Extracto
histona deacetilasa (HDAC) inhibidores detener el crecimiento de células cancerosas y causan apoptosis con baja toxicidad constituyendo de este modo un tratamiento prometedor para el cáncer. En este estudio, se determinó la actividad anti-tumoral en las células de cáncer de pulmón de la novela cíclica a base de ácido inhibidores de HDAC SL142 y SL325 hidroxámico amida-cojinete. En las células de cáncer de pulmón A549 y H441 tanto SL142 y SL325 inducidos más inhibición del crecimiento celular y la muerte celular que el ácido hidroxámico base de ácido suberoilanilida inhibidor de HDAC hidroxámico (SAHA). Por otra parte, el tratamiento de combinación utilizando fármacos retinoides ATRA o
9-cis
RA junto con el SL142 SL325 o indujo significativamente más apoptosis y la formación de colonias reprimida que la sola utilización de cualquiera. La expresión de los receptores del ácido retinoico RAR, RARβ, RXR y RXRβ se mantuvieron sin cambios con el tratamiento. Sin embargo, un constructo informador de luciferasa (pGL4. 7x RARO) que contiene siete repeticiones en tándem de el elemento encargado de ácido retinoico (RARE) genera la actividad transcripcional significativa después del tratamiento de combinación de ácidos retinoico y SL142 SL325 o en células de cáncer de pulmón H441. Por otra parte, la expresión de Bax de apoptosis y la promoción de la actividad de caspasa-3 se incrementó después de que el tratamiento de combinación. Estos resultados sugieren que el tratamiento combinado de SL142 SL325 o con ácidos retinoico ejerce actividad antitumoral significativa y es un candidato terapéutico prometedor para tratar el cáncer de pulmón humano
Visto:. Han S, T Fukazawa, Yamatsuji T, Matsuoka J, Miyachi H, Maeda Y, et al. (2010) Efecto antitumoral en cáncer de pulmón humano mediante una combinación tratamiento de la nueva inhibidores de histona deacetilasa: SL142 SL325 o retinoico y ácidos. PLoS ONE 5 (11): e13834. doi: 10.1371 /journal.pone.0013834
Editor: Rory Edward Morty, Universidad de Giessen Centro de pulmón, Alemania |
Recibido: 10 Junio, 2010; Aceptado: 11 Octubre 2010; Publicado: 4 de noviembre 2010
Derechos de Autor © 2010 Han et al. . Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación: Conceder una ayuda : El Ministerio de Educación, Ciencia y Cultura, Japón. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
histona deacetilasa (HDAC) y la histona acetiltransferasa (HAT) están implicados en la co-regulación de remodelación de la cromatina y la regulación funcional de la transcripción de genes [1]. HDACs regulan diversos tipos de procesos biológicos, incluyendo la proliferación, la diferenciación y la apoptosis [2]. Hay varios informes de que la actividad HDAC SOMBRERO alterada o está asociado con varios tipos de cáncer [3], [4], [5], [6]. Un número de inhibidores de HDAC de molécula pequeña se han desarrollado como agentes anti-cáncer. De hecho, se demostró que los inhibidores de HDAC para inducir la detención del ciclo celular, la diferenciación y la apoptosis en una variedad de células malignas. inhibidores de HDAC aumentar la acetilación de las histonas y los factores de transcripción, que puede revertir de silenciamiento génico facilitando de este modo la expresión de genes [7]. Estos efectos están mediados en parte por alteración selectiva de la expresión génica, tales como la inducción de la expresión p21waf [8]. Sin embargo, no todos los genes están regulados por el tratamiento con inhibidores de HDAC, y la proporción de hasta reguladas a reguladas por los genes se ha encontrado para estar cerca de 1:01 [9].
