Extracto


Pinus massoniana
proantocianidinas de corteza (PMBPs), una componente activo aislado de
Pinus massoniana corteza
, se ha informado que poseen una amplia gama de propiedades bioquímicas. A continuación, se investigó el efecto antitumoral de PMBPs sobre el cáncer de ovario. Los resultados indicaron que PMBPs redujo significativamente el crecimiento de células de cáncer de ovario y la apoptosis dependiente de la dosis inducida. Los mecanismos subyacentes implicados fueron aclarados para incluir la pérdida de potencial de membrana mitocondrial, la regulación por disminución de la proteína anti-apoptótica de Bcl-2 y la activación de la caspasa 3/9, lo que sugiere que PMBPs desencadena la apoptosis a través de la activación de la vía apoptótica mitocondria asociada. Además, la cicatrización de heridas y transwell ensayos de cámara de revelaron que PMBPs podrían suprimir la migración y la invasión de células de cáncer de ovario. PMBPs dramáticamente inhibe la actividad de MMP-9 y de expresión, bloquearon la actividad de NFkB y la activación de ERK1 /2 y p38 MAPK. Nuestros hallazgos sugieren que PMBPs tiene el potencial para ser desarrollado como un fármaco antitumoral para el tratamiento del cáncer de ovario y /o manejo de enfermedades

Visto:. Liu J, J Bai, Jiang G, X Li, Wang J, Wu D, et al. (2015) Efecto antitumoral de
Pinus massoniana
Corteza proantocianidinas sobre el Cáncer de ovario a través de la inducción de la apoptosis de las células y la inhibición de la migración celular. PLoS ONE 10 (11): e0142157. doi: 10.1371 /journal.pone.0142157

Editor: Yi-Hsien Hsieh, Instituto de Bioquímica y Biotecnología, TAIWAN

Recibido: 1 de mayo de 2015; Aceptado: 19 Octubre 2015; Publicado: 5 Noviembre 2015

Derechos de Autor © 2015 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel

Financiación:. Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No.81302282) (URL: http://www.nsfc.gov.cn/). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el cáncer de ovario sigue siendo el quinto tipo de cáncer más común en las mujeres y la principal causa de muerte en los tumores malignos ginecológicos [1] .El tratamiento de primera línea del cáncer de ovario suele ser la cirugía tradicional en combinación con quimioterapia basada en platino-paclitaxel [2]. A pesar de la buena respuesta inicial en la mayoría de los pacientes con cáncer de ovario, la tasa de supervivencia a 5 años es aún baja debido a relapses- una ocurrencia común después del tratamiento de primera línea [3]. Ha habido pocos avances en el tratamiento del cáncer de ovario ya que la normalización de cisplatino y paclitaxel drogas en los últimos 20 años [4]. Hay una necesidad urgente de desarrollar nuevos fármacos eficaces para el tratamiento del cáncer de ovario.

En la actualidad, algunos fitoquímicos bioactivos naturales se utilicen para impedir la proliferación o la metástasis de las células cancerosas [5]. Tal fitoquímico no son tóxicos y carente de efectos secundarios, por lo que son buenas alternativas y /o complementarias a la quimioterapia citotóxica convencional [5]. El extracto de corteza de pino se consideraba anteriormente un producto de desecho inconveniente en la industria de la madera, pero ahora reconocido como rica en proantocianidinas naturales con potenciales propiedades medicinales [6]. Se ha demostrado que las proantocianidinas se pueden emplear para prevenir tumor debido a su capacidad para modular la actividad de múltiples objetivos implicados en la carcinogénesis [7]. Por lo tanto, la actividad antitumoral del extracto de corteza de pino ha recibido la mayor atención recientemente.


Pinus massoniana
Cordero de la familia Pinaceae es nativo del sur y suroeste de China. Su corteza se ha utilizado en la medicina tradicional china para el tratamiento de la inflamación, artralgia, el reumatismo y el cáncer [8]. El componente principal de
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corteza es también proantocianidinas. Su actividad anti-tumor se ha demostrado en las células Hep G2 de hepatoma humano, células HeLa de cáncer de cuello uterino y las células S180 sarcoma murino [9,10,11]. Sin embargo, los efectos de
Pinus massoniana
proantocianidinas de corteza (PMBPs) en el cáncer de ovario y de los mecanismos que subyacen al proceso aún no se han delineado
.
En este estudio, se evaluó si las proantocianidinas de
Pinus massoniana
corteza podría ejercer efectos antitumorales sobre las células del cáncer de ovario y más investigado los mecanismos detallados que subyacen a este proceso. Nuestros datos pueden proporcionar una base para el futuro desarrollo de PMBPs como un fármaco eficaz para el tratamiento del cáncer de ovario.

