Extracto
El cáncer de ovario, uno de los cánceres asociados con la inflamación, es la quinta causa principal de cáncer muertes entre las mujeres. La inflamación en el microambiente tumoral se asocia con difusión tumor peritoneal y masivas ascitis, que contribuyen a la alta mortalidad en el cáncer de ovario. p53 supresor de tumor es con frecuencia eliminado o mutado en el cáncer agresivo y de alto grado de ovario, probablemente agravar la progresión del cáncer y el aumento de la mortalidad. Por ello, investigó la influencia de la p53 en las quimiocinas proinflamatorias en células de cáncer de ovario. Una matriz de PCR de la red de quimioquinas reveló que las células de cáncer de ovario con baja expresión o mutado p53 expresan altos niveles de quimiocinas proinflamatorias tales como CXCL1, 2, 3 y 8. La transfección transitoria de p53 en células de cáncer de ovario p53 nulo downregulated quimiocinas proinflamatorias inducidas por factor de necrosis tumoral-α (TNF), una citoquina proinflamatoria abundantemente expresado en el cáncer de ovario. Además, la restauración de p53 o la estabilización bloquearon la actividad del promotor de NF-kappa B inducida por TNF y la reducción de I? B TNF-activado. Restauración de p53 aumentó la ubiquitinación de I? B, como resultado de la actividad del proteasoma simultáneamente reducida seguido por la estabilidad de I? B. A ubiquitinación PCR array en la restauración de p53 no reveló ningún cambio significativo en la expresión excepto por Mdm2, que indica que el equilibrio entre p53 y Mdm2 es más importante en la regulación de NF-kB de señalización en lugar de el efecto directo de p53 en los genes relacionados con ubiquitina o quinasas I? B. Además, nutlin-3, un inductor específico de la estabilización de p53, inhibe quimiocinas proinflamatorias mediante la reducción de I? B TNF-activa a través de la estabilización de p53. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que p53 inhibe quimiocinas proinflamatorias en células de cáncer de ovario mediante la reducción de la degradación proteasomal de I? B. Por lo tanto, es frecuente la pérdida o mutación de p53 puede promover la progresión tumoral mediante el aumento de la inflamación en el microambiente tumoral
Visto:. Son DS, Kabir SM, Dong YL, Lee E, Adunyah SE (2012) Efecto inhibidor del supresor de tumores p53 en la expresión de quimioquinas proinflamatorias en células de cáncer ovárico mediante la reducción de Proteasomal La degradación de I? B. PLoS ONE 7 (12): e51116. doi: 10.1371 /journal.pone.0051116
Editor: Ashok Kumar, Escuela de Medicina de la Universidad Estatal de Wayne, Estados Unidos de América
Recibido: 28 Junio, 2012; Aceptado: 29 de octubre de 2012; Publicado: 31 de diciembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Son et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud NIAID SC1AI089073 (DS), NIGMS SC1 089630 (EL), el NCI U54CA163069-02 y NIMHD U54MD007593-04 (SA) de los Institutos nacionales de Salud. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario es la quinta causa principal de muerte por cáncer entre las mujeres, ya que es normalmente asintomática y con frecuencia se diagnostica tarde hasta que los tumores se han extendido mucho más allá de los ovarios [1]. Aunque la etiología exacta sigue siendo desconocido, el aumento de la evidencia indica que el cáncer de ovario se asocia con inflamación crónica [2] - [3]. tejido de cáncer de ovario expresa altos niveles de CXCL1; de manera similar, los niveles séricos de CXCL1 son más altos en pacientes con cáncer de ovario que en los controles [4] - [5]. Avanzada (menos diferenciado) de cáncer de ovario también sobreexpresan CXCL8 en los fluidos del quiste de la [6] y las células tumorales [7]. También se ha encontrado fluido ascítico carcinoma de ovario que contienen altos niveles de CXCL8 [8]. Además, las líneas celulares de ovario resistentes a paclitaxel expresan aumentaron CXCL8 en comparación con las células de paclitaxel sensible a [9]. reacción inflamatoria induce quimioquinas proinflamatorias tales como principalmente CXCL1, 2 y 8 a través de NF-kB de señalización en las células cancerosas epiteliales de ovario [10]. También es conocido microambiente tumoral proinflamatoria promover la progresión del cáncer. Por lo tanto, en conjunto, estos factores probablemente contribuyen a las características clínicas de cáncer de ovario que causan una alta mortalidad, tales como la diseminación tumoral peritoneal y ascitis masiva
Si bien se desconoce el mecanismo por el cual la regulación positiva de quimiocinas proinflamatorias en el cáncer de ovario.; la causa más probable es la activación de NF-kB resultante de la pérdida del gen supresor tumoral p53. alteraciones genéticas en p53 como la mutación y supresión se observan con frecuencia en el cáncer de ovario malignos de alto grado [11]. La evidencia acumulada indica que p53 reprime NF-kB señalización a través de regulación a la baja de I? B quinasa (IKK) [12] - [14] o la competencia por los coactivadores transcripcionales p300 /CREB-proteína de unión (CBP) [15] - [17]. Curiosamente, otros han encontrado que p53 promueve la activación de NF-kappa B [18] - [19]. A pesar de los efectos controvertidos de p53 en NF-kB de señalización, mutaciones o deleciones de p53 puede agravar la progresión del cáncer de ovario basado en el hecho de que los ratones deficientes para p53 son propensos a desarrollar cáncer [20]. Por lo tanto, la hipótesis de que la pérdida funcional de p53 en el cáncer de ovario puede aumentar la expresión de quimiocinas proinflamatorias por la señalización-de restricción de NF-kB.