El cáncer de pulmón es la principal causa de muerte en el mundo [7]. Las dos formas principales de cáncer de pulmón son el cáncer no microcítico de pulmón (NSCLC) y cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC). Los resultados del tratamiento de NSCLC avanzado utilizando agentes quimioterapéuticos han sido decepcionantes. Claramente, se necesita urgentemente más investigación para el tratamiento de NSCLC avanzado. Nuevos tratamientos con nuevos mecanismos de acción, incluyendo los agentes que se dirigen a la angiogénesis y la regulación de la expresión génica por los ácidos retinoicos se han explorado [10], [11], [12], [13]. Sin ligando, ácidos retinoico receptores actúan como represores de la transcripción debido a la unión de complejos correpresores que contienen histona desacetilasas (HDAC). La unión del ligando comunicados de estos co-represores y recluta co-activador, lo que podría generar la actividad histona acetylase [13], [14]. Se ha informado de que las combinaciones de ácido retinoico todo trans y los inhibidores de HDAC tienen un efecto anti-tumor [15], [16]. La combinación de todo-
ácido trans retinoico
(ATRA) y algunos inhibidores de HDAC mostró un efecto antitumoral en el neuroblastoma [15], [16]. La terapia de combinación de ácidos retinoico con inhibidores de HDAC puede mejorar la eficacia reduciendo al mismo tiempo los efectos secundarios El propósito del presente estudio es desarrollar una nueva estrategia para tratar el cáncer de pulmón. Por tanto, hemos analizado el efecto de la utilización de la combinación de la novela, clase selectivo cíclico hidroxámico ácido basado inhibidores de HDAC SL142 amida-cojinete o SL325 [17] combinarse con ácidos retinoicos para poner a prueba su eficacia para el tratamiento de cáncer de pulmón.
Materiales y Métodos
Reactivos
SL-142 ((e) -3- (2- (4-piridin-4-il) bencil-1-oxoisoindolin-6-il) -N- hydroxyacrylamide) y SL-325 ((e) -3- (2- (4-quinolin-3-il) bencil-1-oxoisoindolin-6-il) novela histona a base de ácido hidroxámico isoindolinona--N-hidroxi-acrilamida) son deacetilasa (HDAC) inhibidores derivados de nuestros estudios de desarrollo estructural de la plantilla de la talidomida a múltiples medicamentos para la creación de nuevos fármacos estructuralmente (Fig. 1A) [18], [19].
a. Estructura química de SAHA, SL142 y SL325. B. Detección de H4 acetilación por inmunoblot 24 horas después de SAHA, SL142 SL325 o el tratamiento (0,5 o 2,0 M) en células de cáncer de pulmón H441. β-actina se muestra como control. C. efecto sobre la viabilidad celular inducida por SAHA, SL142 o SL325. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 1 × 10
3 células /pocillo 24 horas antes del tratamiento con SAHA, SL142 o SL325 (0,1 a 10 mM). La viabilidad celular se evaluó a las 96 horas después del tratamiento por el ensayo de WST1 (Roche, Basilea, Suiza) de acuerdo con el protocolo del fabricante. **, Diferencia significativa de la viabilidad de las células tratadas con 0,1 M de SAHA, o SL142 SL325 (p & lt; 0,01).
Líneas celulares y condiciones de cultivo
El ser humano no microcítico células de cáncer de pulmón de células A549, H441 y H1299 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA) y se cultivaron en F12 (células A549) de Ham, medio RPMI 1640 (células H1299) con medio de Eagle modificado de alta glucosa de Dulbecco suplementado con 10% de calor suero bovino fetal -inactivated. Todas las líneas celulares se cultivaron en 10% de CO
2 a 37 ° C. Los lisados de tejido adulto de pulmón humano se obtuvieron de Novas Biológicos (Littleton, CO).
El análisis por inmunotransferencia
Las células se lisaron en tampón de lisis enfriado en hielo [1% de Triton X-100, 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), NaCl 137 mM, glicerol al 10% (v /v), EDTA 2 mM, ortovanadato de sodio 1 mM (v /v) 1 mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo]. Los lisados celulares se clarificaron por centrifugación (10 min a 15.000 × g a 4 ° C) y se determinó la concentración de proteína usando el ensayo de proteínas DC (BioRad, Hercules, CA). Cantidades iguales de proteína fueron separadas en un gel de SDS-PAGE. El gel se transfirió electroforéticamente a una membrana de transferencia de PVDF Hybond (Amersham, Arlington Heights, IL). La membrana se incubó con anticuerpos primarios y secundarios según la Supersignal
R West Pico protocolo de quimioluminiscencia (Pierce, Rockford, IL) para detectar la unión del anticuerpo secundario. Se obtuvo anticuerpo específico para el anticuerpo β-actina de Sigma (St. Louis, MO) y se obtuvieron anticuerpo específico para RAR y RXR humano de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anti- RARβ, RXRβ y el anticuerpo de la histona H4 de acetilo se obtuvieron de Abcam (Cambridge, UK). Se obtuvieron anticuerpo específico para humano Bax, p21 y p27 de Cell Signaling Technology (Danvers, MA). anticuerpos conjugados con peroxidasa de rábano picante secundaria se obtuvieron de Jackson Immunoresearch Laboratories (West Grove, PA).
