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PLOS ONE: dusp1 es un blanco Novel para Mejorar la sensibilidad de las células del cáncer pancreático a Gemcitabine


Extracto

pancreático adenocarcinoma ductal (PDAC) es un cáncer mortal con un mal pronóstico que se caracteriza por la activación excesiva vía mitogénica y marcado quimiorresistencia a un amplio espectro de fármacos quimioterapéuticos. Dual especificidad proteína fosfatasa 1 (dusp1) es un regulador negativo clave de la mitogen activado proteínas quinasas (MAPKs). Sin embargo, dusp1 se sobreexpresa en células de cáncer de páncreas (CCP) en PDAC donde, paradójicamente, aumenta la formación de colonias en agar blando y promueve
in vivo
tumorigenicidad. Sin embargo, no se sabe si la sobreexpresión dusp1 contribuye a PDAC quimiorresistencia. Usando BxPC3 y COLO-357 CCP humanos, se muestra que la gemcitabina activa c-Jun N-terminal quinasa (JNK) y p38 mitogen proteína quinasa activada (p38 MAPK), quinasas clave en dos grandes vías de señalización activadas por estrés. JNK y p38 MAPK activación gemcitabina inducida media la apoptosis aumentó, pero también aumenta transcriptionally dusp1, como se evidencia por el aumento de los niveles de ARNm de dusp1 y RNA polimerasa II de carga en el cuerpo gen dusp1. Por el contrario, la inhibición mediada por shRNA de dusp1 mejora JNK y p38 MAPK activación y quimiosensibilidad gemcitabina. Uso de caída inducible por doxiciclina de dusp1 en los tumores de páncreas ortotópico establecidos, se encontró que la combinación de gemcitabina con la inhibición dusp1 mejora la supervivencia animal, atenúa la angiogénesis, y aumenta la muerte celular por apoptosis, en comparación con la gemcitabina sola. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la regulación al alza gemcitabina mediada de dusp1 contribuye a un bucle de retroalimentación negativa que atenúa sus acciones beneficiosas sobre las vías de estrés y apoptosis, aumentando la posibilidad de que la orientación dusp1 en PDAC puede tener la ventaja de la mejora de la quimiosensibilidad gemcitabina mientras que suprime la angiogénesis.

Visto: Liu F, AJ Gore, Wilson JL, Korc M (2014) dusp1 Es una nueva diana para Mejorar la sensibilidad de las células del cáncer pancreático a la gemcitabina. PLoS ONE 9 (1): e84982. doi: 10.1371 /journal.pone.0084982

Editor: Rajesh Agarwal, de la Universidad de Colorado en Denver, Estados Unidos de América

Recibido: 23 de octubre de 2013; Aceptado: 27 Noviembre 2013; Publicado: 7 Enero 2014

Derechos de Autor © 2014 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional del cáncer (NCI) de subvención CA-R37-075059 a MK, otorgado por los Institutos nacionales de Salud. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:. Korc Murray es un miembro del Consejo Editorial PLoS ONE. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.

Introducción

pancreático adenocarcinoma ductal (PDAC) es la cuarta causa principal de muerte por cáncer en los EE.UU., con una mortalidad anual de cerca de 38.000, una supervivencia media de 6-7 meses y una tasa de supervivencia a cinco años del 6% [1]. Si bien la resección prolonga la supervivencia y ofrece una cura potencial, el 80-85% de los PDAC son resecable en el momento de diagnóstico debido a la presencia de metástasis distantes, siembra peritoneal o invasión en las estructuras vitales adyacentes [2]. El agente quimioterapéutico gemcitabina (2 ', 2'-difluorodesoxicitidina, dFdC) ha sido el estándar de cuidado para los pacientes con enfermedad localmente avanzada o metastásica [3]. Recientemente, la Administración de Alimentos y Medicamentos aprobó la combinación de gemcitabina y paclitaxel-nab, basado en el hallazgo de que esta combinación mejora la supervivencia global de 8,5 meses frente a 6,7 ​​meses con gemcitabina sola [4]. En general se acepta que la mejora de la capacidad de respuesta a la gemcitabina en PDAC daría lugar a un aumento adicional de la supervivencia del paciente.