En este estudio se restauró p53 en células de cáncer de ovario para determinar sus efectos sobre la expresión de quimiocinas proinflamatorias en respuesta a estímulos inflamatorios. Además, hemos explorado el mecanismo por el cual esto podría ocurrir mediante la medición de la degradación de I? B, la actividad del proteasoma, y la expresión de Mdm2, un regulador negativo de p53 y una ubiquitina ligasa E3.
Materiales y Métodos
Reactivos
TNF humano recombinante y p53 humano kit DuoSet® IC ELISA se obtuvieron de R & amp; D Systems (Minneapolis, MN). Los anticuerpos fueron adquiridos de los siguientes proveedores: p65, Mdm2 y β-actina de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA) y p53, p21, I? B fosforilada, I? B, ubiquitina y isoformas IKK de Señalización Celular Tecnología (Beverly, MA). Lipofectamine 2000, TRIzol®, M-MLV, Taq ADN polimerasa, y todos los medios de cultivo líquidos se adquirieron de Invitrogen (Grand Island, NY). La matriz de PCR para quimiocinas personalizados humanos y la ruta de ubiquitinación, cebadores de PCR para CCL20, CXCL1, 2, 3, 8 y β-actina, y SYBR verde Master Mix vino de SABiosciences /Qiagen (Frederick, MD). Nutlin-3 se adquirió de Cayman Chemical (Ann Arbor, MI). kits de detección de quimioluminiscencia vinieron de GE Healthcare (Piscataway, NJ). La expresión de p53 y vectores pNF-B-luc procedían de BD Biosciences (Palo Alto, CA). El sistema de ensayo y ensayo de luciferasa proteasoma reportero se obtuvieron de Promega (Madison, WI).
Líneas celulares y cultivo celular
Las líneas celulares de cáncer de ovario humano OVCAR-3, Skov-3, Caov -3 y TOV-21G fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). líneas celulares de cáncer de ovario A2780 y IGROV-1 con p53 fueron amablemente proporcionados por el Dr. Andrew Godwin (Fox Chase Cancer Center, Filadelfia, PA) [21] y el Dr. Khabele (Universidad de Vanderbilt, Nashville, TN) [22], respectivamente. Las células humanas (aproximadamente 5 × 10
4 células /ml) se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera saturada de agua de 95% de aire y 5% de CO placas
2 en 24 ó 6 pocillos con medio RPMI que contiene 10% de FBS con penicilina (100 U /ml) /estreptomicina (100 U /ml). La línea de ratón de ovario epitelial superficie de las células cancerosas (ID8) fue proporcionado amablemente por los Drs. Katherine Roby y Paul Terranova (Universidad de Kansas Medical Center, Kansas City, KS) [23]. las células se cultivaron en ID8 Eagles modificado de medio de Dulbecco (DMEM) que contenía 4% FBS suplementado con penicilina /estreptomicina. Después de cultivo durante la noche para permitir la unión celular a las placas, se retiró el medio y se añadió medio fresco sin FBS para eliminar los efectos de suero.
