Extracto
Antecedentes
gypenosides (Gyp), los principales componentes de
Gynostemma pentaphyllum
Makino, son ampliamente utilizados en la medicina tradicional china. El presente estudio tuvo como objetivo investigar el efecto anti-cáncer y los mecanismos subyacentes de Gyp sobre las células del cáncer colorrectal humano SW-480.
Materiales y Métodos
El efecto inhibidor de Gyp en SW-480 las células se evaluó mediante el ensayo de MTT. La muerte celular apoptótica se detectó por análisis de tinción y la fragmentación del ADN nuclear Hoechst 33342. La apoptosis se analizó utilizando Annexin V-PE /7-amino-actinomicina D tinción. integridad de la membrana celular se evaluó con citometría de flujo después de la tinción PI. Los cambios de potencial de membrana mitocondrial (
Δψ
m) se detectaron por medio de citometría de flujo análisis de rodamina 123 (Rh123). El papel de las especies reactivas de oxígeno (ROS) en la muerte celular inducida por Gyp fue investigado por la generación de ROS intracelular y scavenger general de ROS. ensayo de cicatrización de la herida se llevó a cabo para investigar la migración inhibido-Gyp de SW-480 células
in vitro
. Además, las alteraciones en los microfilamentos de actina F se analizaron por FITC-etiquetados phalloidin tinción toxina y se evaluaron los cambios morfológicos bajo el microscopio electrónico de barrido (SEM).
Resultados
Después del tratamiento Gyp, se observaron se aumentó la permeabilidad de la membrana plasmática de la célula SW-480,
Δψ
m se redujo significativamente, el nivel de nivel de ROS intracelular se incrementó, la fragmentación del ADN y la morfología apoptótica. Las células tratadas con Gyp ejercen colapso de la red de microfilamentos grave, así como la disminución significativa en el número de microvellosidades. Gyp indujo a los cambios de la viabilidad celular, la migración celular, la generación de ROS intracelular y la morfología nuclear fueron obviamente aliviado por NAC.
Conclusión
Los resultados de este estudio implican que ROS juegan un papel importante en gyp toxicidad inducida celular y la apoptosis, y el daño mitocondrial pueden estar aguas arriba de tratamiento post Gyp la generación de ROS. Los hallazgos del presente estudio proporcionan nuevas evidencias de los mecanismos antitumorales mediante el cual induce la apoptosis Gyp
in vitro
Visto:. Yan H, Wang X, Niu J, Wang Y, Wang P , Liu Q (2014) efecto contra el cáncer y los mecanismos subyacentes de gypenosides en cáncer colorrectal humano SW-480 células. PLoS ONE 9 (4): e95609. doi: 10.1371 /journal.pone.0095609
Editor: Nükhet Aykin-Burns, Universidad de Arkansas para las Ciencias Médicas; Facultad de Farmacia, Estados Unidos de América
Recibido: 16 de diciembre de 2013; Aceptado: March 27, 2014; Publicado: 21 Abril 2014
Derechos de Autor © 2014 Yan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el plan Nacional "Twelfth Quinquenal" para la Ciencia y Tecnología de Apoyo (2011BAI06B05). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es la principal causa de muerte en el mundo, con cerca de 1.000.000 de nuevos casos y 500.000 muertes por CCR en todo el mundo cada año [1], [2]. Hay muchos factores de riesgo para CRC, incluyendo la edad avanzada, enfermedades inflamatorias del intestino, la historia médica de los pólipos adenomatosos benignos, historia familiar de CCR, la baja ingesta de verduras y frutas, el alto consumo de grasa animal y carne procesada [3], [4] .
