Extracto
El antidepresivo fluoxetina ha sido objeto de debate debido a su potencial influencia sobre el riesgo de cáncer. Se encontró para inhibir el desarrollo de lesiones preneoplásicas inducidas por carcinógenos en el tejido de colon, pero los mecanismos de acción no se entiende bien. Por lo tanto, investigamos los efectos anti-proliferativos, y utilizamos HT29 células de tumor de colon
in vitro
, así como C57BL /6 ratones expuestos a tratamiento intra-rectal con el carcinógeno N-metil-N'-nitro-N -nitrosoguanidine (MNNG) como modelos. La fluoxetina aumentó el porcentaje de células HT29 en el G
0 /G
1 fase del ciclo celular, y la expresión de la proteína p27. Esto no se relaciona con una inducción de la apoptosis, especies reactivas del oxígeno o el daño del ADN.
In vivo
, fluoxetina reduce el desarrollo de displasia inducida por MNNG y displasia relacionados con la vascularización en tejido de colon, que se analizó mediante técnicas histopatológicas. Un potencial de anti-proliferativa de la fluoxetina se observó en las zonas epiteliales y del estroma. Esto fue acompañado de una reducción de la expresión de VEGF y del número de células con potencial angiogénico, tales como CD133, CD34, y los grupos de células CD31-positivas. Tomados en conjunto, nuestros resultados sugieren que los objetivos de tratamiento con fluoxetina etapas de la carcinogénesis de colon temprano. Esto confirma su potencial de protección, lo que explica al menos en parte el menor riesgo de cáncer de colon en tratamiento antidepresivo
Visto:. Kannen V, Hintzsche H, Zanette DL, WA Silva Jr, García SB, Waaga-Gasser AM, et al . (2012) antiproliferativos efectos de la fluoxetina sobre las células del cáncer de colon y en un modelo de ratón de colon carcinógeno. PLoS ONE 7 (11): e50043. doi: 10.1371 /journal.pone.0050043
Editor: Nikos K. Karamanos, Universidad de Patras, Grecia
Recibido: 30 de mayo de 2012; Aceptado: 15 Octubre 2012; Publicado: 27 Noviembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Kannen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores recibo descrita de la siguiente apoyo financiero para la investigación de este artículo: DAAD (Deutscher Akademischer Austausch Dienst), CAPES (Coordinación de Perfeccionamiento de Pessoa de Nivel Superior), (CNPq Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico), y la FAPESP (Fundación de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de colon es uno de los principales tumores malignos humanos en todo el mundo, y mucho esfuerzo se ha aplicado a entender el proceso de la carcinogénesis de colon, así como el papel de los tratamientos potenciales y agentes co-terapéuticos contra ella [1] - [3]. Un creciente cuerpo de evidencia sugiere que el uso de fluoxetina (FLX), un antidepresivo que pertenece a los inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina (ISRS), puede estar asociado con un riesgo reducido de cáncer de colon [4] - [6]. Sin embargo, las opiniones controvertidas se han publicado [7] - [13]. Y una identificación de los mecanismos de la actividad de FLX en las células del colon podría ayudar en el esclarecimiento de esta controversia
Recientemente hemos descubierto que redujo el FLX número de 1,2 dimetilhidrazina (DMH) inducida por lesiones colónicas preneoplásicas, denominado focos de criptas aberrantes (ACF) y ejerce una actividad anti-VEGF temprano en las células del estroma, la disminución del número de microvasos dentro pericryptal estroma del colon (PCCS) [5]. estroma tumoral constituye el 60-90% de la masa del tumor de colon [14], y PCCS que rodean la parte inferior cryptal ha informado de iniciar ciertos pasos en el desarrollo de tumores de colon, como el aumento de la proliferación, la formación de microvasos, VEGF-síntesis, la regulación de auto renovación y diferenciación de las células intestinales [15] - [18]. FCA se consideran un modelo adecuado experimental para el estudio de las primeras etapas de la formación del cáncer de colon, debido principalmente a su gran parecido con el desarrollo de cáncer en roedores y seres humanos [17], [19].