array PCR y PCR en tiempo real
Después de aislar RNA total y la eliminación de ADN genómico, la reacción de RT se realizó a 42 ° C durante 15 min seguido de 94 ° C durante 5 min. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, una reacción de PCR en tiempo real se realizó utilizando un Bio-Rad CFX96 (Hercules, CA) con el siguiente programa de ciclos de dos pasos: 1 ciclo a 95 ° C durante 10 min, y 40 ciclos a 95 ° C durante 15 segundos ya 60 ° C durante 1 min. Se llevó a cabo el análisis de datos basado en una matriz basada en Web PCR protocolo de Análisis de Datos (http://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php) proporcionada por SABiosciences de Qiagen (Frederick, MD).
transitoria de transfección y luciferasa ensayos
células de cáncer de ovario humano en aproximadamente 50% de confluencia en 6 o placas de 24 pocillos se lavaron una vez con medio fresco sin aditivos y se transfectaron de forma transitoria durante 24 horas a 37 ° C usando solución de Lipofectamine. Se trataron células transfectadas como se describe en Resultados y se incubaron durante 6 h. Después de aclarar las células con PBS enfriado en hielo y la adición de tampón de lisis (Promega, Madison, WI), los lisados celulares se utilizaron para la determinación de la actividad de luciferasa usando un luminómetro de microplacas. La actividad de luciferasa, expresada como unidades relativas de luz, se normalizó a los niveles de proteína medidos.
Western blot
Se prepararon lisados celulares, se resolvieron en geles de SDS-poliacrilamida, y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa de acuerdo con establecido procedimientos como se describe anteriormente [10]. El bloqueo de proteínas no específicos se realizó por incubación de las membranas con leche descremada en polvo 5% en solución salina tamponada con Tris Tween-20 durante 2 h a temperatura ambiente. Las transferencias se incubaron con anticuerpos primarios a una dilución 1:1,000 en solución de bloqueo durante la noche a 4 ° C. Las membranas se lavaron 3 veces con TBST durante 10 min y se incubaron durante 1 h con anticuerpo secundario de rábano picante conjugada con peroxidasa en 1:2,500 en 5% de leche /TBST. Las membranas se aclararon a continuación 3 veces con TBST durante 10 min y las bandas se visualizaron por quimioluminiscencia potenciada. Después de membrana de separación de 10 min con metanol que contiene 3% H
2O
2, β-actina se detectó con el fin de servir como un control de carga interno.
inmunoprecipitación (IP) e inmunotransferencia (IB se prepararon)
Los lisados celulares (1,000 g de proteína celular total /ml) y se incubaron con 10 l de anticuerpo primario durante 2 horas a 4 ° C. A continuación, se añadieron 20 l de proteína A /G PLUS-agarosa y los lisados celulares se incubaron a 4 ° C en un agitador durante la noche. Los sedimentos se recogieron por centrifugación a aproximadamente 1.000 ×
g
durante 5 min a 4 ° C. Después de desechar cuidadosamente el sobrenadante, los sedimentos se lavaron 3 veces con tampón RIPA por centrifugación a aproximadamente 1000 x
g
durante 5 min a 4 ° C. Después del lavado final, los sedimentos se resuspendieron en 40 l de tampón de muestra 2 × electroforesis y se hirvieron durante 2 min. Electroforesis e inmunotransferencia se realizó tal como se describe en el Western Blot
ligado a enzimas (ELISA)
actividad de p53 humano se mide por la p53 humana kit ELISA (I + amp;.; D Systems, Minneapolis, MN ) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se determinó la densidad óptica de cada pocillo, utilizando un lector de microplacas ajustado a 450 nm con la corrección de longitud de onda a 570 nm.
basado en células proteasoma ensayo
Después de la transfección transitoria de p53 en 24 pocillos placas, las células se incubaron con el ensayo basado en células Reactivo Promega proteasoma-Glo ™ de tipo quimotripsina (Promega, Madison, WI) durante 10 min según las instrucciones del fabricante. Se determinó la actividad luciferasa utilizando un luminómetro de microplacas.
Estadísticas
Los datos fueron analizados por los de Student apareado
t-test
y una forma de análisis de varianza (ANOVA) en su caso . Si la significación estadística (p = 0.05) fue determinada por ANOVA, los datos fueron analizados por comparación por pares de Tukey para detectar diferencias específicas entre los tratamientos.