Materiales y Métodos

Materiales, reactivos y productos químicos

Los anticuerpos contra caspasa -3, caspasa-9, Bcl-2 se adquirieron de Cell Signaling Technology (Denver, MA). Los anticuerpos contra MMP-9, NFkB, I? B? Y β-actina se obtuvieron a partir de proteínas Tech Group, Inc. (Chicago, EE.UU.). Los anticuerpos contra I? B? Fosforilada, ERK1 /2, p38 y JNK se obtuvieron de Sangon Biotech, China. El kit de quimioluminiscencia potenciada (ECL) se adquirió de Amersham Life Science, Inc. (Estados Unidos). La anexina V conjugada con FITC kit de detección de apoptosis y JC-1 membrana mitocondrial kit potencial de detección fueron adquiridos de NanJing KeyGen Biotech Co., Ltd (Nanjing, China). Cultivos polarizados se compraron de BD Biosciences (San José, EE.UU.). MTT (3- (4,5-dimetil-2-il) -2,5-difenil tetrazolio bromuro) y DAPI (2- (4-amidinofenil) dihidrocloruro -6-indolecarbamidine) se obtuvieron de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). PMBPs polvo se adquirió de Shaanxi Sciphar alta tecnología Industry Co., Ltd (Shanxi, China). Que contenía aproximadamente 95% de proantocianidinas y estable durante al menos dos años a 4 ° C.

Líneas celulares y cultivo celular

El cáncer de ovario de células línea A2780 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC ) y se cultivaron en medio DMEM suplementado con 10% FBS (ambos adquiridos de Gibco BRL, Grand Island, NY, EE.UU.). OV2008 fue proporcionado amablemente por el Prof. Shiying Cui (Universidad Médica de Dalian, China) y se hizo crecer en medio RPMI-1640 (Invitrogen, Burlington, ON, Canadá) suplementado con 10% de SFB. línea de células epiteliales de ovario normal IOSE80 se obtuvo por tejido ovárico Canadian Bank y cultivar en medio 199 (Invitrogen) y MCDB 105 (Sigma) suplementado con 10% FBS. Cuando las células eran 80% confluentes, que se recogieron por tripsinización 0,25%. Las células se trataron con diferentes concentraciones de PMBPs con controles correspondientes apropiados.

viabilidad de las células de ensayo

El efecto de PMBPs sobre la viabilidad de las células se detecta mediante el ensayo de MTT. Las células (1 × 10
4 /pocillo) fueron sembradas en placa de 96 pocillos y se incubaron durante 24 h. A continuación se añadieron 200 l de medio que contiene 0, 10, 25, 50, 75, 100 y 120 PMBPs g /ml en cada pocillo. Cada concentración de PMBPs era sextuplicado. Después de 24 h y 48 h de tratamiento PMBPs, 20 MTT l (/ml en PBS 5 mg) se añadió a cada pocillo y se incubó durante 4 h. La solución de MTT se eliminó y los cristales de formazán se disolvieron en 150 l de DMSO. Absorbancia de la solución se midió utilizando un lector de placas Multiskan Ascent a 540 nm de longitud de onda.

DAPI ensayo

Aproximadamente 4 × 10
4 células /pocillo de células de cáncer de ovario se sembraron en placa de 6 pocillos y posteriormente tratado con PMBE a los 0, 25, 50 y 100 mg /ml durante 24 h. Las células en cada uno de los pocillos se tiñeron con DAPI antes de fijar con un 3,7% de formaldehído. Después, las células se lavaron con PBS y se analizaron por microscopía de fluorescencia.

Cell apoptosis por citometría de flujo

Después del tratamiento con 0, 10, 25, 35 y 50 PMBPs ml mg /h por 24, se recogieron las células de cáncer de ovario y se lavaron con PBS tres veces, y luego se incubaron con anexina V-FITC y PI de 10 min en la oscuridad. Las células fueron detectados por un flujo FACS /Calibur citómetro (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EE.UU.).