Inhibición y la medición de la actividad de caspasa
Se determinó la actividad de caspasa-3 usando kits de ensayo colorimétrico de caspasa ApoAlert obtuvo de Clontech (Mountain View, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El aumento de veces en la actividad se determinó mediante la comparación de los niveles de actividad de la caspasa en las células tratadas con los de las células de control (DMSO). Para la inhibición de las caspasas, las células fueron incubadas con 100 mM zVAD- FMK obtenida de Biovision (Mountain View, CA).
Análisis de citometría de flujo para la apoptosis
Las células se sembraron en placas de 24 pocillos a una densidad de 0,5-1,0 × 10
5 células por pocillo 1 día antes de los tratamientos. Después de 72 o 96 horas, se recogieron las células y se lavaron una vez con PBS. Las células se resuspendieron en PBS que contenía 0,2% de Triton X-100 y 1 mg /ml de ARNasa durante 5 minutos a temperatura ambiente y luego se tiñeron con yoduro de propidio a 50 mg /ml para determinar sub-G
0 /G
1 DNA contenido usando un FACScan. Dobletes, restos celulares y artefactos de fijación fueron cerrada a cabo, y se determinó
0 /G contenido sub-G
1 usando ADN de la célula de Quest Ver. 3.3 software.
supervivencia Clonigénicas
H441 células se sembraron primero a una densidad de 2 × 10
5 células por pocillo en placas de seis pocillos 24 horas antes del tratamiento. Después del tratamiento con inhibidores de HDAC (0,5 M) y /o ácidos retinoicos (2,5 M) durante 36 horas, las células se liberan de la placa por incubación con tripsina /EDTA, se contaron, y se sembraron por triplicado a una densidad de 2 × 10
3 células en placas de 100 mm para 16 días. Las células fueron fijadas con metanol al 100% y se dejaron secar al aire. Las células se tiñeron con 0,1% de cristal violeta. a continuación, se contaron las colonias (grupos de células agregadas de numeración al menos 50). El número medio de la tratados con PBS las células se fijó arbitrariamente a 100%, y todos los demás números se normalizaron en consecuencia.
Los plásmidos y reportero ensayos de transfección transitoria
doble de ADN que contiene siete repeticiones de la RARO trenzado secuencia [20], [21] se sintetizó y se ligó en los sitios NheI y HindIII del pGL.4.24 indicador de luciferasa constructo (pGL4 7x RARE;. Promega, Madison, WI). El informador de luciferasa constructo pGL4 Bax se generó por subclonación de la región promotora de Bax -1570 /+ 68 a partir de ADN genómico utilizando cebadores de PCR: 5 'tttctcgag
XhoIgaagtccaagagatcttcctgacaccctagtctga y 5'-tttaagctt
HindIII caccgccgctcccgccgccgcctctcgccgggtcc. El fragmento generado por PCR se digirió con XhoI y HindIII y se subclonó directamente en el pGL.4.24 - luciferasa constructo reportero (Promega). Todas las transfecciones se llevaron a cabo en placas de seis pocillos. células de pulmón H441 se sembraron 24 horas antes de la transfección a una densidad de 0,3 × 10
6 /pocillo. Las transfecciones se llevaron a cabo con lipofectina (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, California, EE.UU.), de acuerdo con el protocolo del fabricante. células de pulmón H441 se sembraron 24 horas antes de la transfección a una densidad de 0,3 x 106 /pocillo. Las transfecciones se llevaron a cabo con lipofectina (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, California, EE.UU.), de acuerdo con el protocolo del fabricante. 4 horas después de la transfección, las células fueron tratadas con inhibidores de HDAC y /o ácidos retinoicos. 24 horas después de los inhibidores de HDAC y /o tratamiento de los ácidos retinoicos, se recogieron las células. Los resultados de un experimento representativo se presentan como veces de inducción de unidades relativas de luz normalizada a ß-galactosidasa actividad relativa a la observada para los vectores de control. Cada experimento fue repetido al menos tres veces. Las barras de error indican la desviación estándar de la media de las muestras por triplicado en un experimento.
El análisis estadístico
Las diferencias estadísticamente significativas entre las medias y medianas de los grupos estudiados se evaluaron mediante la prueba t de Student o la no paramétrico de Mann-Whitney U-test. Un análisis de la prueba de varianza (ANOVA), en su caso, se utilizó para identificar la significación estadística para las comparaciones múltiples. La significación estadística se definió como p & lt; 0,05 (*, #), p. & lt; 0,01 (**)
Resultados
Efectos de la SL142 y SL325 en H4 acetilación
Para analizar la actividad de la histona desacetilasa de SL142 y SL325, se realizó un análisis de inmunotransferencia. La incubación de las células H441 durante 24 horas con SAHA, SL142 y SL325 causó un aumento dependiente de la dosis en la histona H4 acetilación. Tanto SL142 y SL325 demostraron fuerte acetilación H4 de SAHA a concentraciones de 0,5 mM y 2,0 mM. SL142 causó un aumento mucho mayor de la acetilación de histonas H4 que SL325 a una concentración de 2,0 M (Fig. 1B). Estos resultados demuestran que tanto SL142 y SL325 aumento de acetilación de histonas H4 más de SAHA [22] en las células H441 de cáncer de pulmón.