Resultados
Firma de la red de quimioquinas y p53 en el ovario células de cáncer de
Como una prueba preliminar de si la pérdida de p53 en células de cáncer de ovario aumenta la expresión de citocinas proinflamatorias, se analizó la expresión de quimioquinas y p53 en las líneas celulares de cáncer de ovario establecidos ID8, OVCAR-3, Skov-3 , A2780, Caov-3 y TOV-21G. Se utilizó una matriz de PCR para la red de quimioquinas, que incluye genes de quimioquinas y receptores de quimioquinas, y se determinó umbrales de ciclo promedio de & lt; 25 ciclo a & gt; 35 ciclos. Los resultados revelaron una alta expresión de quimiocinas en las siguientes líneas celulares de cáncer de ovario: CCL20 y 28, CXCL1, 2, 3 y 8 en células OVCAR-3; CCL28 y CXCL1 en células SKOV-3; CXCL1, 2 y 8 en Caov-3 células; y CXCL2 en células TOV-21G (Figura 1A). Curiosamente células A2780 fueron no expresa o expresaron bajos niveles de casi todas las quimiocinas en comparación con otras células de cáncer de ovario. Además, CCR1 y CXCR4 fueron altamente expresado en las células A2780 y Caov-3, respectivamente (Figura 1B). Incluso p53 de tipo salvaje células IGROV-1 expresadas altamente CXCL3, CXCL14, CCR10 y CXCR4 (Figura S1 A).
(a) la firma de ligandos de quimiocinas y (b) los receptores de quimioquinas en líneas celulares de cáncer de ovario humano. Después de aislar el ARN total de cada línea celular, matriz de PCR se realizó usando una placa de matriz de PCR personalizados que contienen secuencias complementarias de los genes de quimioquinas humanos. Los diferentes colores indican umbral de ciclo medio con la expresión varía de & gt; 35 a & lt; 25. (C) La expresión proteica de p53 y Mdm2 en líneas celulares de cáncer de ovario. Lisados de células enteras se prepararon y Western blot se llevó a cabo utilizando anticuerpos específicos para p53, Mdm2 y β-actina como control de carga. Los experimentos se realizaron por duplicado y se muestra un resultado representativo. OV, 3-OVCAR células; SK, 3-SKOV células; A, las células A2780; Ca, 3-Caov células; TOV, células TOV-21G.
Además, se analizaron los niveles de proteína de p53 y Mdm2 en las mismas líneas celulares. OVCAR-3 células altamente expresado la proteína p53, mientras que ID8 y células A2780 expresaron niveles relativamente bajos de p53. Claramente, SKOV-3, las células Caov-3, y TOV-21G no expresan p53. También se examinó la expresión de Mdm2, un regulador negativo de p53. Mdm2 fue altamente expresado en las células A2780 y OVCAR-3 en contraste con ninguna expresión en ID8 y Caov-3 células (Figura 1C). células Skov-3 y TOV-21G expresaron Mdm2 a pesar de la pérdida de p53 (Figura 1C). Estos resultados sugieren que p53 está ausente o se expresa en niveles muy bajos en la mayoría de las líneas celulares estudiadas.
Efecto de p53 sobre quimiocinas inducidas por TNF
TNF es una citoquina proinflamatoria abundantemente expresado en el cáncer de ovario [24]. Se seleccionaron células SKOV-3 como un modelo de células de cáncer de ovario p53 nulo para identificar quimioquinas sensibles a TNF. TNF inducida específicamente quimiocinas proinflamatorias tales como CCL20, CXCL1, 2, 3 y 8 (Figura 2A). Además, transfectadas transitoriamente p53 en células SKOV-3 para medir la influencia de la p53 en las quimiocinas inducidas por TNF (Figura 2B). Restauración de p53 en células SKOV-3 llevó a regulación a la baja de las quimiocinas proinflamatorias, tanto basal y los niveles de TNF inducida (Figura 2C). Estos resultados sugieren que la pérdida funcional de p53 en cáncer de ovario puede aumentar la expresión de quimiocinas proinflamatorias, dando como resultado a la inflamación en el microambiente tumoral.
(A) quimiocinas inducidas por TNF en células SKOV-3. Después de aislar el ARN total, matriz de PCR se realizó usando una placa de matriz de quimioquinas PCR humana. La línea punteada indica aumento de 2 veces; quimiocinas con un aumento mayor de 2 veces se reconocen como quimiocinas inducidas por TNF. (B) Confirmación de la expresión de la proteína p53 después de la transfección transitoria en células SKOV-3. Después de la transfección de vector vacío (EM) y vector de expresión de p53 (p53), lisados de células enteras se prepararon y la expresión de p53 fue confirmada por Western blot. β-actina se usa como control de carga. (C) Efecto de p53 sobre quimiocinas inducidas por TNF. Después de la transfección durante la noche de los vectores, las células se trataron con TNF (10 ng /ml) durante 1 h y QRT-PCR se llevó a cabo utilizando cebadores para CCL2, CXCL1, 2, 3 y 8. β-actina sirve como control de normalización. Letras diferentes indican diferencias significativas (p = 0.05) dentro de cada grupo de quimioquinas (ANOVA y de Tukey de comparaciones por pares). Los experimentos se realizaron por triplicado y todos los datos se muestran como media ± SE.