Ensayo para el potencial de membrana mitocondrial

Los cambios de potencial de membrana mitocondrial de las células de cáncer de ovario fueron detectados por citometría de flujo utilizando JC-1 kit de detección. Después del tratamiento con 0, 25, 35, 50 g /PMBPs ml durante 24 h, se cosecharon y se incubaron con JC-1 de colorante durante 15 min a 37 ° C de acuerdo con el protocolo del fabricante células. Las células fueron detectados por un flujo FACS /Calibur citómetro.

cicatrización de heridas ensayo

A2780 y células OV2008 se sembraron en placas de 6 pocillos y se hicieron crecer para crear una monocapa confluente. La monocapa celular se rascó en una línea recta con una punta de pipeta P200 l. Las placas se lavaron con PBS para eliminar las células desprendidas y después se incubaron con medio de crecimiento completo que contiene 0, 5, 10 y la solución de 25 mg /ml PMBPs para 24 h. La migración celular se observó bajo un microscopio de contraste de fase a 100 aumentos, a 0 y 24 h después de la inducción de la lesión. Las células migradas en el área denudada en cada uno de los seis campos al azar fueron medidos y cuantificados usando un microscopio asistida por ordenador.

Transwell ensayo de cámara de

La migración celular y la invasión se cuantificaron mediante el ensayo de cámara transwell. células de cáncer de ovario fueron tratados con PMBPs ml 0, 5, 10 y 25 g /por 24 h y se recogieron. 1 × 10
se añadieron 5 células en DMEM libre de suero a cada cámara superior y DMEM con 10% FBS se añadió a la cámara inferior como un quimioatrayente. Después de 24 h de incubación a 37 ° C, las células restantes en la superficie superior de la membrana se retiraron y las células que migraron al lado inferior de la membrana se tiñeron con 0,1% de cristal violeta durante 10 minutos. Las células migradas en la parte inferior de la membrana se contaron bajo un microscopio a 100 × magnificación. Seis campos aleatorios de cada membrana Transwell se contaron y promediaron.

Gelatina zymography

La actividad de la MMP-9 se detectó mediante zimografía de gelatina. Las células tumorales se trataron con 0, 5, 10, 25 mg /ml PMBPs durante 24 h. A continuación, se recogió el medio de células y se centrifugó para eliminar los restos celulares. Un volumen igual de medio clarificado se sometió a electroforesis a través de 10% de gel de SDS-PAGE que contiene 0,1% de gelatina (v /w) a 4 ° C. El gel se lavó con tampón de lavado (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 100 mM y 2,5% de Triton X-100) y posteriormente se incubaron en tampón de activación (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 150 mM, 10 mM CaCl
2, 0,02% NaN
3 y 1 mM ZnCl
2) a 37 ° C durante la noche. A continuación, el gel se tiñó con 0,25% (w /v) azul brillante de Coomassie en 45% (v /v) de metanol y 1% (v /v) de ácido acético y se destiñó con 10% de isopropanol /ácido acético 10% (v /v ) solución. No se observaron bandas de MMP-9 a 92 kDa.

Preparación de lisado celular total y la fracción
nucleares
Para lisado total de células, las células se homogeneizaron en tampón RIPA (Beyotime, Jiangsu, China). Los lisados ​​celulares se centrifugaron a 12.000 rpm durante 10 min a 4 ° C y se recogió el sobrenadante. fracción nuclear se extrajo mediante un método modificado (Yeh, 2012). Brevemente, las células se trataron con tampón A (HEPES 10 mM, KC1 10, EDTA 0,1 mM, MgCl2 1,5 mM, 0,2% NP-40, 1 mM DTT, y 0,5 mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo) y gránulos nucleares se recogieron por centrifugación a 3000 rpm durante 30 s a 4 ° C. La fracción nuclear se extrajo por tampón B (HEPES 20 mM, 25% de glicerol, MgCl mM 1.5
2, EDTA 0,1 mM, NaCl 420 mM, DTT 1 mM, y 0,5 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo).

Western blot ensayo

Los lisados ​​de células totales o extractos nucleares fueron separados por 10% SDS-PAGE y luego se transfiere a una membrana de nitrocelulosa mediante un aparato semi-seco por 1 h. La membrana se bloqueó con leche desnatada al 5% durante 1 h y después se incubó con la solución de anticuerpo primario específico durante la noche a 4 ° C. Después de la incubación con el anticuerpo anti-especie secundaria apropiada durante 1 h, las bandas de proteínas se visualizaron por ECL kit.