En el tratamiento clínico CRC, las terapias tradicionales, como la radioterapia, la quimioterapia y la cirugía no son el mejor método de curación para ella a causa de mal pronóstico y los efectos secundarios graves. Por lo tanto, la búsqueda de nuevas terapias antitumorales es extremadamente urgente. Ahora, la medicina natural en la terapia del cáncer ha despertado gran preocupación en el país y en el extranjero, debido a su seguridad, effiiciency y efectos secundarios mínimos [5].
gypenosides (Gyp), una medicina popular popular en la China, es los principales componentes de los extractos de
Gynostemma pentaphyllum
Makino. Se existe principalmente como dammarano glicósidos triterpénicos Tipo- (Figura 1). Gyp había sido conocida por sus efectos beneficiosos de ancho para el tratamiento de la hepatitis, hiperlipoproteinemia y las enfermedades cardiovasculares [6] - [8]. Los estudios han demostrado que Gyp tiene una actividad de las acciones anti-inflamatorios, anti-trombótica, antioxidantes y anti-cáncer [9] - [12]. Pero, hasta ahora, no hay ningún informe sobre el efecto antitumoral inducida por Gyp sobre los cánceres colorrectales humanos. Por lo tanto, en el presente estudio, se investigó la citotoxicidad y la apoptosis de las células SW-480 inducida por Gyp. Papel de las especies reactivas de oxígeno (ROS) en la muerte celular inducida por Gyp se analizó mediante la generación intracelular de ROS y eliminador de ROS. Estos resultados pueden proporcionar evidencias para el papel de Gyp como un agente anti-cáncer colorrectal potente en la aplicación clínica.
Materiales y Métodos
Productos químicos y Reactivos
Gyp fue proporcionado amablemente por el Instituto de Ankang Farmacéutica de la Universidad de Pekín. El polvo se disolvió en 80% de etanol (EtOH) para obtener una solución madre de 100 mg /ml, que se esterilizó por filtración 0,22 micras membrana. 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-diphenyltertrazolium bromuro de tetrazolio (MTT), rodamina 123 (Rh123), Hoechst 33342, yoduro de propidio (PI) y N-acetilcisteína (NAC) se adquirieron de The Chemical Company Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.). 2 ', 7 pies dichlorodihydrofluorescein-diacetato (DCFH-DA) y FITC-phalloidine fueron suministrados por Molecular Probes Inc. (Carlsbad, CA, EE.UU.). Guava nexina reactivo se obtuvo de Millipore Corporation (Billerica, MA, EE.UU.). Todos los demás reactivos eran productos comerciales de calidad analítica.
se obtuvieron de la célula Cultura y
Las células de cáncer de colon SW-480 humanos desde el banco de células de la Academia de Ciencias de China, Shanghai, China. La línea celular se cultivó en medio RPMI-1640 que contiene 10% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina (100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina) y 1% de glutamina en un matraz de cultivo de células bajo un humidificado 5% CO
atmósfera de aire 2 y el 95% a 37 ° C.
Evaluación de la viabilidad celular después del tratamiento Gyp
Para investigar el efecto de Gyp sobre la proliferación celular SW-480, las células fueron sembradas en 96 pocillos platos. Diversas concentraciones (0, 70, 100 y 130 mg /ml; 80% de etanol fue utilizado como el disolvente de control) se añadieron de Gyp y las células se incubaron durante diversos períodos de tiempo, a una densidad de 1 × 10
5 células /ml, respectivamente. La viabilidad celular se determinó usando el ensayo de MTT [13]. La absorbancia a 570 nm se registró usando un lector de microplacas (Bio-Tek ELx800, EE.UU.). La viabilidad celular de Gyp trata a continuación las muestras se obtuvo por comparación con el control.
Análisis de citometría de flujo de la célula de membrana Integridad
PI es un colorante de membrana impermeable fluorescente que tiñe los núcleos intercalando entre las bases apiladas de ácido nucleico. Desde PI entra en la célula sólo si la membrana celular se vuelve permeable, que es ampliamente utilizado en la investigación de la muerte celular para medir la integridad de la membrana plasmática. Cuando se une a los ácidos nucleicos, el máximo de absorción para PI es 535 nm y el máximo de emisión de fluorescencia es 617 nm [14]. Las células en placas de 24 pocillos se trataron con la concentración indicada de Gyp para 6, 12, 24 y 48 h, respectivamente. Entonces se recogieron las células y se lavaron dos veces con PBS, se tiñeron con 5 mg PI /ml durante 5 min en la oscuridad y se analizaron por citometría de flujo. Los datos fueron analizados mediante el FCS expreso V3 (De Novo Software).