La resistencia de PDAC a la gemcitabina y muchos otros agentes quimioterapéuticos se debe, en parte, a una amplia gama de genética y alteraciones epigenéticas que conducen a la activación anormal de la supervivencia celular y las vías de anti-apoptóticos [5], un desmoplasia intensa que interfiere con la administración de fármacos a la masa tumoral [6], [7], y cambios en la expresión de las moléculas clave que participan en la gemcitabina la absorción, la activación intracelular y de flujo de salida [8]. Hay una necesidad urgente, por lo tanto, para avanzar nuestra comprensión de los mecanismos subyacentes en la quimiorresistencia PDAC, con el fin de diseñar nuevos y más eficaces estrategias quimioterapéuticos.

La activación anormal de las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPKs) desempeña un papel crítico en la regulación de la supervivencia celular y la apoptosis [9], [10]. Las MAPK se pueden agrupar en tres familias: la quinasa regulada por señales extracelulares (ERK), c-Jun NH2-quinasa (JNK), y p38 MAPK [9], [10]. Tras la estimulación por mitógenos o el estrés ambiental, MAPKs son activadas a través de la fosforilación de sus residuos de tirosina y treonina por las quinasas aguas arriba MAP2K [9], [10]. MAPKs activadas fosforilan un espectro de sustratos diana, incluyendo las proteínas quinasas y factores de transcripción implicados en la regulación de la proliferación celular, la diferenciación, la supervivencia y la apoptosis [9], [10]. A pesar de la existencia de vías de diafonía entre los diferentes MAPKs, más evidencia apoya el concepto de que activa ERK promueve la proliferación celular, la supervivencia y la motilidad, mientras que las JNK y p38 MAPKs regular negativamente la progresión del ciclo celular e inducir la muerte celular por apoptosis en respuesta al estrés ambiental [9] , [10].

La familia de doble especificidad fosfatasa (DUSP) de las proteínas se compone de 25 miembros [11]. DUSPs pueden desfosforilar tanto la treonina /serina y tirosina residuos de sus sustratos y de este modo funcionar como reguladores negativos de MAPKs [11]. Dusp1 /MKP-1 es una fosfatasa MAPK nuclear que es un objetivo directo transcripcional de p53, E2F-1, c-Jun y ATF2, y que se induce en respuesta al estrés oxidativo, la hipoxia, y otros factores de estrés tales como la privación nutricional y fármacos quimioterapéuticos [12] - [14]. Dusp1 se sobreexpresa en una variedad de tumores epiteliales incluyendo PDAC, cáncer de pulmón no de células pequeñas, de mama, de ovario, gástrico, y cáncer de próstata en fase inicial [15] - [20], y esta sobreexpresión se correlaciona con una mala supervivencia de los pacientes en cáncer de ovario [18]. La expresión dusp1 aumento en el cáncer de mama está inversamente correlacionada con la actividad de JNK y marcadores de apoptosis, lo que sugiere un papel anti-apoptótica de dusp1 a través de su actividad hacia JNK [17]. En apoyo de esta conclusión, las células cancerosas que sobreexpresan dusp1 son resistentes a la quimioterapia y la apoptosis Fas ligando-inducida, mientras que la reducción de los niveles de dusp1 utilizando un pequeño ARN de interferencia aumenta la sensibilidad a estos agentes [21] - [23]. Por el contrario, en el carcinoma hepatocelular (HCC) aumento de los niveles dusp1 correlacionan con mejor pronóstico [24]. Por otra parte, dusp1 regula negativamente la señalización de ERK en células de HCC, inhibiendo de este modo su potencial de proliferación, lo que sugiere que dusp1 es un gen supresor de tumor en HCC [24]. Por lo tanto, las consecuencias perjudiciales de dusp1 sobreexpresión son cáncer probable específica.

hemos informado de que dusp1 se sobreexpresa en PDAC, y que la supresión antisentido mediada de expresión dusp1 reduce el desarrollo de tumores en ratones desnudos [15]. No se sabe, sin embargo, si dusp1 podría ser un objetivo para mejorar la respuesta a la quimioterapia basada en gemcitabina en PDAC. Ahora demuestran que la gemcitabina activa JNK y p38 MAPK, lo que conduce a un aumento de la apoptosis y la transcripción dusp1. Por el contrario, la inhibición mediada por shRNA de dusp1 mejora de JNK y p38 MAPK activación inducida por gemcitabina y sensibiliza a las células PDAC a la gemcitabina. Utilizando una estrategia de doxiciclina-inducible para suprimir dusp1 en los tumores de páncreas ortotópico establecidos, se muestra que la combinación de gemcitabina con la inhibición dusp1 prolonga la supervivencia, atenúa la angiogénesis, y aumenta la muerte celular apoptótica. Por lo tanto, dusp1 puede ser una diana terapéutica potencial para mejorar la sensibilidad a la gemcitabina PDAC.