SL142 y SL325 suprimió de forma significativa la viabilidad celular en H441 y de pulmón A549 células cancerosas
con el fin de analizar el efecto antitumoral de los inhibidores de HDAC, se midió la viabilidad celular mediante el ensayo de MTS después del tratamiento con SAHA, SL142 y SL325 en H441, A549 y las células de cáncer de pulmón H1299. El ensayo de viabilidad celular reveló que todos los inhibidores de HDAC (SAHA, SL142 y SL325) suprimió fuertemente la viabilidad celular de H441, A549 y las células de cáncer de pulmón H1299 a una concentración de 10 mM. En concentraciones más bajas (0,5 a 5,0 M), tanto SL142 y SL325 suprimen significativamente la viabilidad de las células de H441 y células de cáncer de pulmón A549 (Fig. 1C). Estos resultados sugieren que SL142 y SL325 son más eficaces en la supresión de la viabilidad celular de H441 y células de cáncer de pulmón A549 que SAHA y en concentraciones más bajas.
SL142 y SL325 aumentó significativamente la apoptosis caspasa-3 actividad inducida en H441 y A549 células de cáncer de pulmón
Se analizó la actividad de caspasa-3 y la apoptosis en H441, células A549 y de cáncer de pulmón H1299 después del tratamiento con inhibidores de HDAC. SAHA, SL142 y SL325 aumento de la actividad caspasa-3 en todos los tipos de células. Significativamente, SL142 y SL325 indujeron una mayor actividad de la caspasa-3 (2.25- a 2,48 veces) que SAHA (1.42- a 1,66 veces) en H441 y células de cáncer de pulmón A549 (Fig. 2A). A continuación se investigó la apoptosis inducida por los inhibidores de HDAC en células de cáncer de pulmón. Como se muestra en la Fig. 2B, SL142 y SL325 indujeron más sub-G
0 /G contenidos
1 ADN (51,36 a 55,81% y 35,07 a 43,80% respectivamente) que SAHA (10,47-12,12%) en H441 y células de cáncer de pulmón A549 después de un tratamiento de 72 horas. Sin embargo, estos inhibidores de HDAC inducen menos la apoptosis en células de cáncer de pulmón H1299. Estos resultados sugieren que SL142 y SL325 aumentar más eficazmente la actividad de la caspasa-3 e inducen la apoptosis en más H441 y células de cáncer de pulmón A549 que SAHA.
A. El análisis de la actividad de caspasa-3 en el A549, H441 y H1299 células de cáncer de pulmón después de SAHA, SL142 y SL325 tratamiento. Las células se trataron con SAHA, SL142 o SL325 a una concentración de 2,5 mM durante 36 horas. Se realizaron experimentos por triplicado; datos representan la media de aumento veces ± S. E. Diferencia significativa a partir de células tratadas con PBS y las células tratadas con inhibidores de HDAC se indican fue demostrado (* p & lt; 0,05, ** & lt; 0,01). Análisis de citometría de B. El flujo de la apoptosis inducida por SAHA, SL142 o SL325. Las células se infectaron con SAHA, SL142 o SL325 a la concentración de 2,5 mM durante 72 horas y sub-G
0 /G
contenido de ADN 1 se midió por tinción con yoduro de propidio y análisis citométrico de flujo.