(A y B) la producción de ROS se analizó por citometría de flujo, después de la exposición a diferentes concentraciones FLX de 30 min (a), y 4 h (B; * P & lt; 0,05
vs
DMSO). El peróxido de hidrógeno (H
2O
2) se utilizó como control positivo y en ambos casos aplicados por 30 min; unidades arbitrarias (a.u.). (C y D) O
2
- la producción detectada por tinción DHE durante 30 minutos (C; P & gt; 0,05
vs
DMSO), y 4 h (D; p & gt; 0,05). (E y F) el daño de ADN se analizó mediante el ensayo de cometa, después de la exposición a diferentes concentraciones FLX durante 30 minutos (E), y 4 h, con un contenido de% del ADN en la cola representa el daño de ADN (F; * P & lt; 0,05
vs
DMSO). El peróxido de hidrógeno (H
2O
2) se utilizó como control positivo y en ambos casos aplicados por 30 min. (G) La viabilidad y el ensayo de apoptosis (anexina V /PI) realizado por citometría de flujo, después de la exposición a diferentes concentraciones FLX durante 24 horas (
* P & lt; 0,05
vs
DMSO). (H) Distribución de células en fases del ciclo celular se analizaron por citometría de flujo. Teniendo en cuenta es el porcentaje de células HT29 en G
0 /G
1, las fases S y G2 /M con y sin tratamiento FLX durante 24 horas (** P & lt; 0,01 vs DMSO). Todas las figuras muestran los resultados de por lo menos 4 experimentos independientes.
A pesar de FLX se sabe para disminuir la proliferación de células de colon
in vitro
[20], y
in vivo
modelos [5], [21], el mecanismo de su actividad antiproliferativa no se entiende bien. Aquí se investigó si los efectos antiproliferativos de tratamiento FLX juegan un papel en la quimioprevención de la displasia en el tejido de colon y lo que los mecanismos implicados son. Para este fin, se utilizó una línea celular de cáncer de colon humano (HT29) de
in vitro
experimentos in y un
in vivo
modelo de estudio de las lesiones preneoplásicas inducidos por carcinógenos. La
in vivo
modelo consistió en C57BL /6 ratones expuestos a tratamiento intra-rectal con el mutágeno alquilante y carcinógeno N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG). MNNG se ha informado de inducir FCA [22] de grado superior a 1,2 dimetilhidrazina (DMH), el agente carcinógeno utilizado previamente en modelos de cáncer de colon por nuestro grupo [5], [17], [23].
Nuestros resultados muestran que los efectos antiproliferativos de FLX-tratamiento no fueron inducidos por el aumento de la apoptosis o la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) o daños en el ADN. En lugar FLX reduce el número de FCA, muy probablemente mediante el control de la actividad de células estromales relacionadas con el desarrollo de microvasos
expresión relativa de proteína p27 en las células HT29 tal como se determina por análisis de transferencia Western (P & gt;. 0.05
vs
DMSO). Se muestra una mancha de la muestra y el resultado promedio de 4 experimentos independientes.
Materiales y Métodos
Reactivos
La fluoxetina, tempol, peróxido de hidrógeno (H
2O
2), sulfóxido de dimetilo (DMSO), bisbenzimide, DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol), y MNNG se adquirieron de Sigma-Aldrich (Louis, MO, EE.UU.). DMEM (4,5 g /l de glucosa) medio se adquirieron de PAA Laboratories GmbH (Austria). Dihydroethidium (DHE) fue adquirido de Merck Millipore (Alemania). Diclorofluoresceno (DCFH-DA) y Anexina V kit de detección de apoptosis (FITC), y el kit Cytofix /Cytoperm se adquirieron de Becton Dickinson (Alemania).
Cell Cultura y
La célula de cáncer de colon humano HT29 línea se obtuvo de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.) y se cultivaron bajo condiciones estándar y se cultivaron en DMEM (4,5 g /l de glucosa) medio. Se complementa con 10% de FBS, 1% de L-glutamina, penicilina (100 unidades /ml) y 0,1 mg /ml de estreptomicina. Las células se sembraron en placas de 6 pocillos (Sarstedt Inc., USA), a una concentración inicial de 5 x 10
5 células /pocillo, y se deja sin tratamiento durante 20-24 horas. Luego, las células se expusieron a 1, 10 o 100 FLX mu M durante 30 minutos, 4 o 24 horas. H
2O
2 (100 o 200 mM) sirvió como control para efectos oxidativos y daños en el ADN. Las células fueron expuestas a H
2O
2 durante 30 minutos.