Resultados

JNK y p38 MAPK vías de señalización se activan en respuesta a la gemcitabina

Los efectos de gemcitabina en el crecimiento PCC se evaluaron usando el ensayo de MTT. En las tres líneas celulares, gemcitabina ejerció un efecto inhibidor del crecimiento dependiente de la dosis. AsPC-1 era más resistente a la gemcitabina, con una CI50 mayor que 100 ng /ml, mientras que BxPC-3 y COLO-357 células fueron más sensibles a la gemcitabina, con valores de CI50 de 10 ng /ml y 5 ng /ml, respectivamente ( Fig. 1A).

(a) AsPC-1, BxPC-3, y las células COLO-357 se incubaron durante 48 h en ausencia o presencia de concentraciones variables de gemcitabina, y ensayos de MTT se realizaron. Los datos son la media ± SEM de 3 experimentos. * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01, comparado con el control. (B) AsPC-1, se incubaron BxPC-3, y células COLO-357 durante los tiempos indicados con 100 ng /ml, 10 ng /ml y 5 ng /ml de gemcitabina, respectivamente, y se analizaron por inmunotransferencia. Se incubaron (C) BxPC-3 células durante 48 h con 10 ml de gemcitabina /ng (G), en ausencia o presencia de 10 mM SB203580 (SB) o 10 SP600125 mu M (SP), y se analizaron por inmunotransferencia.


para evaluar los efectos de la gemcitabina en la activación de MAPK, las células se incubaron con gemcitabina a una concentración cerca de su respectivo IC50 s. En BxPC-3 y COLO-357, gemcitabina induce la fosforilación de MAPK p38 y JNK quinasas, clave en dos importantes vías de señalización activadas por estrés (Fig. 1B). Gemcitabina también aumentó los niveles de fosfo-c-Jun en estas células (fig. 1B). Teniendo en cuenta que fosfo-c-Jun es un objetivo común aguas abajo de p38 MAPK y las vías de JNK, esta observación confirma la activación de p38 MAPK y la señalización de JNK. Por otra parte, los niveles de caspasa 3 escindida y la PARP escindida correlacionado con MAPK p38, JNK, y la activación de c-Jun, sugiriendo que la MAPK p38 y JNK vías median la muerte celular por apoptosis en respuesta a la gemcitabina (Fig. 1B). Por el contrario, AsPC-1 en las células eran más resistentes a la gemcitabina, como se evidencia por la ausencia de MAPK p38 y la activación de JNK y los niveles inferiores de la caspasa escindido 3 y PARP escindida, incluso a una concentración tan alta como 100 ng /mL (Fig. 1B). Para determinar si la gemcitabina apoptosis a través de MAPK p38 y la activación de JNK inducida, las células BxPC-3 se incubaron con gemcitabina en ausencia o en presencia de p38 MAPK (SB203580) o inhibidores de la JNK (SP600125). Los niveles de PARP escindida y se escindió de la caspasa 3 se redujeron por SB203580 y SP600125, cuando se añade a la gemcitabina (Fig. 1C). Por lo tanto, en líneas celulares sensibles, gemcitabina activa MAPK p38 y la señalización de JNK que induce la muerte celular apoptótica, mientras que la gemcitabina-resistencia está asociada con niveles más bajos de apoptosis y la activación de p38 MAPK /JNK marcadamente atenuada.

gemcitabina activa la transcripción dusp1 a través de JNK y p38 MAPK señalización

Teniendo en cuenta que dusp1 es un regulador clave de la actividad de MAPK [11], el próximo examinado la expresión de dusp1 en respuesta a la gemcitabina y el mecanismo subyacente regulación de su expresión. En ambas células BxPC-3 y COLO-357, dusp1 ARNm y los niveles de proteína se indujo a las 24 h y 48 h después de la adición de gemcitabina, coincidiendo con la activación de MAPK p38 y JNK (Fig. 2A). Por el contrario, no se observaron cambios significativos en los niveles en las células dusp1 gemcitabina resistente ASPC-1, de conformidad con los bajos niveles de apoptosis y la ausencia de MAPK p38 y la activación de JNK en el tratamiento (Fig. 2A).