Efecto de p53 promotor de la actividad de NF-kappa B y TNF-I? B activado
quimiocinas inducidas por TNF, tales como CCL20, CXCL1, 2, 3 y 8 contienen sitios kappa B proximales en sus promotores (Figura 3A). Por lo tanto, empleó un reportero de luciferasa vector impulsado por NF-kappa B para confirmar la implicación de NF-kB en el efecto inhibidor de p53 en TNF y p65 (una subunidad de NF-kappa B) inducción de la expresión de quimioquinas. Se seleccionaron tres líneas celulares que varían en función de la expresión de p53: Skov-3 (p53 null), A2780 (p53 de tipo salvaje) y células OVCAR-3 (mutante p53) [25] - [26]. Independientemente del estado de p53, p53 restauración promotor de la actividad NF-kB p65 inducida (Figura 3B) redujo significativamente el TNF y. Estos resultados sugieren que la pérdida de p53 en el cáncer de ovario puede aumentar quimiocinas proinflamatorias mediante la mejora de la actividad del promotor de NF-kappa B en respuesta a la reacción inflamatoria.
(A) secuencias de nucleótidos de los promotores de quimiocinas inducidas por TNF tales como CCL20, CXCL1 , 2, 3 y 8. Estos promotores de quimioquinas contienen un sitio NF-kappa B en la región proximal, a excepción de CCL20, que tiene dos sitios de NF-kB en la región distal y proximal. (B) Efecto de p53 sobre la actividad de la luciferasa NF-kB. Después de la transfección de vectores o cotransfección con p65, las células se trataron con TNF (10 ng /ml) durante 4 h. (C) Efecto de p53 en I? B TNF-activado. Después de la transfección de un vector vacío o p53 en SKOV-3 (p53 null), OVCAR-3 (mutante p53) y A2780 (p53 de tipo salvaje), las células se trataron con TNF (10 ng /ml) durante los tiempos indicados. β-actina sirve como control de carga. Los experimentos se realizaron por duplicado y se muestra un resultado representativo; los números a continuación son valores de densidad relativa.
explorado más a fondo si p53 afecta a la activación inducida por TNF de I? B en estas células transfectadas transitoriamente. Aunque la restauración de p53 no tuvo un efecto apreciable sobre el TNF-I? B activado a través de 5 30 minutos, se redujo la activación de I? B en 1 a 2 h. A pesar de la variación de la expresión de p53, este efecto reducido en los puntos finales de tiempo fue similar en todas las líneas celulares ensayadas (Figura 3C). reducción de la activación de I? B en los puntos finales de tiempo sugieren que p53 puede afectar a los eventos relacionados con el complejo NF-kB (I? B-p65 /p52) en lugar de una aguas arriba de NF-kB en las células de cáncer de ovario.
Participación de p53 en la degradación de I? B
Un mecanismo por el que se regula I? B es por la degradación proteasomal después de ubiquitinación. Hemos investigado si este mecanismo estaba involucrado en la capacidad de p53 para reducir la activación de I? B. Después de la transfección transitoria de p53, se confirmó la función de p53 mediante el examen de si el aumento de expresión de p21, un potente inhibidor dependiente de ciclina quinasa estrechamente controlada por p53. células A2780 expresan constitutivamente p21 mientras que OVCAR-3 y SKOV-3 células no expresan p21. La sobreexpresión de p53 aumentó el nivel de proteína p21 en todas las líneas celulares (Figura 4A). Además, p53 mejora de forma significativa la acumulación de proteínas ubiquitinated en todo el lisados celulares (Figura 4A), probablemente mediante la interrupción de la degradación del sistema. ensayo de ELISA reveló que la restauración de p53 aumentó la actividad de p53 en todas las líneas celulares (Figura 4B). Las células A2780 p53 de tipo salvaje expresaron actividad de p53 basal mientras que p53 mutante OVCAR-3 y p53 nulos SKOV-3 células no mostraron ninguna actividad de p53 (Figura 4B). Para determinar la causa de esta acumulación, se midió la actividad del proteasoma y nos pareció que fue reducido por la sobreexpresión de p53 en todas las líneas celulares ensayadas (Figura 4C). Por otra parte, después de la inmunoprecipitación de I? B, se confirmó que la p53 aumenta la ubiquitinación de I? B (Figura 4D). La acumulación de I? B ubiquitinada por p53 sugiere que bloquea p53 degradación de I? B mediante la reducción de la actividad del proteasoma en células de cáncer de ovario.