El análisis estadístico

Los datos fueron analizados estadísticamente mediante la prueba t de Student y presentado como media ± SD para tres experimentos independientes. el software SPSS 15.0 fue utilizado para los análisis. El valor de P & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa

Resultados

Los efectos de PMBPs sobre la viabilidad de las células de cáncer de ovario

Los efectos de PMBPs sobre la viabilidad de ovario. las células cancerosas y las células de ovario normales se detectaron en primer lugar mediante el ensayo de MTT. Ováricos cáncer células A2780 y OV2008, así como células de ovario normales IOSE80 fueron tratados con diferentes concentraciones de PMBPs (0, 10, 25, 50, 75, 100, 120 mg /ml) durante 24 h o 48 h. células de cáncer de ovario después del tratamiento PMBPs mostraron una reducción dramática de la viabilidad celular de 25 g /ml en una forma dependiente de la dosis (
P
& lt; 0,01), mientras mismas concentraciones no afectaron significativamente la viabilidad de las células de ovario normales IOSE80 (Fig 1A). El valor IC50 de PMBPs fue de 48 ± 2,4 g /ml para A2780 y 67 ± 2,7 g /ml para OV2008 a las 48 h (Fig 1A).

células de cáncer ovárico A2780 (A) y OV2008 y ovárica normal células IOSE80 fueron tratados con PMBPs (0, 10, 25, 50, 75, 100, 120 mg /ml) durante 24 h o 48 h. la viabilidad de las células en las diversas concentraciones de PMBPs se detectaron mediante el ensayo de MTT y se expresó en relación con la de las células no tratadas. Los experimentos se repitieron tres veces. (B) células de cáncer ovárico A2780 y OV2008, y células de ovario normales IOSE80 fueron tratados con PMBPs (0, 25, 75, 100 g /ml) durante 24 h, y las células se fotografiaron con un microscopio de contraste invertido (aumentos, 40 aumentos).

Además, los cambios morfológicos de las células de cáncer de ovario se examinan bajo un microscopio de contraste de fase. Las células A2780 y OV2008 cultivadas sin PMBPs muestran característica forma normal con un 70% de confluencia después de 24 h. Sin embargo, la confluencia de las células se redujo drásticamente con cambios morfológicos evidentes por tratamiento PMBPs. Las células comenzaron a disminuir, pierden su forma normal, se convirtió en redondo y en última instancia separada de la placa de cultivo (Figura 1B). Por el contrario, no se observaron tales cambios morfológicos en las células ováricas normales, IOSE80, después del tratamiento PMBPs (Figura 1B). En conjunto, estos datos indican que PMBPs inhiben selectivamente la viabilidad de las células de cáncer de ovario con menos efecto sobre las células no malignas.

PMBPs inducen ovario células cancerosas de la apoptosis

Para evaluar si los efectos antitumorales de PMBPs en las células A2780 y OV2008 estaban asociados con la apoptosis, las células de cáncer de ovario se tiñeron con DAPI y se observaron bajo un microscopio de fluorescencia (Fig 2A). Después del tratamiento con diferentes concentraciones de PMBPs durante 24 h, condensación de la cromatina nuclear y la puntuación fragmentada fluorescencia nuclear azul se observaron en células de cáncer de ovario en una forma dependiente de la dosis, similares a los cambios morfológicos en las células apoptóticas, pero las células de control muestran normal y núcleos intactos. Sugiere que PMBPs pueden inducir la apoptosis de células de cáncer de ovario.

(A) A2780 y células OV2008 fueron tratados con PMBPs (0, 25, 50, 100 mg /ml) durante 24 h. Los cambios morfológicos de los núcleos fueron examinados por microscopía de fluorescencia utilizando tinción DAPI. Las flechas indican la condensación nuclear y cuerpos apoptóticos (ampliación, 100 ×). células A2780 y OV2008 (B) fueron tratados con PMBPs (0, 10, 25, 35, 50 mg /ml) durante 24 h. La citometría de flujo se aplicó para analizar las células teñidas A2780 dobles Anexina V-FITC /PI. La baja derecha (LR) cuadrante de los histogramas indica que las células apoptóticas tempranas, y la parte superior derecha (UR) cuadrante indica que las células apoptóticas y necróticas finales. (C) El tratamiento de células A2780 y OV2008 con PMBPs resultó en incremento dramático en el porcentaje de células apoptóticas y necróticas (incluyendo apoptosis temprana, apoptosis tardía y necrosis). Los experimentos se repitieron tres veces.
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01
en comparación con el grupo control