El examen de membrana mitocondrial potencial (Δψ
m)
Para estudiar el
Δψ
cambios m, las células se tiñeron con Rh123, que entra selectivamente las mitocondrias con una membrana intacta potencial y se retiene en el mitocondrial [15]. Una vez que se pierde el potencial de membrana mitocondrial, Rh123 se lava posteriormente fuera de las células. Las células en placas de 24 pocillos se trataron con la concentración indicada de Gyp para 4 y 8 h. Las células se recogieron y se lavaron dos veces con PBS, se resuspendieron en 500 l de 1 mg /ml Rh123 y se incubaron a 37 ° C durante 30 min en la oscuridad. Las muestras se detectaron entonces inmediatamente por citometría de flujo. Los datos fueron analizados mediante el FCS expreso V3 (De Novo Software).
Flujo Análisis de citometría de fragmentación del ADN
Para analizar la fragmentación del ADN, la detección de citometría de flujo de ADN hipodiploidía después de añadir PI a las células que mueren y permeabilización de ellos por congelación-descongelación se realizó [14]. El tamaño de los fragmentos de ADN se presenta como un histograma de ADN hypoploid. Para investigar el efecto de Gyp en daño en el ADN de las células SW-480, se realizó la fragmentación del ADN oligonucleosomal por citometría de flujo. Las células en placas de 24 pocillos se trataron con varias concentraciones de Gyp para 6, 12, 24 y 48 h, respectivamente. Las células fueron teñidas con 5 mg /ml PI y se analizó el contenido de ADN por citometría de flujo.
Hoechst 33342 tinción
Con el fin de observar los cambios de la morfología de los núcleos de las células tumorales después del tratamiento Gyp, se utilizó Hoechst 33342 tinción. Después del tratamiento con la concentración indicada de Gyp para 6, 24 y 48 h, las células se tiñeron por 10 M Hoechst 33342 para 15 min a temperatura ambiente. A continuación, las células teñidas se lavaron tres veces con PBS y se observaron utilizando un microscopio de fluorescencia con filtros de excitación estándar. La longitud de onda de excitación y longitud de onda de emisión fueron 346 nm y 460 nm, respectivamente.
se detectó Análisis de apoptosis de las células
apoptosis de las células después del tratamiento con la concentración indicada de Gyp para 12 y 24 h. La cuantificación de la apoptosis de las células se midió por el ensayo de guayaba nexina, que utiliza Anexina V-PE para detectar la fosfatidilserina en la membrana externa de las células apoptóticas. El colorante de membrana impermeable, 7-amino-actinomicina D, también se utiliza como un indicador de la integridad de la membrana celular. Brevemente, 100 células mu l de cada muestra se suspendió en una mezcla de 100 l Anexina V-PE y tampón de unión 7-ADD. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 20 min, las muestras se analizaron por citometría de flujo. La población se divide en tres grupos: las células vivas con la fluorescencia de bajo nivel, las células apoptóticas en etapas anteriores con fluorescencia verde, y las células apoptóticas finales de los años tanto con fluorescencia roja y verde
Curación de Heridas Ensayo
.
Las células se sembraron en placas de 24 pocillos y se incubaron 24 h. Luego, las células en pocillos individuales fueron heridos por el rascado con una punta de pipeta y se trataron con la concentración indicada de Gyp. Después de 24 horas de incubación, las células se fotografiaron bajo microscopía de contraste de fase.
microfilamento Análisis
Después de un tratamiento diferente, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% en PBS durante 10 minutos a 37 ° C. Las células se permeabilizaron con 0,1% Triton X-100 en PBS durante 7 min y se bloquearon con 1% de BSA en PBS durante 1 h a 37 ° C. Entre cada etapa descrita anteriormente, las células se lavaron tres veces con PBS durante 5 minutos a 37 ° C. Las células que bloquean seguido se tiñeron con 5 mg /ml-phalloidine FITC durante 1 hora a 37 ° C en la oscuridad. Las imágenes se obtuvieron por un barrido láser microscopio confocal (TCS SP5, Leica, Alemania).
microscopio electrónico de barrido (SEM) Observación
Después de 24 h después de diversos tratamientos, se fijaron las células en cada grupo en una solución de glutaraldehído al 2,5% tamponada con fosfato, enjuagado con PBS y se deshidrata por el alcohol clasificado, el punto crítico se secó-líquido de CO
2 y oro bombardeo iónico. Las superficies de las células fueron observadas por microscopía electrónica de barrido (S-3400N, Hitachi, Japón).