(A) Efecto de p53 en las proteínas ubiquitylated acumulado. Después de la transfección transitoria de p53 en A2780, OVCAR-3 y SKOV-3 células, lisados de células enteras se prepararon y Western blot se llevó a cabo utilizando anticuerpos específicos para ubiquitina, p21, I? B, p53 y β-actina (como control de carga). Los experimentos se realizaron por duplicado y se muestra un resultado representativo. (B) Confirmación de la actividad de p53 después de la transfección transitoria de p53. ELISA se realizó por triplicado y los datos se muestran como media ± SE. barras de color gris oscuro indican la significación (p & lt; 0,05, Student pareada
t-test
) dentro de cada línea celular. (C) El efecto de p53 en la actividad del proteasoma. Los ensayos se realizaron por triplicado y los datos se muestran como media ± SE. barras de color gris oscuro indican la significación (p & lt; 0,05, Student pareada
t-test
) dentro de cada línea celular. (d) los efectos de p53 en la ubiquitinación de I? B. Inmunoprecipitaron I? B se inmunotransferencia usando el anticuerpo ubiquitina. Los experimentos se realizaron por duplicado y se muestra un resultado representativo.
Efecto de p53 en los genes relacionados con la ubiquitina-
El efecto de p53 en los genes relacionados con ubiquitina se muestra en la tabla 1. aunque disminuyó la actividad del proteasoma que explicaría el aumento de las proteínas ubiquitina, aumento de la expresión de genes relacionados con ubiquitina también podrían contribuir. Por lo tanto, utilizando una matriz de PCR se investigó si p53 afecta directamente relacionados con los genes de ubiquitina-ubiquitina tales como enzimas de activación de (E1), enzimas ubiquitina conjugación de (E2) y ligasas de ubiquitina-proteína (E3). Una matriz de PCR para genes de ubiquitinación revelado que la sobreexpresión de p53 no tuvo efectos directos en E1 o E2 excepto una disminución de aproximadamente 2 veces de UBE2E2 en células SKOV-3. Aunque en A2780 y células OVCAR-3, la sobreexpresión de p53 provocó un aumento de 2-3 veces en la ubiquitina ligasas CUL9 y RNF148 expresión, respectivamente, matriz de PCR reveló que estos genes se expresaron en niveles bajos. Es interesante que la p53 aumentó específicamente la expresión de Mdm2, un regulador negativo de la supresor tumoral p53 y una ubiquitina ligasa E3, en todas las líneas celulares ensayadas. Cabe destacar que el efecto de aumento de p53 en Mdm2 fue 1,53 veces en las células A2780, 5,41 veces en OVCAR-3 y 3,13 veces en células SKOV-3. Mdm2 como un gen p53 inducible en genes relacionados con ubiquitina es probable que participen en la represión de la actividad de p53 que atenúa NF-kB de señalización a través de un bucle de realimentación negativa de autorregulación.
Efecto de p53 sobre la expresión de Mdm2, unión con componentes de NF-kB y isoformas IKK
sobre la base de mRNA Mdm2 p53 inducida indicado por matriz de PCR (Tabla 1), el próximo confirmó el aumento de la expresión de la proteína Mdm2 por p53 en A2780, OVCAR-3 y SKOV -3 células por Western blot (Figura 5A). Debido a I? B? Se sabe que se unen a p53
in vitro
[27] y reprimir los efectos dependientes de p53 [28], la sobreexpresión de p53 podría disminuir la señalización de NF-kappa B mediante la unión a p65 y I? B. La inmunoprecipitación de p53 revelaron que la restauración de p53 no tuvo ningún efecto significativo en la unión a p53 o bien p65 o I? B (Figura 5B). Debido a la pérdida de p53 es conocido para mejorar la actividad de IKK o IKKβ [12] - [13], se aclaró si p53 estaba involucrado en la regulación de la expresión de IKK. Aunque cada línea celular expresa una combinación distinta de las isoformas IKK (IKKβ se expresó en todas las líneas celulares ensayadas, las células SKOV3 expresado IKKγ en lugar de IKK, y IKKε no se expresa en cualquier línea celular), la sobreexpresión de p53 no tuvo ningún efecto sobre la expresión de IKK y fosforilación en cualquier línea celular (Figura 5C). Estos resultados sugieren que tal vez efecto dominante de p53 sobre Mdm2 es más importante para la atenuación de NF-kB de señalización en lugar de efectos directos sobre aguas arriba o componentes de NF-kB.