Para cuantificar aún más la apoptosis causada por PMBPs, A2780 y las células fueron marcadas con OV2008 Anexina V-FITC /PI y se analizaron por citometría de flujo. El cuadrante inferior derecho (LR) indica el porcentaje de células apoptóticas tempranas (Anexina V
+ y PI
-) y el cuadrante superior derecho (UR), el porcentaje de finales de apoptosis y las células necróticas (anexina V
+ y PI
+). Los resultados mostraron que PMBPs activan la apoptosis de las células de cáncer de ovario, a partir de 25 g /ml, de una manera dependiente de la dosis (Fig 2B). El porcentaje de células apoptóticas y necróticas total de células A2780 fue de 1,17% en las células de control (CP: 0,2% y UR: 0,97%), 2,46% en las células tratadas con PMBPs 10 g /ml (LR: 2,42% y UR: 0,04% ), 17,63% en las células tratadas con PMBPs 25 g /ml (LR: 16,12% y UR: 1,51%), 49,24% en las células tratadas con PMBPs 35 g /ml (LR: 41,87% y UR: 7,37%) y 77,23% en las células tratadas con 50 PMBPs g /ml (LR: 71,44% y UR: 5,79%) (Fig 2B). Del mismo modo, los de las células OV2008 eran 5,78% en las células de control (CP: 0,83% y UR: 4,95%), 6,46% en las células tratadas con PMBPs 10 g /ml (LR: 1,38% y UR: 5,08%), 21,45% en Las células tratadas con PMBPs 25 g /ml (LR: 13,88% y UR: 7,57%), 59,94% en las células tratadas con PMBPs 35 g /ml (LR: 24,79% y UR: 35,15%) y 55,31% en las células tratadas con 50 g /ml PMBPs (CP: 10.21% y UR: 45,1%) (figura 2B). Nuestros resultados demuestran que PMBPs podrían inducir de forma significativa tanto la apoptosis temprana y tardía en las células de cáncer de ovario (
p Hotel & lt; 0,01) (Fig. 2C)

PMBPs inducir la membrana mitocondrial pérdida potencial

se sabe que los daños mitocondrias durante la apoptosis cambia el potencial de membrana mitocondrial [12]. Para explorar los efectos de PMBPs sobre el potencial de membrana mitocondrial, las células tratadas con PMBPs se detectaron por JC-1 tinte. Como se muestra en la figura 3, el porcentaje medio de células A2780 fluorescencia positiva verdes fue 2,41% sin tratamiento, 20,63% a los 25 g /ml, 43,77% a 35 mg /ml y 66,6% a /tratamiento PMBPs ml 50 g. Del mismo modo, los de las células OV2008 eran 0% sin tratamiento, 36,28% a los 25 g /ml, 43,81% a 35 mg /ml y 78,79% a los 50 mg /ml (Fig 3A). No hubo aumento significativo dependiente de la dosis en las células con fluorescencia verde positivo (figura 3B) (
p. & Lt; 0

01
), lo que sugiere la pérdida de potencial de membrana mitocondrial en correlación con el aumento de dosis de PMBPs tratamiento. Por lo tanto, la apoptosis de las células de cáncer de ovario por PMBPs se asocia con el daño de la membrana mitocondrial.

(A) El A2780 y células OV2008 fueron tratados con PMBPs (0, 25, 35, 50 g /ml) durante 24 h y después se recogieron, se tiñeron con colorante JC-1, y finalmente se analizaron por citometría de flujo. tratamiento (B) PMBPs resultó en un aumento significativo de las células de fluorescencia verde (GFP) positivos lo que indica la pérdida de potencial de membrana mitocondrial. Los experimentos se repitieron tres veces.
** P & lt;.. 0

01
en comparación con el grupo control

PMBPs regular al alza las proteínas relacionadas con la apoptosis y suprimen Bcl-2

Desde PMBPs podrían inducir la apoptosis en células de cáncer de ovario, se analizó adicionalmente algunas proteínas relacionadas con la apoptosis por Western blot. El nivel de β-actina sirvió como control interno. Se encontró que la expresión de la proteína anti-apoptótica de Bcl-2 en células de cáncer de ovario tratados con PMBPs disminuyó significativamente en una manera dependiente de la dosis (
p & lt;. 0

01
) (Fig 4A , 4B y 4C). Los miembros de caspasas son mediadores cruciales de la apoptosis [13]. Se evaluaron las expresiones de la caspasa-3 y caspasa-9. -Caspasa-9 escindidos niveles de expresión escindido con la caspasa-3 y se upregulated dramáticamente después del tratamiento PMBPs en las células de cáncer de ovario (
p & lt;. 0

01
) (Fig 4A, 4B, 4D y 4E). Estos resultados sugieren que PMBPs activan la vía de la apoptosis dependiente de caspasa.