(a) AsPC-1, BxPC-3, y COLO-357 células se incubaron durante los tiempos indicados con 100 ng /ml, 10 ng /ml y 5 ng /ml de gemcitabina, respectivamente, y los niveles de dusp1 se evaluaron por Q- PCR e inmunotransferencia. Se incubaron (B, C) las células BxPC-3 y COLO-357 durante 24 h con 10 ng /ml y 5 ng /gemcitabina ml, respectivamente, en la ausencia o presencia de 10 mmol /L U0126, 10 mmol /L SP600125, 10 mmol /L SB203580, o ambos SP600125 y SB203580, y Q-PCR (B) y ARN polimerasa II chIP seguido por Q-PCR para la región de cuerpo gen dusp1 (C) se llevaron a cabo. Todos los datos son las medias ± SEM de 3 experimentos. * P & lt; 0,05; ** P & lt;. 0,01, en comparación con el control

En respuesta a diversos estímulos, el factor de transcripción AP-1 (c-jun, c-Fos, ATF2), que es el objetivo principal de aguas abajo MAPK p38 y la señalización de JNK, se ha demostrado que asociar con el promotor dusp1 y regular su transcripción [14], [25]. Para determinar si p38 MAPK y JNK señalización mediar la inducción de la expresión dusp1 por gemcitabina, BxPC-3 y COLO-357 células se trataron con gemcitabina en ausencia o presencia de SB203580, SP600125, o su combinación. SB203580 y SP600125 disminuyó la inducción de los niveles de ARNm de dusp1 por gemcitabina, mientras que su combinación bloqueó completamente esta inducción. Por el contrario, la inhibición de ERK con U0126 no logró alterar la inducción mediada por gemcitabina de dusp1, apoyando la conclusión de que p38 MAPK y JNK en lugar de ERK señalización mediar la inducción dusp1 por gemcitabina (Fig. 2B).

El aumento de dusp1 los niveles de mRNA podría ser debido a la actividad de transcripción mejorada o estabilidad del mRNA posttranscriptional. Por lo tanto, la inmunoprecipitación de la cromatina en contra de la ARN polimerasa II, que es el componente principal de la maquinaria de transcripción, se lleva a cabo próximo, seguido por Q-PCR para cuantificar la cantidad de ARN polimerasa II unido a la región del cuerpo gen de dusp1. Este ensayo permite la medición directa de la etapa de elongación activa y refleja la actividad transcripcional del gen dusp1. Incubando BxPC-3 y COLO-357 células con gemcitabina durante 24 h aumentaron la cantidad de RNA polimerasa II de carga en la región del cuerpo gen de dusp1 por 6 veces y 12 veces, respectivamente (Fig. 2C), que apunta a la activación transcripcional de dusp1 por gemcitabina . SB203580 y SP600125, pero no U0126, inhibieron el aumento gemcitabina inducida en la cantidad de ARN polimerasa II asociada con el cuerpo gen dusp1 (Fig. 2C). En conjunto, estos resultados indican que p38 MAPK y media la señalización de JNK dusp1 activación transcripcional de gemcitabina.

La interrupción de la retroalimentación negativa dusp1 Loop Mejora quimiosensibilidad a la gemcitabina y cisplatino

Para investigar el efecto de silenciar dusp1 sobre las actividades de MAPK y la quimiosensibilidad gemcitabina, AsPC-1, BxPC-3, y células COLO-357 fueron transducidas de forma estable con lentivirus que expresa ARNhc contra dusp1 o no la orientación control de mezcla aleatoria y luego se incubaron con varias concentraciones de gemcitabina. En las tres líneas celulares, dusp1 desmontables utilizando dos shRNAs aumentó las acciones inhibidoras del crecimiento de gemcitabina. Por lo tanto, el silenciamiento dusp1 cambió los valores de CI50 para gemcitabina en AsPC-1, BxPC-3 y las células de 500 a 10 ng /ml, de 10 a 5 ng /ml, y de 5 a 2,5 ng /ml, 357 COLO-respectivamente (Fig. 3A). Estos resultados sugieren que la caída dusp1 mejora la quimiosensibilidad gemcitabina, y que los efectos sensibilizadores fueron más marcados en las células con alta quimiorresistencia.

AsPC-1, BxPC-3, y COLO-357 células fueron transducidas con lentivirus que expresan de forma estable shRNA contra el control de mezcla aleatoria o dusp1. Las células (A) se incubaron durante 48 h en ausencia o presencia de concentraciones variables de gemcitabina, y ensayos de MTT se realizaron. Los datos son la media ± SEM de 3 experimentos. * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01, comparado con el control. (B) AsPC-1, BxPC-3, y COLO-357 células se incubaron durante los tiempos indicados con 100 ng /ml, 10 ng /ml y 5 ng /ml de gemcitabina, respectivamente, y se analizó mediante inmunotransferencia.