ATRA o
9-cis AR
mejorado la actividad de caspasa-3 inducida por SL142 o SL325 y el aumento de la apoptosis en células de adenocarcinoma pulmonar H441
Para analizar el efecto de la combinación de ácidos retinoico con SL142 o SL325, hemos examinado la actividad de caspasa-3 y sub-G
0 /G contenidos
1 ADN utilizando tinción con yoduro de propidio con citometría de flujo y la actividad de caspasa-3 después de un tratamiento único o combinado. Como se muestra en la Fig. 3A, tanto ATRA y
9-cis RA
indujo ninguna actividad de la caspasa-3, mientras que un solo tratamiento de SAHA, SL142 o SL325 significativamente aumentó la caspasa-3 actividad (1.38- a 2,13 veces) en células de adenocarcinoma pulmonar H441 . Es importante destacar que, el ácido retinoico mejora la actividad de caspasa-3 inducida por SAHA, SL142 o SL325 y la combinación de ATRA o
9-cis
RA, y SL142 o SL325 aumentó la caspasa 3-actividad (2.47- a 2,91 veces) más de ATRA o
9-cis
AR y SAHA solo (1.90- a 2,04 veces). 100 mu M de zVAD-fmk inhibieron eficazmente la actividad de la caspasa-3 en todos los experimentos. A continuación, se determinó la cantidad de apoptosis inducida por los inhibidores de HDAC en células de cáncer de pulmón. Sub-G
0 /G
1 el contenido de ADN se aumentó a 5,98% a 8,58% después de un solo tratamiento de ácidos retinoico o inhibidores HDAC. Sin embargo el tratamiento combinado de SAHA y ATRA o
9-cis
RA aumentó sub-G
0 /G
1 el contenido de ADN de 22,37% y 23,36%, respectivamente. Por otra parte, SL142 y ATRA o
9-cis
RA aumentó sub-G
0 /G
1 ADN contenido al 32,82% y el 56,92% y el SL325 y ATRA o
9-cis
RA aumentó el contenido de 26,18% y 49,33%, respectivamente (Fig. 3B). El sub-G
0 /G
1 el contenido de ADN inducida por el tratamiento único o combinación en fibroblastos de pulmón humano normal (NHLF) fue de menos de H441 células (datos no presentados). El análisis morfológico mostró que más de la muerte celular se indujo después de que el tratamiento combinado de SL142 y ATRA o
9-cis AR
que las de un solo uso (Fig. 3C). Estos resultados sugieren que el ATRA o
9-cis
aumento de la AR actividad de caspasa-3 y la apoptosis inducida por SAHA, o SL142 SL325.
A. Análisis de la actividad de caspasa-3 inducida por ATRA o
RA
9-cis (2,5 M) y /o SAHA, SL142 o SL325 (0,5 M) en células de cáncer de pulmón H441. Las células se trataron con SAHA, SL142 o SL325 a la concentración de 2,5 mM durante 36 horas. Después de 36 horas de tratamiento,
0 /G
1 el contenido de ADN sub-G se midió mediante tinción con yoduro de propidio y análisis de citometría de flujo. Se realizaron experimentos por triplicado; datos representan la media de aumento veces ± S. E. * Diferencia significativa, a partir de células de control (células sin tratamiento) (p & lt; 0,05). Análisis de citometría de B. El flujo de la apoptosis inducida por ATRA o
9-cis
RA (2,5 M) y /o SAHA, SL142 o SL325 (0,5 M) en células de cáncer de pulmón H441. Después de 96 horas de tratamiento,
0 /G
1 el contenido de ADN sub-G se midió mediante tinción con yoduro de propidio y análisis de citometría de flujo. C. El análisis morfológico de las células H441 después de ATRA o
9-cis AR
(2,5 M) y /o SL142 (0,5 M) de tratamiento.
Efectos del tratamiento de combinación de ácidos retinoico y SL142 SL325 o en la supresión de la formación de colonias de células de cáncer de pulmón H441
Para analizar el efecto antitumoral del tratamiento de combinación de ATRA o
página 9-cis AR y SL142 o SL325, un ensayo clonogénico se realizó. Como se muestra en la Fig. 4A y 4B, ATRA o
9-cis RA
débilmente a suprimir la formación de colonias de células de cáncer de pulmón H441 (69,1-78,0%), mientras que suprimir SAHA, SL142 o SL325 más fuertemente la formación de colonias (40,2-69,4%). De manera significativa, ATRA o
9-cis
RA aumentó el efecto antitumoral de SAHA, o SL142 SL325 especialmente cuando se combina con SL142 o SL325 y ATRA o
9-cis AR
la formación de colonias suprimida drásticamente (2,52 a 13,22%). Estos resultados sugieren que el tratamiento de combinación de SL142 o SL325 y ATRA o
9-cis
RA inhibe sinérgicamente la formación de colonias de células de cáncer de pulmón H441.