(A, B) Las células A2780 y OV2008 fueron tratados con PMBPs (0, 15, 25, 35, 50 mg /ml) durante 24 h y después se recogieron. Los lisados ​​celulares se prepararon y se sometieron a análisis de transferencia Western. Los niveles de proteína de Bcl-2, escindido con la caspasa-3 y escindido con la caspasa-9 se midieron mediante transferencia Western. (C, D, E) Los histogramas muestran los niveles medios de expresión de Bcl-2, escindido con la caspasa-3 y escindido con la caspasa-9 (± SD), respectivamente, a partir de tres experimentos independientes. Bcl-2, los niveles de caspasa-9 escindidos escindido con la caspasa-3 y se expresaron en relación al control de la carga, β-actina. Todos los experimentos se repitieron tres veces
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01
en comparación con el grupo control

PMBPs inhiben la migración y la invasión de cáncer de ovario. células

La migración celular y la invasión son características de las células tumorales. Para investigar si PMBPs deteriorados migración y la invasión de células de cáncer de ovario, se realizó herida ensayo de curación con diferente, no apoptótica (5 mg /ml y 10 mg /ml), las concentraciones de PMBPs para 24 h. Se encontró que PMBPs disminución dependiente de la dosis el movimiento de las células A2780 y OV2008 (Fig 5). Las tasas de cierre de heridas de PMBPs células tratadas fueron más bajas que la de las células no tratadas (
P & lt;. 0

01
) (Fig 5B y 5C). Además, hemos examinado la capacidad de invasión de estas células utilizando un pocillos 24 transwell cámara en presencia de diferentes concentraciones de PMBPs para 24 h. PMBPs inhibió significativamente el potencial de migración y la invasión de las células de cáncer de ovario en una manera dependiente de la dosis (
P & lt;. 0

01
) (Fig 6). El tratamiento con PMBPs 5-25 g /ml inhibió la migración y la invasión de 27% -66%, respectivamente, en las células A2780, y 11% -40% en las células OV2008, en comparación con los controles (figura 6B y 6C). Tanto el ensayo de cicatrización de la herida y la cámara de ensayo transwell sugieren que PMBPs podrían suprimir la migración y la invasión de células de cáncer de ovario.

Las monocapas de células A2780 y OV2008 se raye con una punta de pipeta y se trata con PMBPs (0, 5, 10 , 25μg /ml) durante 24 h. (A) fotos representativos de la migración de las células bajo el microscopio a 100 × magnificación campo, antes y después de la lesión. (B, C) La migración de las células A2780 y OV2008 se cuantificó mediante la medición de las zonas de cierre de heridas antes y después de la lesión. Los experimentos se repitieron tres veces. **
P & lt; 0

01 Opiniones y ***
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001
en comparación con el grupo control


células A2780 y OV2008 fueron tratados con PMBPs (0, 5, 10, 25 mg /ml) durante 24 h. (A) Imágenes representativas de células que migraron e invadió sobre el lado inferior de transwell membrana a 100 aumentos con un microscopio. (B, C) Número de células de cada campo se contó con un promedio. células invadidas se expresaron en relación a la de grupo de control. Los experimentos se repitieron tres veces. **
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01 Opiniones y ***
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001
en comparación con el grupo control


la inhibición de la actividad de MMP-9 y la expresión por PMBPs

Teniendo en cuenta los efectos de PMBPs sobre la migración celular y la invasión de cáncer de ovario, que investigarse más a fondo los mecanismos de este proceso. Desde MMP-9 desempeña un papel importante en la invasión del cáncer, el próximo detectado actividad de la enzima MMP-9 y la expresión después del tratamiento PMBPs. la actividad de MMP-9 en medio acondicionado fue examinada por zimografía de gelatina, y MMP-9 expresión se examinó por transferencia de Western. dependiente de la dosis PMBPs suprimido la actividad de MMP-9 (Fig 7A) y la reducción de MMP-9 nivel de expresión de proteínas (
P & lt;. 0

05
) (Fig 7B). Por lo tanto, la actividad inhibidora de PMBPs en la invasividad del cáncer de ovario podría ser, al menos parcialmente, debido a la supresión de la actividad de MMP-9.