citometría de flujo para el estrés oxidativo, la viabilidad y la apoptosis y el ciclo de análisis de la
Análisis de especies reactivas del oxígeno ( ROS) de producción se llevó a cabo de acuerdo con nuestro método estándar por citometría de flujo y de excitación láser de argón [24]. Brevemente, las células se marcaron durante 10 minutos con DCFH-DA y, a continuación analizados con un filtro de paso de banda de FL1 (Becton Dickinson [BD] LSR I ™, Alemania). El superóxido se detectó después de tinción de las células durante 30 minutos con DHE (10 mM) en medio sin suero. Después de la cosecha, las células se analizaron con un filtro de paso de banda FL2 [25]. Un ensayo de viabilidad y apoptosis se realizó mediante un kit de anexina V /yoduro de propidio (PI) y se analizó con filtros de paso de banda FL1 y FL2, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para el análisis del ciclo celular, HT29 células se incubaron con FLX (1 M y 10 M) o el disolvente DMSO (1%). Posteriormente, las células se permeabilizaron (Cytofix /Cytoperm kit) y se tiñeron con bisbenzimide para 30 min. Los experimentos se analizaron con luz ultravioleta (UV) de excitación de láser y un filtro de paso de banda FL5. Se analizaron 20.000 células por muestra y se evaluaron con el software BD CellQuest Pro ™. fases del ciclo celular se analizaron mediante el software ModFit LT ™ (Verity Software House, EE.UU.). Al menos cuatro experimentos independientes se llevaron a cabo.
(A) Representante imagen histológica de una zona severamente displásicas (ratón expuestos al MNNG). El recuadro de imagen (ampliada de la región en caja) muestra las características displásicas graves característicos; por ejemplo, la pérdida parcial de la polaridad celular, las células caliciformes ninguno, la presencia de células de Paneth (flecha azul), y mitosis (flechas blancas). Fotos fueron tomadas a 200 aumentos, barras de escala representan 20 micras. Las imágenes de alta magnificación fueron tomadas en un aumento de 1000x. (B) imagen representativa de una displasia moderada (MNNG + FLX ratón tratado). El recuadro muestra una apertura comprimido cryptal luminal, núcleos alargados (flecha roja), una zona muy concurrida y pseudostrafied (seccionado línea de negro), pero con una polaridad celular en general, que aún se conserva, y un menor número de células caliciformes (flecha amarilla). Aumentos se han descrito anteriormente. (C) Cuantificación de lesiones displásicas. Índice de focos de criptas aberrantes (ACF-i) se muestra como el número de lesiones displásicas
por
m
2 (* P & lt; 0,05; MNNG sin FLX,
n
= 5; FLX + MNNG ,
n = página 4). (D) Índice de criptas aberrantes (AC-i) se muestra como el número de criptas individuales displásicas
por
m
2 (* P & lt; 0,05; MNNG sin FLX,
n
= 5; FLX + MNNG,
n = página 4). (E) la imagen representativa de un área displásicos (seccionado línea de negro), y su vascularización relativa propagación en el interior. El recuadro (ampliada de la región de caja) muestra dos microvasos hacia la región interior de la zona displásicos. La flecha amarilla apunta a una pared de microvasos y la flecha roja para los eritrocitos dentro de las paredes de microvasos. Fotos fueron tomadas en un aumento de 400x, y más detalles se han descrito anteriormente. (F) vascularización displásicos relativa, que se muestra como el número de microvasos
por
lesión (* P & lt; 0,05; MNNG sin FLX,
n
= 5; FLX + MNNG,
n = página 4).
() Las células proliferantes a detectados por tinción con el ratón anti-Ki67 anticuerpos (MNNG tratos). (1) Las flechas rojas indican las células positivas de color marrón oscuro que migran hacia arriba en la zona de proliferación epitelial. (2) Las células estromales positivos están representados por una flecha roja cerca de la parte inferior-cryptal. Se tomaron imágenes como se describe anteriormente. (B) Las células proliferantes (anticuerpos anti-Ki67; flechas rojas) en un ratón tratado con FLX + MNNG se muestran en la parte inferior cryptal. Se tomaron imágenes como se describe anteriormente. (C) Proliferación epitelial en las zonas que se muestran por medio del etiquetado con anti-anticuerpo Ki67 (*** P & lt; 0,001; MNNG sin FLX,
n
= 5; FLX + MNNG,
n = página 4 ). (D) Proliferación de PCCS áreas de etiquetado con anti-anticuerpo Ki67 (*** P & lt; 0,001; MNNG sin FLX,
n
= 5; FLX + MNNG,
n = página 4) . (E) La proliferación en zonas epiteliales que se muestran mediante marcaje con anticuerpos anti-PCNA (** p & lt; 0,01; MNNG sin FLX,
n
= 4; FLX + MNNG,
n = página 4) . (F) La proliferación en áreas PCCS se muestra mediante marcaje con el anticuerpo anti-PCNA (** p & lt; 0,01; MNNG sin FLX,
n
= 4; FLX + MNNG,
n = página 4) . (G) La expresión de c-Myc en el epitelio del tejido del colon (*** P & lt; 0,001; MNNG sin FLX,
n
= 3; FLX + MNNG,
n = página 4). (H) La expresión de c-Myc en áreas PCCS de tejido del colon (*** P & lt; 0,001; MNNG sin FLX,
n
= 3; FLX + MNNG,
n = página 4) .