A. La formación de colonias de células H441 tratadas con ATRA o
RA
9-cis (2,5 M) y /o SAHA, SL142 o SL325 (0,5 M) durante 36 horas. El ensayo se inició mediante siembra de 2 × 10
3 células por platos de 100 mm. Después de 16 días, las células se fijaron y se tiñeron con cristal violeta. se muestran imágenes representativas de experimentos realizados por triplicado. número de colonias B. medios se derivan de la cuantificación de platos por triplicado para cada tratamiento y la citotoxicidad-porcentaje específico en comparación con la formación de colonias en el grupo de DMSO (control) se calculó. *, P. & Lt; 0,05 frente a agentes individuales
El tratamiento combinado de SL142 o SL325 y ATRA o
9-cis AR
incrementa sinérgicamente la actividad transcripcional de RARE, pero no altera la expresión de RAR y RXR
Para analizar la actividad transcripcional del elemento sensible a ácido retinoico (RARE) después del tratamiento de la SL142 o SL325 y ATRA o
9-cis
RA, que generó un constructo de luciferasa impulsado por siete repeticiones en tándem del elemento raro: pGL4. 7x RARE [20], [21]. pGL4. RARO 7x genera una importante actividad promotora (5.26- 17.11 a veces) después de la administración de 2,5 M ATRA o tratamientos con AR
9-cis en células de cáncer de pulmón H441. Sin embargo, la construcción mostró poca actividad transcripcional después de 0,5 M de SAHA, SL142 SL325 o el tratamiento de las células (1.26- 1.43- a veces). Es importante destacar que, SL142 y SL325 mejorado más significativamente la actividad promotora de RARE después del tratamiento de ATRA o
9-cis
AR. (29.94- 37.42 a veces, 55.58- 60.14 a veces, respectivamente) en comparación con SAHA (14.99- 24.65 a veces) (Fig. 5A). Sin embargo, como se muestra en la Fig. 5B, el análisis de inmuno blot demostró que poco cambio se observó en la expresión de RAR RARβ, la expresión de RXR y RXRβ después del tratamiento único o combinación en células de cáncer de pulmón H441.
A. reportero ensayos de transfección transitoria en células H441 con pGL4. o pGL4.RARE 7x (2 g), más pCMV. β-galactosidasa (2 g) después de ácidos retinoicos (2,5 M) y /o SL142 o SL325 (0,5 M) de tratamiento ácidos retinoico. Los resultados se presentan como veces de inducción de unidades relativas de luz normalizada a ß-galactosidasa actividad relativa a la observada para las construcciones de control.
#, una diferencia significativa de la actividad del promotor generada por pGL4.RARE 7x después de ATRA y SAHA tratamiento (p & lt; 0,05). células *, una diferencia significativa de la actividad del promotor generada por pGL4.RARE 7x después
9-cis
RA y SAHA tratados (p & lt; 0,05). B. Análisis de inmunotransferencia de RAR, RARβ, RXR y RXRβ expresiones después de ácidos retinoico y /o SL142 SL325 o el tratamiento de las células de cáncer de pulmón H441. células de cáncer de pulmón humano se cosecharon 24 horas después del tratamiento con ATRA o
9-cis
RA (2,5 M) y /o SAHA, SL142 o SL325 (0,5 M). β-actina se muestra como control.
El tratamiento de combinación con o SL142 SL325 y ATRA o
9-cis
RA aumenta la expresión de Bax en células de cáncer de pulmón H441
a fin de investigar el mecanismo del efecto antitumoral inducida por el tratamiento de combinación de ATRA o
9-cis
RA y SL142 o SL325, se analizó la expresión de p21, p27 y Bax en las células H441 de cáncer de pulmón. Como se muestra en la Fig. 6A, la expresión de p21 se incrementó significativamente después del tratamiento SL142 (Fig. 6A, carriles 7-9). Después de 9 CISRA, el tratamiento SAHA o tratamiento de combinación con SAHA y los retinoides aumento de la expresión de p27 (Fig. 6A, carriles 1-6) según lo informado por otros [16], sin embargo, ningún cambio significativo se observó en la expresión de p27 tras el tratamiento o SL142 SL325 o el tratamiento combinado de SL142 o SL325 y los retinoides (Fig. 6A, carriles 7-12). Es importante destacar que la expresión de Bax se incrementó 24 horas después de SL142 SL325 o tratamiento (Fig. 6A, carril 7, 10) y ATRA o
9-cis
RA aumentó la expresión (carril 8, 9, 11,12) en células H441. El tratamiento combinado de
9-cis
AR y SL325 también aumentó la expresión de Bax (carril 6). A continuación, analizamos la actividad del promotor Bax después del tratamiento de combinación usando el constructo de luciferasa que contiene la región del promotor Bax: pGL4. Bax. Como se muestra en la Fig. 6B, la activación del promotor Bax se mantuvo (3.58- a 6,07 veces) después de un solo tratamiento de inhibidores de HDAC o ácidos retinoico en las células de cáncer de pulmón H441. Es importante destacar que, SAHA mejora la actividad del promotor Bax inducida por ATRA o
RA
9-cis (6.27- 8.74 a veces) y SL142 y SL325 mejorado aún más (10.14- 18.44 a veces). Estos resultados sugieren que el tratamiento de combinación de SL142 o SL325 y ATRA o
9-cis
RA puede aumentar la actividad transcripcional del promotor Bax y inducir la expresión de Bax en células de cáncer de pulmón H441
.