Las células fueron tratadas con PMBPs (0, 5, 10, 25 g /ml) durante 24 h. (A) Actividad de MMP-9 en el sobrenadante de células a varias concentraciones de PMBPs se examinó mediante ensayo de zimografía de gelatina. Las bandas blancas representan la MMP-9 digestión de gelatina mediada. (B) La expresión de la proteína de MMP-9 en células A2780 a diversas concentraciones de PMBPs se evaluó mediante Western blot. muestra el nivel medio del histograma de la MMP-9 (± DE) de tres experimentos independientes. MMP-9 nivel de proteína se expresó en relación al control de carga, β-actina y estandarizada para el grupo de control no tratado. *
P. & Lt; 0

05 Opiniones y **
P & lt;.. 0

01
en comparación con el grupo control

PMBPs perjudican NFkB translocación nuclear y la activación de la vía MAPK

Muchos estudios han demostrado que la inhibición de la actividad de NFkB pudo reprimir la invasión de células de cáncer [14,15,16]. Nosotros, por lo tanto, investigamos el efecto de PMBPs sobre la actividad de NFkB en las células de cáncer de ovario. El tratamiento de células A2780 con PMBPs redujo significativamente la translocación nuclear de NFkB y la fosforilación de I? B? (
P & lt;. 0

05
) (Fig 8A y 8C). Estos provocaron que PMBPs puede, al menos en parte, suprimir la invasión de células de cáncer de ovario mediante la inhibición de la actividad de NFkB. Varios estudios han indicado que la activación de las proteínas quinasas mitgen-activatied (MAPKs) incluyendo ERK1 /2, p38MAPK, JNK están implicadas en la migración y la invasión tumoral, y que estas MAPKs actuar aguas arriba de NFkB [17,18,19]. Por lo tanto, el estado de activación de ERK1 /2, p38MAPK y JNK se examinó en las células A2780 tratados con varias concentraciones de PMBPs. PMBPs inhibió significativamente ERK1 /2 y la activación de p38MAPK, pero no JNK (
P & lt 0

05
.) (
P & gt;.
0
05
) (Fig 8B y 8D). Por lo tanto, la supresión de ERK1 /2 y la activación de p38MAPK por PMBPs puede contribuir a la alteración potencial de invasión de las células de cáncer de ovario.

(A, B) Las células se trataron con PMBPs (0, 5, 10, 25 mg /ml) durante 24 h. Los lisados ​​celulares se prepararon y se sometieron a análisis de transferencia Western. El nivel de proteína p65 nuclear, p-I? B?, I? B?, P-ERK, p-p38 y p-JNK se midieron. (C, D) Los histogramas muestran la media (± DE) de nivel de p65 nuclear, p-I? B, I? B, p-ERK, p38-p y p-JNK de tres experimentos independientes. La nuclear p65, p-I? B, I? B, p-ERK, p38-p y p-JNK niveles de expresión se expresaron en relación al control de carga β-actina y estandarizada para el grupo de control no tratado. *
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05 Opiniones y **
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01
en comparación con el grupo control

Discusión

el cáncer de ovario sigue siendo la causa principal de muerte en los cánceres ginecológicos en gran medida debido a la etapa tardía diagnóstico y tratamientos efectivos limitados, especialmente en la enfermedad recurrente [20]. productos naturales derivados de plantas son agentes terapéuticos prometedores para tratamientos contra el cáncer [21]. Por lo tanto, hemos explorado la utilidad potencial de las proantocianidinas de
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corteza en las células de cáncer de ovario en la búsqueda de encontrar nuevos fármacos eficaces para el tratamiento del cáncer de ovario. Nuestros datos demostraron que aquí PMBPs redujo la proliferación, la apoptosis inducida y suprimió la migración de células de cáncer de ovario.


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extracto de corteza se ha reportado que inhibe el crecimiento de varios tipos de cáncer. Se impide selectivamente la proliferación de células BEL-7402 y HepG2 de hepatoma humano pero ligeramente promovió el crecimiento de las células normales del hígado humanos L-02 in vitro [8,9,22]. También suprime el crecimiento de células Hela de cáncer cervical humano y apoptosis inducida. En este estudio, se encontró que las proantocianidinas extraídas de
Pinus massoniana Cordero
corteza inhibió significativamente la proliferación de células de cáncer de ovario, pero no afectan a las células ováricas normales. También se observó que las células cancerosas se contrajeron y separado de placas de cultivo después del tratamiento PMBPs, lo que sugiere que PMBPs impedir de forma selectiva el crecimiento de células de cáncer de ovario y causan la muerte celular.