(A) Efecto de p53 sobre la expresión de Mdm2. Después de la transfección transitoria de p53 en A2780, las células OVCAR-3 y Skov-3, lisados de células enteras se prepararon y Western blot se llevó a cabo utilizando anticuerpos específicos para Mdm2; y β-actina sirvió como control de carga. (B) Efectos de la expresión de p53 en la unión a p65 y p53 I? B. Después de la transfección transitoria de p53, p53 inmunoprecipitado (IP) se inmunotransferencia (IB) utilizando p65 o el anticuerpo I? B. (C) Efecto de p53 sobre la expresión de varias isoformas IKK. Después de la transfección transitoria de p53, lisados de células enteras se prepararon y Western blot se llevó a cabo utilizando anticuerpos específicos para IKK, IKKβ, IKKγ, IKKε; β-actina sirvió como control de carga. Los experimentos se realizaron por duplicado y se muestra un resultado representativo.
Efecto de nutlin-3, un inductor específico de la estabilización de p53, en quimiocinas inducidas por TNF
Hemos empleado nutlin-3 como un estabilizador de p53 para confirmar el efecto inhibidor de p53 en la expresión de quimioquinas inducida por TNF. Nutlin-3 no tuvo efecto sobre la actividad del promotor de NF-kappa B inducida por TNF en nulo p53 células SKOV-3, pero redujo su actividad en células SKOV-3-p53 sobreexpresada (Figura 6A). Continuamente se exploró si nutlin-3 afecta a TNF-I? B activadas en Skov-3 células p53 se sobreexpresa. Nutlin-3 reduce I? B TNF-activado mediante la estabilización de p53, como se indica con el aumento de MDM2 (Figura 6B). La estabilización de p53 por nutlin-3 en células SKOV-3-p53 sobreexpresada llevó a regulación a la baja de las quimiocinas proinflamatorias TNF inducida (Figura 6C). Estos resultados confirman que la pérdida funcional de la actividad de p53 en cáncer de ovario puede aumentar la expresión de quimiocinas proinflamatorias, aumento de la carga la inflamación en el microambiente tumoral. Además, se emplearon p53 de tipo salvaje células IGROV-1 para confirmar en el efecto inhibidor de nutlin-3 en I? B TNF-activado. Nutlin-3 disminuyó I? B-TNF activado mediante la estabilización de p53 como se indica con el aumento de p21 y MDM2 a pesar de la baja expresión basal de p53 (Figura S1B). Aunque las células IGROV-1 expresadas altamente IKK y IKKβ (IKKγ se expresó humilde y IKKε no se expresó), nutlin-3 no tuvieron efecto sobre la fosforilación de IKK (Figura S1C). Además, se investigó el efecto diferencial de la nutine-3 en la I? B-TNF activado entre p53 de tipo salvaje de p53 y A2789 células mutantes OVCAR-3. Nutlin-3 reducido TNF-I? B activado en las células A2780 p53 de tipo salvaje mediante la estabilización de p53 seguido de p21 y de aumento de MDM2 (Figura S2A). Por otro lado, nutlin-3 no tuvo efecto en las células mutantes p53 OVCAR-3, como se indica con ningún cambio de p53 y MDM2 (Figura S2B). Otros autores también demostraron que nutlin-3 estabiliza p53 con el aumento de p21 y MDM2 en otras células p53 de tipo salvaje, pero no en las células mutantes de p53 [29] - [30]. Nutlin-3 no afectó IKK TNF-activado tanto en las células (Figura S2). Estos resultados confirman que la ganancia funcional de p53 es más importante para la atenuación de señalización NF-kB en lugar de efectos directos sobre aguas arriba de NF-kB.