A . El análisis por inmunotransferencia de RAR, RARβ, RXR y RXRβ expresiones después de ácidos retinoicos y /o SL142 o tratamiento SL325 en células de cáncer de pulmón H441. células de cáncer de pulmón humano se cosecharon 24 horas después del tratamiento con ATRA o
9-cis
RA (2,5 M) y /o SAHA, SL142 o SL325 (0,5 M). β-actina se muestra como control. B. transitorios reportero ensayos de transfección en células H441 con pGL4. o pGL4.Bax (2 g), más pCMV. β-galactosidasa (2 g) después de ácidos retinoicos (2,5 M) y /o SL142 o SL325 (0,5 M) de tratamiento ácidos retinoico. Los resultados se indican como Fig. 6A. *, Una diferencia significativa de la actividad del promotor generada por pGL4.Bax después de ATRA o
9-cis
RA (2,5 M) o SAHA, SL142 o SL325 (0,5 M) (p & lt; 0,05).
Discusión
el cáncer de pulmón es la causa más común de muertes relacionadas con el cáncer en todo el mundo [23]. El tratamiento del cáncer de pulmón con quimioterapia ha prolongado la supervivencia, sin embargo, los beneficios clínicos con estos agentes se limita a los pacientes en buen estado de salud y los que están en las primeras etapas. Sin embargo, todos los tratamientos de quimioterapia también tienen efectos secundarios indeseables para el paciente [24]. Recientemente, las moléculas pequeñas se han desarrollado para el tratamiento de cáncer de pulmón en pacientes portadores de tales genes mutados como genes de fusión de EGFR y EML4-ALK. Estas pequeñas moléculas están diseñados para apuntar a los dominios de quinasa de los genes mutados e inhibir su actividad [25], [26]. Sin embargo, dicha terapia molécula pequeña no es adecuado para la mayoría de los eventos de cáncer de pulmón, incluyendo el cáncer causado por un gen KRAS mutado [27]. Claramente, se necesita más investigación de nuevos agentes, tolerados con nuevos mecanismos de acción urgente con el fin de mejorar la duración y calidad de vida de esta gran población de pacientes
.
Los inhibidores no selectivos de las histonas desacetilasas humanos (HDAC) son tienen actividad antitumoral
in vivo
, y varios de ellos son menores de ensayos clínicos [9], [28], [29], [30], [31], [32], [33], [34], [35], [36]. La primera de ellas, SAHA ha sido aprobado para el tratamiento del linfoma cutáneo de células T y también se ha informado de que SAHA tiene un efecto antitumoral contra las células de cáncer de pulmón [37], [38]. Anteriormente, hemos desarrollado novela amida que soportan los derivados del ácido hidroxámico como inhibidores de HDAC de clase selectivo denomina SL142 y SL325 (fig. 1A) y se informó que estas pequeñas moléculas muestran HDAC1, HDAC4 y HDAC6 actividad inhibitoria más significativa en las células de cáncer de próstata humano LNCaP que SAHA [17]. Las concentraciones inhibitorias medias máximas (IC50) de SL-142 contra HDAC1, HDAC4 y HDAC6 son 69 ± 5 nM, 53 ± 2 nM, y 260 ± 70 nM. Los IC50 de SL-325 contra HDAC1, HDAC4 y HDAC6 son 120 ± 4 nM, 65 ± 4 nM, y 310 ± 50 nm. En contraste las CI50 del ácido hidroxámico utilizado clínicamente HDAC inhibidor suberoilanilida ZolinzaTM contra HDAC1 y HDAC4 son mucho más altos en 290 ± 50 nM, 340 ± 30 nM, y comparable a HDAC6 a 200 ± 10 nM. Por lo tanto, estos compuestos presentan actividad inhibidora más potente en HDAC1 y HDAC4 y actividad inhibidora comparable HDAC6, en comparación con el ácido usado clínicamente inhibidor de HDAC suberoilanilida hidroxámico (ZolinzaTM) [18], [19].
