunto, estos datos sugieren que KLF4 promovido principalmente MET en células de cáncer de ovario. La expresión de los genes marcadores de EMT asociado en las células de cáncer de ovario son similares a lo que hemos observado en células de cáncer de mama MCF7, aunque la expresión endógena de vimentina en MCF7 no era detectable en las células que sobreexpresan KLF4 o de control. Esto puede ser causado por el bajo nivel de expresión endógena de vimentina en células MCF7. Nuestros datos apoyan la hipótesis de que KLF4 es un regulador clave de la promoción de MET y la inhibición de la EMT en células de cáncer de ovario y de mama.
Estudios anteriores mostraron que KLF4 se une a las regiones promotoras de E-cadherina y Snail2, por lo tanto puede activar el expresión de e-cadherina o reprimir la expresión de Snail2 en fibroblastos y varias líneas celulares de cáncer [18], [24], [27], [31]. Se requiere que la expresión de las células epiteliales marcador de E-cadherina para la reprogramación de células madre. KLF4 facilita el proceso MET mediante la activación de la expresión de E-cadherina [31]. En las células de cáncer de ovario, se observó una regulación al alza KLF4 dependiente de E-cadherina y una regulación a la baja de vimentina y Snail2. Nuestros datos indican que une KLF4 transcripcionalmente a los promotores de la E-cadherina, lo que conduce a la activación de la expresión de E-cadherina en las células de cáncer de ovario.
La EMT o MET está estrechamente regulada por múltiples vías de señalización. Varios estudios han demostrado que las múltiples vías de señalización WNT, incluyendo, Notch, NFkB, y TGF, están involucrados en la transición de EMT o MET en los cánceres [32], [33], [34], [35]. Estudios anteriores también mostraron que TGFß promueve la EMT en las células de cáncer de ovario [36], [37]. Sin embargo, no existen estudios relacionados, que describe el mecanismo de cómo KLF4 está involucrado en la EMT e interactúa con esas vías en las células de cáncer de ovario. Nuestros estudios actuales indican que KLF4 inhibe EMT TGF inducida tanto en células OVCAR3 (Fig. 6A, B) y SKOV3, lo que sugiere que KLF4 atenúa la EMT inducida por TGF en los cánceres de ovario. Por lo tanto, la sobreexpresión de forma sinérgica KLF4 y la inhibición de la vía TGF proporcionará un nuevo enfoque en el desarrollo de nuevos fármacos terapéuticos para el tratamiento de los cánceres de ovario.
En resumen, este es el primer informe que muestra que las funciones de KLF4 como un tumor supresor mediante la inhibición de la proliferación celular, la migración y la invasión de células de cáncer de ovario a través de la atenuación de la EMT inducida por TGF.
Apoyo a la Información
Figura S1.
inducción de la expresión KLF4 en las células de cáncer de ovario utilizando lentiviral Tet-en vectores. A. Lentiviral Tet-El sistema de vector. transactivador inverso (rtTA-M3) fue impulsado por la ubiquitina C humana (promotor UBC), y EGFP o KLF4 fue impulsada por el promotor inducible TRE-Dox ajustado. Para inducir la expresión de EGFP o KLF4, Dox es necesaria para activar el promotor Tet siguiente rtTA de unión al elemento de Tet-sensible en la región promotora. B. EGFP y KLF4 expresiones fueron inducidos por Dox en células de cáncer de ovario SKOV3 y se detectaron por transferencia de Western. C. Las células que sobreexpresan SKOV3 pantalla KLF4 redondean la morfología de las células epiteliales como
doi:. 10.1371 /journal.pone.0105331.s001 gratis (PDF)
figura S2.
Dox-indujo la expresión de EGFP en células SKOV3 y OVCAR3. expresiones EGFP en SKOV3 (A) y las células OVCAR3 (B) transducidas con EGFP vector lentiviral se visualizaron bajo microscopía de fluorescencia con o sin inducción Dox. morfologías celulares se examinan bajo el microscopio óptico. C. morfologías celulares se obtuvieron imágenes en diferentes puntos temporales con microscopía de luz
doi:. 10.1371 /journal.pone.0105331.s002 gratis (PDF)
Figura S3.
KLF4 promueve MET en células de cáncer de mama MCF7. formación A. colonia se realizó en las células MCF7 transducidas con vectores lentivirales sobreexpresión EGFP y KLF4. El número de colonias en las células KLF4 sobreexpresan fue significativamente reducido en comparación a la de los controles tratados con Dox (***
p
& lt; 0,001). El análisis de transferencia Western de B. KLF4 (**
p Hotel & lt; 0,01), E-cadherina (**
p Hotel & lt; 0,01), y Snail2 (*
p
& lt; 0,05) en las células MCF7 que sobreexpresan KLF4 y EGFP con o sin DOX tratamiento
doi:. 10.1371 /journal.pone.0105331.s003 gratis (PDF)
figura S4.
KLF4 regula a la baja TWIST1 expresión en células SKOV3 de cáncer de ovario. TWIST1 expresión en células que expresan KLF4 SKOV3 y de control se detectó por el tiempo real de RT-PCR después de la inducción KLF4 durante 24 h utilizando 1 ug /ml de doxiciclina (*
p Hotel & lt; 0,05) guía doi:. 10.1371 /journal.pone.0105331.s004 gratis (PDF)
Texto S1.
doi: 10.1371 /journal.pone.0105331.s005 gratis (DOCX)