El anticuerpo anti-dusp1 reveló rutinariamente 2 bandas estrechamente que migran en las transferencias Western (Fig. 2-3). Sin embargo, desmontables dusp1 con dos shRNAs altamente específicos dirigidos específicamente dusp1 silenciado la expresión de la banda inferior (Fig. 3B), lo que indica que la banda superior era inespecífica. Dusp1 caída con las mismas shRNAs altamente específicos también potenció la apoptosis gemcitabina inducida, como se evidencia por el aumento de los niveles de PARP escindida y la caspasa 3 (Fig. 3B) escindido. Los mayores niveles de MAPK fosfo-p38 gemcitabina inducida y fosfato JNK también se observaron en las células dusp1 una caída, en comparación con el control de mezcla aleatoria, lo que sugiere que dusp1 silenciamiento de-reprimidos p38 MAPK y la señalización de JNK, lo que conduce a la muerte celular apoptótica mejorada en respuesta a gemcitabina (Fig. 3B).

Teniendo en cuenta que la gemcitabina puede ser utilizado conjuntamente con cisplatino o 5-fluorouracilo para tratar el PDAC localmente avanzado o metastásico [26], [27], a continuación trató de determinar si la orientación dusp1 tendría efectos sensibilizadores similares sobre otros agentes quimioterapéuticos, además de gemcitabina. Con este fin, BxPC-3 y COLO-357 células que expresan de forma estable shRNA contra dusp1 o scramble control se trataron con varias concentraciones de cisplatino. En ambas células BxPC-3 y COLO-357, dusp1 caída reducida de la IC50 de 2 a 0,5 g /ml, y también potenció la muerte celular apoptótica inducida por cisplatino, como se evidencia por el aumento de los niveles de PARP escindida y la caspasa 3 (Fig escindido. 4A, 4B). Niveles más altos de MAPK fosfo-p38 inducida por cisplatino y fosfo-JNK también se observaron en las células con dusp1 desmontables (Fig. 4B), y se obtuvieron resultados similares con células ASPC-1 (datos no presentados). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la interrupción de la retroalimentación negativa sobre la MAPK p38 y la señalización de JNK por la supresión de dusp1 podría potenciar la apoptosis y mejorar la quimiosensibilidad del cáncer de páncreas a múltiples agentes quimioterapéuticos.

BxPC-3 y COLO-357 células se establemente transducidas con lentivirus que expresan shRNA contra el control de mezcla aleatoria o dusp1. Las células (A) se incubaron durante 48 h en ausencia o presencia de concentraciones variables de gemcitabina, y ensayos de MTT se realizaron. Los datos son la media ± SEM de 3 experimentos. * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01, comparado con el control. (B) BxPC-3 y COLO-357 células fueron incubadas con 2 mg de cisplatino /ml durante los tiempos indicados, y se realizó la inmunotransferencia.

Desmontables de DUSP4, Otro DUSP nuclear, se produce un error para mejorar Quimiosensibilidad

a continuación trató de determinar si una mayor quimiosensibilidad es única para el silenciamiento dusp1 o una característica común de orientación hacia miembros de la familia DUSP. De acuerdo con ello, se optó por derribo DUSP4 /MKP-2, debido a su similitud con dusp1 en términos de localización subcelular y la preferencia de sustrato [11]. células ASPC-1 y BxPC-3 fueron transducidas de forma estable con la codificación lentivirus shRNA contra DUSP4 o no focalización control de mezcla aleatoria. silenciamiento exitosa de DUSP4 se confirmó con inmunotransferencia (Fig. 5B). Sin embargo, DUSP4 caída no pudo afectar a la activación de MAPK o la respuesta a la gemcitabina en cualquiera de las líneas de células (Fig. 5A, 5B). Por lo tanto, dusp1 es una posible diana terapéutica para potenciar MAPKs activadas por estrés de señalización y la mejora de la quimiosensibilidad gemcitabina, que no es necesariamente una característica común de todos los miembros de la familia DUSP.