(A) Efecto de nutlin-3 sobre la actividad de la luciferasa NF-kB. Después de la transfección de vectores o cotransfección con p53, las células fueron pretratadas con nutlin-3 (10 mM) durante 24 h seguido de TNF (10 ng /ml) durante 4 h. Letras diferentes indican diferencias significativas (p = 0.05) dentro de cada grupo (ANOVA y de Tukey de comparaciones por pares). Los experimentos se realizaron por triplicado y todos los datos se muestran como media ± SE. (B) Efecto de nutlin-3 en la I? B-TNF activado. Después de la transfección de un vector vacío o p53 en células SKOV-3, las células fueron pretratadas con nutlin-3 (10 mM) durante 24 h seguido de TNF (10 ng /ml) durante los tiempos indicados. β-actina sirve como control de carga. Los experimentos se realizaron por duplicado y se muestra un resultado representativo. (C) Efecto de nutlin-3 de quimiocinas inducidas por TNF. Después de la transfección durante la noche de los vectores, las células fueron pretratadas con nutlin-3 (10 mM) durante 24 h seguido de TNF (10 ng /ml) durante 1 h y QRT-PCR se llevó a cabo utilizando cebadores para CCL2, CXCL1, 2, 3 y 8. β-actina sirve como control de normalización. El asterisco indica diferencias significativas (P £ 0,05, Student pareada
t-test
) cuando se compara con la presencia de nutlin-3. Los experimentos se realizaron por triplicado y todos los datos se muestran como media ± SE.
Discusión
Este estudio demuestra que la p53 inhibe quimiocinas proinflamatorias en células de cáncer de ovario. Este efecto de p53 es probable que el resultado de atenuada de señalización NF-kB por disminución de la degradación proteasomal de I? B y los efectos dominantes de p53 Mdm2.
Esta investigación fue motivada por el hecho de que la agresiva y de alto grado de cáncer de ovario, una inflamación asociada a cáncer, con frecuencia implica mutaciones o deleciones de p53 [11]. Nuestro primer experimento de correlación reveló que las células de cáncer de ovario p53 nulo o mutado altamente expresado quimiocinas proinflamatorias tales como CCL20, CCL28, CXCL1, 2, 3 y 8 que está de acuerdo con nuestras observaciones anteriores [10]. Además, CCR1, CCR10 y CXCR4 fueron altamente expresado en las células A2780, Caov-3 células (Figura 1B) y IGROV-1 células (Figura S1A). Debido a CCR1, CCR10 y CXCR4 no son receptores específicos para las quimiocinas proinflamatorias liberadas por las células de cáncer de ovario, estos receptores son propensos a interactuar con las quimiocinas liberadas por otros tipos de células, como las células inmunes y células endoteliales en el microambiente.
expresión inducida por TNF de CCL20, CXCL1, 2, 3 y 8, pero no CCL28 que fue altamente expresado en SKOV-3 y células OVCAR-3 (Figura 1A y 2A). La falta de inducción de CCL28 por TNF en estas células de cáncer de ovario es en contraste con el informe anterior [31] - [32] de que el TNF y la IL-1 aumento expresión de CCL28 en células de queratinocitos humanos y en el epitelio de colon. De hecho, el nivel de CCL28 permaneció invariable en todas las células de cáncer de ovario humano ensayadas (datos no presentados). Esta diferencia indica que la red de quimiocinas es probable que sea regulado de manera diferente en diferentes tipos de células.
Restauración de p53 en las células p53 nulo Skov-3 de expresión atenuada de quimiocinas proinflamatorias, tanto en condiciones basales y de TNF inducida (Figura 2C ). Este resultado indica que la pérdida o mutación de p53 observado con frecuencia en el cáncer de ovario contribuye a quimiocinas proinflamatorias aumentada en el microambiente del tumor, que es conocido para facilitar la progresión del cáncer
.
Debido a que los promotores de CCL20, CXCL1, 2, 3 y 8 contienen sitios kappa B (Fig. 3A) y quimiocinas proinflamatorias están regulados por NF-kB de señalización [10], los efectos de p53 sobre la expresión de quimiocinas probablemente implican cambios en la señalización de NF-kB. En este estudio, la restauración de p53 en células de cáncer de ovario y nutlin-3, un estabilizador de p53, suprime la actividad de TNF inducida por NF-kB promotor (Figura 3B y 6A). Estos resultados confirman y contrastan con los resultados anteriores, ya que se han encontrado efectos contradictorios de p53 en la señalización NF-kB. Cierta evidencia sugiere que p53 activa la subunidad p65 de NF-kappa B a través de la ribosomal S6 quinasa 1 [18] y TNF desencadena un complejo transcripcionalmente activo de p65 y p53 en los elementos de respuesta kappa B, lo que indica que p53 mutado en lugar de la pérdida de p53 contribuye a tumor progresión [19]. Por otra parte, la acumulación de pruebas indica un efecto negativo de p53 en la señalización NF-kappa B, de acuerdo con nuestros resultados. La p53 puede reprimir la señalización NF-kB mediante la interrupción de la expresión de IKK como aguas arriba de la señalización de NF-kB.