Detección intracelular de especies reactivas del oxígeno (ROS) y su papel en la citotoxicidad causada Gyp
con el fin de determinar los cambios en el nivel de ROS, medimos la conversión oxidativa de la sonda fluorescente sensible 2 ', 7'-diclorofluoresceno-diacetato (DCFH-DA) en fluorescente 2', 7'-diclorofluoresceno (DCF). DCFH-DA se difunde fácilmente a través de la membrana celular y es enzimáticamente hidrolizado por esterasas intracelulares para formar no fluorescente DCFH, que luego se oxida rápidamente para formar altamente fluorescente DCF en presencia de ROS, y la intensidad de fluorescencia es proporcional a la producción de ROS. Las células en placas de 24 pocillos se trataron con la concentración indicada de Gyp para 4 y 8 h. Las células se recogieron y se lavaron dos veces con PBS, se resuspendieron en 500 l de 10 mM DCFH-DA y se incubaron a 37 ° C durante 30 min en la oscuridad. Las muestras se detectaron entonces inmediatamente por citometría de flujo. Los datos se analizaron usando FCS expreso V3 (De Novo Software).
Para investigar el papel de ROS en la muerte celular inducida por Gyp y apoptosis, NAC (5 mM) fue utilizado como un inhibidor de la ROS añadido al medio de cultivo antes de la cargar Gyp por 1 h. La disminución de la viabilidad celular, la generación de ROS intracelular, la
Δψ
m pérdida, los cambios morfológicos nucleares y la inhibición de la migración de células fueron especialmente analizados como se describe anteriormente.
Análisis estadístico
Los datos se expresan como media ± desviación estándar de al menos tres experimentos independientes. El análisis estadístico se realizó por análisis unidireccional de la varianza. La significación estadística se estableció en
p
. & lt; 0,05
Resultados
Efectos de Gyp sobre la viabilidad celular
Figura 2 muestran que inhibe Gyp SW-480 la proliferación de células de una manera dosis-y dependiente del tiempo. La viabilidad se redujo significativamente cuando la dosis Gyp fue 70 mg /ml o superior (
p
& lt; 0,01) y la incubación prolongada mejoró la pérdida de viabilidad. Los valores de IC50 fueron aproximadamente 91,77 y 83,8 mg /ml cuando se incubaron las células con Gyp durante 24 y 48 h, respectivamente.
SW-480 se sembraron en placas de 96 pocillos y se trata con 0, 70, 100 y 130 g /ml de Gyp de 24 y 48 h. La viabilidad celular se midió por el ensayo MTT. Cada valor se expresa como una media ± S.D. de al menos tres determinaciones independientes. Utilizó un modelo lineal se utilizó para las comparaciones de grupo de múltiples medios seguido por la prueba t de Dunnett. **
P
& lt; 0,01 frente al control. (Barras de error = SD, n = 3).
Gyp-inducida por daño en la membrana plasmática de las células SW-480
Se utilizó la tinción PI combinada con citometría de flujo para evaluar Gyp-inducidas daño de la membrana celular. En SW-480 células, daño de la membrana como un evento temprano de lesión celular inducida Gyp (Figura 3). Después de la incubación durante 6 h, el porcentaje de células con mayor fluorescencia PI aumentó gradualmente desde 10,07% a 21,93% cuando las células fueron expuestas a rango de dosis Gyp 70-130 g /ml. Las células expuestas a 70 mg /ml Gyp no mostraron mucho daño de la membrana celular aumentó con el tiempo de incubación prolongado. Mientras que las células después de 100 mg /ml y 130 mg /tratamiento Gyp ml, el daño de la membrana celular se incrementó en gran medida por el tiempo de incubación prolongado, sobre el 46,27% y el 67,87% de las células muestran alta fluorescencia del PI a las 48 h después del tratamiento, respectivamente.
las células fueron tratadas con Gyp durante 6, 12, 24 y 48 (eje vertical) frente a la fluorescencia PI (eje horizontal).