ASPC-1 y BxPC 3 células fueron transducidas de forma estable con lentivirus que expresan shRNA contra el control de mezcla aleatoria o MKP2. Las células (A) se incubaron durante 48 h en ausencia o presencia de concentraciones variables de gemcitabina, y ensayos de MTT se realizaron. (B) AsPC-1 y células BxPC-3 se incubaron durante los tiempos indicados con 100 ng /ml y 10 ng /ml de gemcitabina, respectivamente, y se realizó inmunotransferencia. Los datos son la media ± SEM de 3 experimentos.

gemcitabina y dusp1 derribo se combinan para prolongar la supervivencia, atenuar la angiogénesis tumoral y la proliferación, y potenciar la apoptosis

A continuación trató de evaluar el efecto de inhibir dusp1 en quimiosensibilidad gemcitabina en un modelo de ratón ortotópico. Para estudiar el potencial terapéutico de la orientación dusp1 en tumores pancreáticos completamente establecidas, que de forma estable transduced COLO-357 células de cáncer de páncreas humano con lentivirus que expresan doxiciclina-inducible shRNA contra dusp1 o un control no la orientación scramble, antes de inyectar las células en el páncreas de inmunodeficiente los ratones en un estado TET-apagado. Dos semanas más tarde, las células que expresan la doxiciclina-inducible shRNA contra los tumores de control formado dusp1 o revueltos de tamaño similar, lo que podría palpar fácilmente. Todos los ratones fueron imágenes en el día 15 después de la cirugía, el uso de un ultrasonido de alta resolución, y los volúmenes tumorales se calcularon en base adquiridas imágenes en 3-D, lo que confirma que los dos grupos de tumores de igual volumen (Fig. 6) formadas. A partir del día 18 después de la cirugía, la doxiciclina se administra de forma continua en el agua potable, y los ratones se asignaron al azar en 2 grupos para recibir vehículo o gemcitabina (50 mg /kg, inyección intraperitoneal, dos veces por semana). Gemcitabina sola o dusp1 silenciar solos fallaron para prolongar la supervivencia de los animales (Fig. 7A). Sin embargo, la comparación del grupo de shRNA-scramble /gemcitabina y el grupo shRNA-dusp1 /gemcitabina reveló que dusp1 knockdown genera una ventaja de supervivencia significativa en presencia de gemcitabina (p = 0,037) (Fig. 7A). El aumento del tiempo de supervivencia fue aún mayor cuando se compara el grupo shRNA-dusp1 /gemcitabina con el grupo shRNA-scramble /vehículo (p = 0,009), lo que sugiere que dusp1 silenciar una mayor sensibilidad gemcitabina
in vivo gratis (Fig. 7A ).

COLO-357 células fueron transducidas con lentivirus que expresan de forma estable el control Tet inducible shRNA (shScramble) o dusp1 de metas de shRNA (shDUSP1). Las células fueron inyectadas en el páncreas de ratones inmunodeficientes, y 15 días más tarde, los tumores fueron imágenes utilizando un ultrasonido de alta resolución Vevo2100. (A-B) imágenes de ultrasonido de alta resolución representativos (A) y la cuantificación de los volúmenes tumorales usando exploraciones abdominales 3D (b) muestran que antes de Dox o tratamientos gemcitabina, shScramble y tumores shDUSP1 (T, indicado por las flechas) fueron similares en tamaño . Los datos en (B) son las medias ± SEM.

ratones inmunodeficientes que llevan tumores ortotópico derivadas de células COLO-357, que expresan de forma estable doxiciclina inducible shRNA contra el control de mezcla aleatoria o dusp1 se les dio la doxiciclina en el agua potable y se trataron con control de vehículo (solución salina) o gemcitabina (50 mg /kg, ip, dos veces por semana). la supervivencia (A) de Kaplan-Meier. * P & lt; 0,05, en comparación con scramble tratados con gemcitabina;
## p & lt; 0,01, en comparación con scramble tratados con solución salina. (B) Medición de Q-PCR de los niveles de ARNm de dusp1. (C) la tinción de TUNEL y el análisis inmunohistoquímico de CD34, Ki67, y se escindió de la caspasa 3. Escala, 20 micras. (D) La cuantificación. Los datos son la media ± SEM de 3 experimentos. * P & lt; 0,05; ** P & lt;. 0,01, en comparación con scramble tratados con solución salina

De acuerdo con
in vitro
hallazgos, el tratamiento con gemcitabina aumento de los niveles de mRNA en tumores dusp1 shRNA-scramble. La mayoría de los tumores shRNA-dusp1 tenían niveles relativamente bajos de dusp1, mientras que un tumor mostró niveles altos dusp1, posiblemente debido a la exposición más corta doxiciclina o contaminación con tejido no tumoral adyacente cuando la cosecha de la muestra. Estos resultados sugieren que la doxiciclina shRNA expresión inducida con éxito. Sin embargo, debido a la alta variabilidad entre cada ratón, la diferencia en los niveles de dusp1 entre los diferentes grupos no fue estadísticamente significativa (Fig. 7B).