Además, investigó los mecanismos anti-tumorales empleadas por PMBPs en las células de cáncer de ovario. La apoptosis juega un papel muy importante en la eliminación de células tumorales hiper-crecimiento [23] mutado o. Hay varios tipos de productos naturales que han sido reportados para prevenir el crecimiento de las células tumorales a través de la inducción de la apoptosis [24]. Algunos estudios han revelado que
Pinus massoniana
extracto de corteza de inducir apoptosis en células HeLa de cáncer cervical humano, células HepG2 de hepatoma humano y células S180 sarcoma murino de una manera dependiente de la dosis [9,10,11]. En el presente estudio, los datos DAPI revelaron que las células tratadas con PMBPs muestran cambios morfológicos de apoptosis específicos. Citometría de flujo de datos indican además que la proporción de células apoptóticas aumentó significativamente después del tratamiento PMBPs. Todos estos resultados indican que PMBPs induce la apoptosis en células de cáncer de ovario.

La inducción de la apoptosis está relacionada con la supresión de proteínas anti-apoptóticos y sobre regulación de las proteínas pro-apoptóticas [25]. Se ha informado de que la proteína Bcl-2 es de suma importancia en la regulación de la ruta apoptótica mitocondria asociada a [26]. Down-regulación de Bcl-2 da como resultado la pérdida de potencial de membrana mitocondrial y liberación de citocromo
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de la mitocondria al citosol para activar la caspasa-9 [27]. La caspasa-9 escindida activa aún más la caspasa-3, una de las enzimas clave en la vía apoptótica intrínseca, para inducir eventos apoptóticos posteriores [28]. Aquí, nuestros resultados mostraron que PMBPs indujo una pérdida significativa del potencial de membrana mitocondrial. Además, se observó la reducción de Bcl-2 expresión acompañado con niveles elevados de escindido con la caspasa-9 y escindido con la caspasa-3 en células de cáncer de ovario tratados con PMBPs. Se podría considerar que PMBPs pueden inducir la apoptosis a través de la vía apoptótica mitocondria asociada.

Hemos encontrado que PMBPs suprime eficazmente la migración y la invasión de cáncer de ovario. Un factor importante que facilita la diseminación metastásica de las células cancerosas es enzimas proteolíticas que degradan la matriz extracelular circundante, y por lo tanto facilitan la migración de células a través de la membrana basal. Las metaloproteinasas de matriz (MMP) participan en la remodelación de la matriz [29]. Con respecto al cáncer de ovario, la expresión de MMP-9 se ha relacionado con subtipos invasivos [30]. Nuestro trabajo demuestra que PMBPs podrían regular a la baja la MMP-9 expresión y actividad. Por lo tanto, PMBPs pueden suprimir la actividad de MMP-9 a deteriorar las capacidades de migración e invasión de células de cáncer de ovario.

La activación de NFkB es crucial para la migración y la invasión de células de cáncer de ovario [31,32,33]. Hemos propuesto que PMBPs puede suprimir la actividad de NFkB e inhibir la invasión del cáncer de ovario. La fosforilación de I? B? Puede liberar subunidades NFKB que son transportados desde el citoplasma al núcleo de las células para regular genes diana [34]. En este estudio, se observó que la fosforilación de I? B? Y translocación NFkB desde el citoplasma al núcleo inhibida por tratamiento PMBPs (Fig 8A y 8C). NFkB sirve como factor de transcripción de la regulación de MMP-9 [35,36]. Nuestros resultados demuestran que PMBPs suprimen la actividad de NFkB y esto se correlacionan positivamente con la baja regulación de MMP-9 expresión
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La cascada de señalización de MAPK, incluyendo ERK1 /2, p38 MAPK y JNK, se ha implicado en la migración y la invasión de numerosos tipos de células cancerosas [37,38,39]. En este estudio, se especuló que PMBPs pueden antagonizar la MAPK vías de señalización para suprimir la migración y la invasión de células de cáncer de ovario. Nuestros datos indican que el tratamiento PMBPs inhibe la activación de ERK1 /2 y p38 MAPK en una forma dependiente de la dosis, pero tuvo poco efecto sobre la vía de JNK (Fig 8B y 8D).