Gyp-indujo la Δψ
m Pérdida de SW-480 células
Rh123 tinción combinada con citometría de flujo se utilizó para evaluar Gyp inducida por
Δψ
m cambios. Como se muestra en la Figura 4, muestra que Gyp induce la pérdida de
Δψ
M bastante temprano y ha causado la disminución de
Δψ
m de la dosis y tiempo- de manera dependiente. Después de 4 h de incubación, el porcentaje de células con
Δψ
m pérdida aumentó del 9,9% al 28,8% cuando Gyp aumentó de 70 mg /ml a 130 mg /ml. Cuando el tiempo de incubación se incrementó de 4 a 8 h, el porcentaje de células con
Δψ
m pérdida aumentó de 16,65% a 20,95%, cuando Gyp fue de 100 mg /ml.
Las células fueron tratados con Gyp para 4, 8 h y se marcaron con rodamina 123 y se analizaron por citometría de flujo. Los histogramas muestran el número de canal de la célula (eje vertical) frente a la fluorescencia de rodamina 123 (eje horizontal).
Gyp inducida por la fragmentación del ADN de células SW-480
Para determinar el que daña el ADN actividad de Gyp, el porcentaje de células dañadas se analizó mediante tinción con PI por citometría de flujo como se describe en los métodos. Como se muestra en la Figura 5, Gyp inducida por la fragmentación del ADN era de una manera dosis-y dependiente del tiempo. No fragmentación del ADN significativa fue detectada por diferentes dosis de Gyp después del tratamiento 6 h, mientras que una cantidad significativa de la fragmentación del ADN a gran escala se observó por el Gyp dosis más alta (100, 130 g /ml) después de 12 h de incubación, y el ADN daños en dosis Gyp inferior (70 g /ml) células tratadas no ha mejorado con el tiempo de incubación prolongado. Después de 48 h de incubación, el fragmento de ADN de grupo de control es 2,37%, que aumentó a 10,03%, 26,33% y 56,07% cuando Gyp concertration era 70, 100 y 130 mg /ml, respectivamente.
Las células se tratado con Gyp durante 6, 12, 24 y 48 (eje vertical) frente a la fluorescencia PI (eje horizontal).
Los cambios morfológicos Gyp-inducida de células SW-480
Figura 6 mostraron los resultados de la tinción de Hoechst 33342 en células SW-480 tratadas por Gyp. Muy poco se observó celular azul y homogénea en el grupo de control. Las células en los grupos tratados mostraron Gyp mejora de Hoechst 33342 tinción y el cambio de la morfología celular en un Gyp de la dosis y de forma dependiente de tiempo de incubación. Cuando la concentración de Gyp estaba por encima de 100 mg /ml, las células SW-480 resultaron gravemente dañados con tinción nuclear brillante azul y las imágenes de fase celdas indicadas estaban encogidos de tipo redondo anormal, y el número de células se redujo significativamente.
Las células fueron tratados con Gyp a las concentraciones indicadas durante 6, 24, 48 "Materiales y métodos".
Detección de la apoptosis de las células mediante citometría de flujo
las tasas de apoptosis se mide por Anexina V -PE y 7-ADD tinción después de 12,24 h siguientes diversos tratamientos. Las fracciones de células en cada cuadrante se analizaron mediante estadísticas de cuadrante [16]. Como se muestra en la Figura 7, los porcentajes de células con anexina V-tinción positiva aumentó gradualmente de una manera dependiente de la concentración después del tratamiento Gyp, lo que sugiere que Gyp podría inducir respuesta apoptótica en células SW-480. En el grupo control no tratado, 94.85% de las células eran viables, 1,45% de la población celular estaba en la etapa temprana de la apoptosis (abajo a la derecha) y la población de células fue 2,95% en la última etapa de la apoptosis (parte superior derecha). Mientras que, después de 12 h de incubación con Gyp, la población celular apoptótica (inferior derecha + superior derecha) aumentó de 25,40% a 38,70% cuando la concentración de fármaco aumentó de 70 mg /ml a 130 mg /ml. Cuando el tiempo de incubación se incrementó de 12 a 24 h, la población de células apoptóticas aumentó de 29,45% a 41,70% cuando se Gyp fue 100 mg /ml.
Concentraciones
Las gráficas de puntos de Anexina V y la absorción de 7-AAD después indicados en células SW-480. Las células se analizaron a las 12, 24 h post-tratamiento.