Para evaluar los efectos de silenciamiento dusp1 gemcitabina y tratamiento de la angiogénesis tumoral, la proliferación, y apoptosis, los tejidos tumorales fueron siguiente analizaron por tinción inmunohistoquímica para CD34 (angiogénesis) y Ki67 (proliferación), así como por la desoxinucleotidil transferasa dUTP nick etiquetado terminal de extremo (TUNEL) y se escindió de la caspasa 3 inmunoreactividad, ambos de los cuales son marcadores de apoptosis. Gemcitabina atenuado ligeramente señales CD34 y Ki67, mientras dusp1 caída tuvo un marcado efecto inhibitorio en la tinción CD34 y un efecto inhibidor más moderado, pero altamente significativo en la tinción de Ki67 (Fig. 7C, 7D). Dusp1 silenciamiento también condujo a una mayor exfoliados caspasa 3 señales TUNEL inmunorreactividad y, en comparación con los tumores de control scramble, lo que indica que hubo un aumento en la muerte celular apoptótica después de caída dusp1. El aumento de la caspasa 3 división y la fragmentación del ADN fue aún mayor cuando se combina dusp1 silenciar con gemcitabina (Fig. 7C, 7D). Por lo tanto, la orientación dusp1
in vivo
dado lugar a la angiogénesis y suprimió la proliferación de células cancerosas, y el aumento de la apoptosis inducida por gemcitabina.

Discusión

JNK1, -2 y -3 son codificada por
MAPK8
,
MAPK9
y
MAPK10
, respectivamente, y splicing alternativo da lugar a por lo menos diez isoformas [9]. Por el contrario, la p38 MAPK-α, -β, -γ y -δ están codificadas por
MAPK14
,
MAPK11
,
MAPK12
, y
MAPK13
, respectivamente, y hay dos isoformas de corte y empalme alternativo de
MAPK14
[9]. A nivel mundial, JNK y p38 MAPK vías de estrés activados inducen la apoptosis en algunos casos, pero mejoran la supervivencia en otros, dependiendo de las diferencias específicas del tipo de células, la intensidad y duración de la señalización, y la presencia o ausencia de la interferencia con otras vías de señalización [9].

en el presente estudio se determinó que la gemcitabina activado JNK y p38 MAPK, lo que induce la apoptosis en los CCP. Si bien no se evaluó el papel de isoformas específicas, JNK gemcitabina-activado y la señalización de MAPK p38 también indujeron dusp1 transcripción, como se evidencia por el aumento de los niveles de ARNm de dusp1 y el aumento de la ARN polimerasa II de carga en el cuerpo gen dusp1. Por otra parte la inhibición, mediada por shRNA de dusp1 mejorado JNK y p38 MAPK activación inducida por gemcitabina y sensibiliza las células PDAC a la gemcitabina y cisplatino, lo que lleva a la disminución de la proliferación celular y el aumento de la PARP y caspasa 3 división. Estos resultados sugieren que la activación gemcitabina mediada por JNK y p38 MAPK conduce a la regulación al alza de dusp1, que a su vez contribuye a un bucle de retroalimentación negativa que atenúa las actividades de JNK y p38 MAPK, lo que interfiere con las acciones beneficiosas de gemcitabina en vías de estrés y la apoptosis (Fig. 8). Estas observaciones plantean la posibilidad de que dusp1 puede ser una diana terapéutica potencial para mejorar la sensibilidad PDAC a múltiples agentes quimioterapéuticos. Por otra parte, la orientación dusp1 conduce a mayores niveles de p-ERK1 y ERK2-p [15], y la activación de ERK en células de cáncer de páncreas aumenta gemcitabina quimio-resistencia [28]. Por lo tanto, los aumentos de gemcitabina inducida en JNK y p38 MAPK actividades son cruciales para sus acciones pro-apoptóticos.

La gemcitabina activa JNK y p38 MAPK (p38) de señalización, que media la muerte celular por apoptosis. Activado JNK y p38 MAPK entonces upregulate la transcripción dusp1, que modula negativamente la actividad de señalización de JNK y p38 MAPK y atenuar la muerte celular inducida por gemcitabina. La inhibición de dusp1 en combinación con el tratamiento con gemcitabina mejora significativamente la quimiosensibilidad de las células de cáncer de páncreas.