En el presente estudio , SL142 y SL325 mostraron actividad inhibidora CDAV más significativa (actividad HAT) en células de cáncer de pulmón H441 (Fig. 1B) y suprimen la viabilidad tumoral en H441 y células de cáncer de pulmón A549 que SAHA (Fig. 1C), indicando que SL142 y SL325 son más inhibidores de HDAC eficaces que SAHA. En nuestro informe anterior, SL142 y SL325 mostraron significativa la actividad del promotor de p21 y la actividad citostática en células de cáncer de próstata LNCaP [17]. Sin embargo, en este estudio, estas pequeñas moléculas también indujeron significativa la actividad de caspasa-3 y subG
0 /G
1 población en H441 y células de cáncer de pulmón A549. Estos resultados sugieren que SL142 y SL325 podrían inducir apoptosis en el cáncer de pulmón.
ácidos retinoico modular, premalignas, y los fenotipos de células malignas normales por los cambios en la expresión de genes que están mediadas a través de la unión a dos clases de receptores de hormonas nucleares, la RARs y RXRs los. ATRA se une RAR con alta afinidad pero no se une a RXR, mientras que
9-cis
RA es un ligando que se une y transactivates ambos RAR y RXR [39], [40]. ácidos retinoico regulan la diferenciación en el epitelio de las vías respiratorias y suprimen la carcinogénesis del cáncer de pulmón y cáncer de cabeza y cuello [41], [42], [43]. Es importante destacar que, se ha informado de que el tratamiento de combinación de inhibidores de la HDAC y ácidos retinoicos aumento de la actividad anti-tumor en las células malignas [44], [45], [46], [47]. Además, Epping et al. informó de que la vía del receptor de ácido retinoico (RAR) está dirigido por el inhibidor de HDAC y que el efecto antitumoral de un inhibidor de HDAC en células tumorales es, en parte, a través de la desrepresión de ácido retinoico [48]. En nuestro estudio, el tratamiento combinado de SL142 SL325 o con estos ácidos retinoico aumenta sinérgicamente la apoptosis y la formación de colonias suprimida en las células (Fig. 3A, 3B, 4A y 4B). Además, la actividad transcripcional generada por RARE después de que el tratamiento de combinación fue mucho mayor que la de un solo tratamiento (Fig. 5A). RAR es conocida para formar un heterodímero con RXR y se une a un elemento de respuesta a ácido retinoico (RARE) [49], [50]. Sin embargo, la expresión de estos receptores no se aumentó después del tratamiento en las células de cáncer de pulmón H441 (Fig. 5B) [45], [51]. Ambos ácidos retinoicos y los inhibidores de HDAC han sido reportados para activar ciclo celular o genes relacionados con la apoptosis e inducir la diferenciación celular o la apoptosis en células de cáncer [52], [53], [54], [55], [56], [57], [58], [59], [60], [61]. En nuestro informe, la expresión de p21 se incrementó claramente después del tratamiento SL142 en células H441 de cáncer de pulmón y más importante, se aumentó la expresión de Bax después de que el tratamiento de combinación de inhibidores de la HDAC y ácidos retinoicos. La expresión de p27 no se cambió después de SL142 o SL325 y /o tratamiento con retinoides [16]. El promotor del gen p21 contiene un RARE funcional [62] y esto es consistente con nuestros resultados (Fig. 5A). Sin embargo, p21 fue originalmente identificado como una molécula que regula la transición de la fase G1 a la fase S del ciclo celular y la sobreexpresión de p21 se ha demostrado que induce la diferenciación de diversas células en lugar de inducir la caspasa 3-actividad y la apoptosis [63] , [64], [65], [66]. Por otra parte más de la expresión de Bax induce la caspasa 3-actividad y la apoptosis en muchos tipos de células [67], [68], [69]. En este estudio, el tratamiento de combinación de SL325 y ácidos retinoicos indujo significativamente la muerte celular en células H441 de cáncer de pulmón. Sin embargo, el tratamiento de combinación casi no aumentó la expresión de p21 (Fig. 6A). Como se muestra en la Fig. 6A, la expresión de p53 no se alteró después del tratamiento y no pequeñas de cáncer de pulmón de células H441 portan p53 mutado. Estos resultados sugieren que hasta la regulación de Bax puede tener un papel crucial en el efecto antitumoral de la combinación de tratamiento o SL142 SL325 y ATRA o
células cancerosas 9-cis AR en
H441 de pulmón [54] y fue hasta Bax regulado en vía independiente de p53. Como se muestra en la Fig. 6A, la expresión de p53 no se alteró después del tratamiento y no pequeñas de cáncer de pulmón de células H441 portan p53 mutado. Por otro lado, como se muestra en la Fig. 1C y Fig.