Gyp inhibido Migración de SW-480 in vitro
A fin de verificar el efecto inhibidor de Gyp sobre la migración celular SW-480, una herida ensayo se llevó a cabo la curación (Figura 8). La capacidad de curación de heridas de las células refleja su movimiento y la migración en la superficie sobre la que se anclan a para el crecimiento. En comparación con 0 h después de la herida, después de 24 h de incubación, las células muy densos en el control crecieron gradualmente al espacio intermedio de la herida, las células en 70 mg /ml Gyp grupo tratado mostró ligera diferencia con diferencia de control con el control, mientras que las células en 100 g /ml y los grupos tratados con Gyp 130 g /ml rara vez se crecieron al espacio intermedio de la herida, y la densidad celular se redujo en serio.
las células en placas de 24 pocillos fueron heridos por el rascado con una punta de pipeta y se incubaron las células con Gyp durante 24 horas. Las células se fotografiaron bajo microscopía de contraste de fase (magnificación × 200).
Análisis microfilamento
Está bien establecido que los elementos del citoesqueleto estaban estrechamente relacionados con el movimiento de células [17], [ ,,,0],18]. Los cambios en la F-actina organización microfilamentos en SW-480 células después de Gyp tratada se investigó mediante microscopía de fluorescencia utilizando marcado con FITC faloidina toxina. Como se muestra en la Figura 9, las células de control mostraron una disposición regular de los filamentos de actina definidas presentes a lo largo de las células, distribuidas de manera uniforme en el citoplasma, mientras que las células en 100 g Gyp /ml mostraron una desorganización de los filamentos de actina, un aumento de las fibras de actina stree y verde No se observaron manchas de fluorescencia. Las células tratadas con 130 mg Gyp /ml demostraron un daño absoluto de la red de actina y la desaparición completa de los filamentos de actina.
Las células se tiñeron con faloidina (verde) para la F-actina. Las barras de escala, 10 m.
SEM Observación
Se observaron los cambios morfológicos bajo SEM (Figura 10). En el grupo control, las células aparecieron epitelial en forma con numerosas microvellosidades sobre la superficie de la célula. Mientras que en 70 g /ml, las células mostraron una disminución significativa en el número de microvellosidades, la superficie de muchas células convertirse relativamente suave sin microvellosidades obvio. Cuando dosis Gyp estaba por encima de 100 mg /ml, las células SW-480 resultaron gravemente dañados con aparente deformación, encogido de tipo redondo anormal, y el número de células disminuyó significativamente. Mientras que en 130 g /ml, se observaron algunas protuberancias papillous en la superficie de las células, donde el citoplasma parecía haber extruido a través del límite de la membrana.
Ampliación de las imágenes era 1,500 y 5,000 ×, respectivamente. Las barras de escala:. 30, 10 micras
ROS inducida por involucradas en Gyp SW-480 citotoxicidad
La producción de ROS intracelular se analizó mediante citometría de flujo con tinción DCFH-DA. Los datos mostrados en la figura 11 sugieren que el intracelular niveles de ROS se aumentó después del tratamiento Gyp, en 4 h después del tratamiento, había alrededor de 13,97%, 21% y 13,07% de las células en 70, 100 y 130 g /grupos tratados Gyp ml mostraron brillante fluorescencia DCF, mientras que sólo el 5,43% de las células en el grupo de control mostró brillante fluorescencia DCF. Cuando el tiempo de incubación se incrementó de 4 a 8 h, el porcentaje de células con fluorescencia brillante DCF aumentó a 29,77%, 35,97% y 33,43% cuando se Gyp fue de 70, 100 y 130 mg /ml, respectivamente. Encontramos la generación de ROS se aumentó por primera vez con el aumento de la concentración de Gyp y luego disminuyó ligeramente en dosis Gyp mucho mayor, lo que puede debido a una mayor lisis celular causada por el tratamiento Gyp en mayor concentración del fármaco.
Las células fueron tratadas con Gyp para 4, 8-DA y la intensidad de fluorescencia del producto oxidado DCF en las células individuales se detectó por citometría de flujo. Se muestra el porcentaje de células fluorescentes en cada grupo.