regulación a la baja de dusp1 suprime la expresión de factores angiogénicos, como SH2D2A y VEGF-C en el cáncer de pulmón no microcítico ( NSCLC) células, y ensayos funcionales han confirmado el papel de dusp1 en la promoción de la angiogénesis del tumor [29]. Además, en las muestras de NSCLC humanos, dusp1 co-localiza con estructuras vasculares CD31-positivo, y una estrecha correlación entre el aumento de la expresión de VEGF-C y dusp1 se ha demostrado [29]. Estos resultados apoyan el concepto de que dusp1 puede desempeñar un papel importante en la angiogénesis tumoral. Aunque PDAC se caracteriza por una marcada desmoplasia y la hipoperfusión, sino que también exhibe una alta propensión a metástasis hematógenas a través de o linfáticos rutas, incluso cuando el tumor primario es pequeña [30]. Por otra parte, PDAC exposiciones focos de micro-angiogénesis y sobreexpresan múltiples factores pro-angiogénicos, y una mayor angiogénesis, niveles séricos elevados de VEGF-A, y el aumento de la expresión de VEGFR-2 se han correlacionado con un peor pronóstico en pacientes PDAC [30]. En conjunto, estos informes subrayan la importancia potencial de la angiogénesis aberrante en PDAC y dusp1 implican que contribuyen a este proceso.

Uso de caída doxiciclina-inducible de dusp1 en los tumores pancreáticos ortotópico establecidos, en el presente estudio se determinó que la combinación de gemcitabina con dusp1 inhibición prolongada supervivencia de los animales y el aumento de la muerte celular por apoptosis, en comparación con la gemcitabina sola. Además, dusp1 knockdown marcadamente atenuada proliferación PCC y la angiogénesis tumoral. Nuestro uso de ratones deficientes inmune se opone a una evaluación de la consecuencia de la inhibición dusp1 en el sistema inmune o en el número de macrófagos y la activación dentro de la masa del tumor de páncreas. Dado que se conoce dusp1 para modular la proliferación y activación de los macrófagos [31], los estudios con modelos de ratón singénico o genéticamente modificadas de PDAC será necesaria para abordar este aspecto de la función dusp1 en PDAC
.
Los mecanismos que conducen a una mayor dusp1 expresión en PDAC no se conocen. Se ha demostrado, sin embargo, que la hipoxia puede regular positivamente dusp1 transcripción [14], y PDAC es un tumor altamente desmoplásico con un microambiente hipóxico marcadamente [5] - [7]. Por otra parte, en presencia de estrés oxidativo, E2F1 induce la expresión dusp1 [13], y E2F1 es upregulated en PDAC como consecuencia de la disfunción RB y activación excesiva PI3K [32], [33]. Tomados en conjunto con los presentes hallazgos, estas observaciones sugieren que PDAC puede ser "cebado" de exhibir aumento de la activación dusp1 en respuesta a la gemcitabina, y sugieren que la orientación dusp1 en PDAC podría mejorar las acciones beneficiosas de gemcitabina mediante la promoción de la apoptosis y la supresión de la proliferación de células de cáncer de páncreas y la angiogénesis tumoral

Materiales y Métodos

Ética Declaración

Todos los estudios con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y uso de animales Institucional de la Universidad de Indiana (Número de Permiso: 10108).. Se llevaron a cabo todos los estudios animales descritos de acuerdo con las normas aceptadas de cuidado animal humano y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.

Cell Cultura y
ASPC-1 y BxPC-3 células de cáncer de páncreas humanos eran obtenido de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). COLO-357 células fueron un regalo del Dr. R. Metzger de la Universidad de Duke, y se colocaron originalmente en la cultura de Morgan,
et al
., [34] de un paciente con PDAC metastásico. Se han utilizado ampliamente [15], [35], [36], y se autenticada por análisis cromosómico. AsPC-1 y células BxPC-3 se cultivaron en RPMI 1640, y se cultivaron células COLO-357 en DMEM. A menos que se especifique lo contrario, los medios se complementaron con 5% de suero bovino fetal (FBS), 100 unidades /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina (medio completo).

3- (4,5-dimetiltiazol-2 il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT)

ensayo MTT se realizó tal como se describe [35].

inmunotransferencia

La inmunotransferencia se llevó a cabo como se describe anteriormente [ ,,,0],35] utilizando anticuerpos contra los antígenos siguientes: PARP, caspasa-3, exfoliados caspasa-3 (Asp175), MAPK fosfo-p38 (Thr180 /Tyr182), p38 MAPK, fosfato JNK (G9), y fosfo-c-Jun ( Ser63) de Señalización celular Tecnología, Danvers, MA; Dusp1 (C-19), MKP2 (S-18), JNK (FL) y ERK2 (C-14), de Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA.

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