A fin de examinar si la elevación de ROS intracelular estaba involucrado en la muerte celular inducida por Gyp, hemos realizado ensayos posteriores. El resultado en la figura 12A muestra que la disminución de la viabilidad celular causado por Gyp fue rescatado en gran medida por NAC (
p Hotel & lt; 0,05). Además, el Gyp causó la generación de ROS intracelular, condensación de la cromatina y la inhibición de migración celular se impidió todo visiblemente por NAC (Figura 12B-D). Sin embargo, la disminución de
Δψ
M causados por Gyp no se vio impedido por NAC (Figura 12E). Estos resultados indican que las ROS estuvo implicado en el daño inducido por Gyp en células SW-480 y el
Δψ
m pérdida puede ser un importante activador ascendente de la generación de ROS y el aumento de ROS podría ser estimulada por la mitocondrias dañadas.
(A) La viabilidad celular, (B) la generación de ROS intracelular, cambios morfológicos (C) nucleares, (D), la migración celular (E)
Δψ
m pérdida fueron especialmente analizados como se describe en "Materiales y métodos".
Discusión
el cáncer es una enfermedad compleja y las terapias contra el cáncer tradicionales no han progresado de manera significativa en los últimos años. Las principales limitaciones de la cirugía, la quimioterapia y la radioterapia son que causan efectos secundarios graves y mal pronóstico debido a la toxicidad del tejido no canceroso y quimio-resistencia [19]. Sin embargo, la medicina natural ha despertado gran preocupación en el ámbito de la quimioterapia contra el cáncer debido a la seguridad, la eficacia y la resistencia a múltiples fármacos anti-
.
Gyp se ha utilizado como medicina herbal tradicional china desde hace cientos de años debido a su variedad de la salud beneficios [20] - [22]. En el presente estudio, Gyp inducida por apoptosis en las células humanas de cáncer colorrectal SW-480 se investigó.
Los resultados mostraron que Gyp disminuyó el porcentaje de células viables en células SW-480. Mientras tanto, los estudios anteriores han demostrado que el efecto citotóxico de Gyp sobre las células normales PBMC fue mucho menos [23]. Los resultados sugieren que Gyp es capaz de ejercer citotoxicidad diferente alternativa en células de cáncer y células normales, lo que podría ser potencialmente útil como agente de prevención o tratamiento del cáncer.
La línea celular SW-480, establecida a partir de la adenocarcinoma primario que surge en el colon, era de pato etapa B (Dukes B significa que el cáncer ha crecido a través de la capa muscular del colon o del recto, a través invadido pared del tambor, pero los ganglios linfáticos claras) [24]. Propagación es a través de la invasión local a través de la pared del recipiente y a través de los vasos linfáticos locales, la sangre de la vena porta (en el hígado) y transcelómica. Por lo tanto, la metástasis es uno de los mayores desafíos para un tratamiento exitoso del cáncer [25] y la prevención de la metástasis del cáncer es tan importante objetivo de mejorar el pronóstico del paciente. En este estudio, se investigó si Gyp podría inhibir la migración de células SW-480. Resultados en la Figura 8 sugieren Gyp inhibió la migración del tipo celular de una manera dependiente de la dosis Gyp. El citoesqueleto de actina es una red estructural de las proteínas que son esenciales para múltiples funciones biológicas, incluyendo la contracción celular, la motilidad celular y el tráfico de vesículas et al [26], [27]. Los cambios en los compartimentos celulares pueden afectar la dinámica de la adhesión celular [18]. La figura 9 expone los cambios de microfilamentos, disposición desordenada de la desaparición de F-actina y completa de la red de microfilamentos se observó en 100, 130 mg /ml Gyp. Además, como se muestra en la figura 10, el número de microvellosidades se redujo significativamente cuando la dosis Gyp fue 70 mg /ml o superior. Los resultados sugieren Gyp inducir el colapso de la red de microfilamentos, y, finalmente, herir la forma de la célula y la capacidad de migración.
La apoptosis desempeña un papel importante en la homeostasis y pueden ser inducidos y regulados por muchas vías de señal de estímulo [28], [29 ]. La desregulación de la apoptosis se considera como una característica importante del cáncer, de modo que la inducción de apoptosis es posiblemente el más potente defensa contra el cáncer [30], [31]. Muchos estudios han puesto de manifiesto que diversos compuestos extraídos de plantas podrían inducir la apoptosis en muchas células cancerosas [29], [32], [33]. la fragmentación del ADN y algunas características morfológicas incluyendo formación de ampollas en la membrana, el encogimiento celular, la condensación de la cromatina y la formación de cuerpos apoptóticos son característica bioquímica típica de la apoptosis [34], [35]. En este estudio, Gyp fue capaz de causar la fragmentación del ADN evidente en las células SW-480 de una manera dosis-y dependiente del tiempo. Además, Hoechst 33342 ensayo de tinción muestra algunas características morfológicas después del tratamiento Gyp tales como el encogimiento celular, la condensación de la cromatina con marginación de la cromatina a la membrana nuclear y punteada fragmentada fluorescencia nuclear azul en células SW-480. Finalmente, la figura 7 sugiere el Gyp podría aumentar significativamente las células apoptóticas y disminuir las células viables, lo que indica la respuesta apoptótica se potenció notablemente después de Gyp en células SW-480. Por lo tanto, los resultados indican Gyp podría inducir la apoptosis en las células SW480.
El daño del sistema de membrana celular causará despolarización de la membrana, disturbe la asimetría de los lípidos de membrana, inducir la inhibición de enzimas de la membrana, causa perdida de la integridad de la membrana plasmática [36 ], y estas funciones celulares, finalmente, pueden inducir apoptosis de las células por el acoplamiento de los receptores de muerte [37]. La tinción con PI y se analizaron por citometría de flujo demostraron que Gyp causó daños en la membrana celular es un evento temprano. Los autores especulan que el mecanismo de gypenosides en daño de la membrana plasmática tal vez debido a las agliconas de los gypenosides [38] tienen su sitio de acción en la membrana celular, membrana celular con ello dañar o células que entran para prevenir el crecimiento del tumor.
La mitocondrias juegan un papel importante en la progresión de la apoptosis [39]. Por lo tanto, la mitocondria membrana de cambios potenciales tras la diferente concentración de tratamiento Gyp en células SW-480 se midió. En el estudio, la disminución de
Δψ
m temprana estaba en 4 h después del tratamiento Gyp y mejorado mediante el aumento de la concentración de Gyp, lo que sugiere Gyp la apoptosis celular inducida en células SW-480 podría ser mitocondrias dependientes.
Además, la mejora de la producción de ROS se ha asociado con la respuesta apoptótica inducida por varios compuestos pro-apoptóticos [40]. Nuestros resultados mostraron tratamiento Gyp estimuló significativamente la generación de ROS en células SW-480. NAC, un eliminador de ROS, se utilizó para confirmar el efecto de ROS después del tratamiento Gyp. NAC rescató significativamente Gyp citotoxicidad inducida SW-480, la generación de ROS intracelular, cambios morfológicos nucleares y la inhibición de la migración celular, pero no el
Δψ
m disminución, lo que implica ROS juega un papel importante en Gyp inducida SW-480 la toxicidad celular y la apoptosis de las células, y la generación de ROS fue aguas abajo de daños mitocondrias tratamiento post Gyp, y el aumento de la producción de ROS pueden ser estimulan por las mitocondrias dañadas en nuestro sistema experimental.
en conclusión, el presente estudio se evaluó la citotoxicidad de Gyp en células SW-480, demostró que Gyp podría causar daños en la integridad de la membrana celular, disminuir el
Δψ
nivel m, inducir la fragmentación del ADN e iniciar la respuesta de apoptosis en las células SW-480. ROS generado en SW-480 células juegan un papel importante en Gyp la muerte celular inducida. Y, se especula que la apoptosis inducida por Gyp celular en células SW-480 podría ser la muerte receptores vía y las mitocondrias dependiente. Además, nuestro estudio también mostró que Gyp podría ejercer un efecto inhibitorio sobre la migración celular
in vitro
y el colapso de la red de microfilamentos grave, así como la disminución significativa en el número de microvellosidades. Estos resultados sugieren Gyp inducir el colapso de la red de microfilamentos y lesione a la forma de la célula y la capacidad de migración. Estos estudios sugieren Gyp puede tener un gran valor en los tratamientos de cáncer colorrectal humano. Se necesitan más investigaciones para explicar los mecanismos moleculares de Gyp en la terapia del cáncer.