Comet Assay
de acuerdo con nuestra descripción anterior [24], se realizó una versión alcalina del ensayo cometa. El análisis abarca 100 células seleccionadas al azar (50 por diapositiva duplicado) para cada muestra, que se analizaron con un microscopio de fluorescencia (Labophot 2, Nikon, Alemania) con un aumento de 200 veces utilizando Komet 5 software de análisis de imagen (BFI Optilas, Alemania) . El porcentaje de ADN en la cola (Tail DNA%) se utilizó para cuantificar la migración del ADN. Al menos cuatro experimentos independientes se llevaron a cabo.
Análisis Western Blot
Se realizó como se describe en la Guía Técnica NuPAGE (Invitrogen, EE.UU.). Brevemente, los extractos de proteínas se realizaron en NuPAGE 4-12% Bis-Tris Mini geles (Invitrogen), y se transfirieron a membranas con iBlot seco Blotting System (Invitrogen) .Las membranas se incubaron 4 ° C durante la noche con anti-p27 (D69C12, Cell la señalización, EE.UU.), y anti-GAPDH (9484, Abcam, UK) anticuerpos. Los anticuerpos secundarios (de cabra anti-conejo de cabra y anticuerpos IgG anti-ratón HRP) se incubaron 1 h a temperatura ambiente. Bandas de anticuerpos marcados se detectan mediante el uso SuperSignal West Pico Substrato quimioluminiscente (Thermo Scientific, EE.UU.). Las películas fueron escaneados e intensidad de las bandas cuantificadas con el software ImageJ. Los datos de los 4 experimentos independientes se muestran como proporciones entre los valores de las proteínas de control específicas y endógenos.
(A) Imágenes representativas de secciones de colon marcadas con anticuerpos anti-VEGF anti-CD133 y, y núcleos teñidos con DAPI. Las flechas blancas indican las células positivas de un solo manchada y doble teñidas en áreas PCCS en las secciones del colon de (A1 a A3) MNNG sin tratamiento FLX, y (A4 a A6) grupos de tratamiento MNNG + FLX. Se tomaron fotos con FITC (495-521 nm), ultravioleta (358-461 nm), y Texas Red (595-605 nm) filtros. Todas las imágenes fueron tomadas a 600x aumentos, barras de escala representan 20 micras. (B) Imágenes representativas de secciones de colon manchados individuales con anticuerpo anti-VEGF (células positivas se ven con citoplasma de color marrón oscuro) de MNNG (B1) sin tratamiento FLX, y (B2) grupos de tratamiento MNNG + FLX. (B3) El número relativo de células que expresan VEGF dentro de las áreas PCCS (*** p & lt; 0,001; MNNG sin FLX,
n
= 3; FLX + MNNG,
n = página 4). Todas las imágenes fueron tomadas a 400 aumentos, barras de escala representan 50 micras. (C) Imágenes representativas de secciones de colon marcadas con anticuerpos anti-CD34 anti-CD133 y, y núcleos teñidos con DAPI. Las flechas blancas indican las células positivas de un solo manchada y doble teñidas en áreas PCCS en las secciones del colon de (C1 a C3) MNNG sin tratamiento FLX, y (C4 a C6) grupos de tratamiento MNNG + FLX. Se tomaron imágenes como se describe anteriormente. (D) Imágenes representativas de secciones de colon manchados individuales con anticuerpo anti-CD34 (células positivas se ven con citoplasma de color marrón oscuro) de MNNG (D1) sin tratamiento FLX, y grupos de tratamiento (D2) MNNG + FLX. (D3) El número relativo de células CD34 positivas en áreas PCCS (*** p & lt; 0,001; MNNG sin FLX,
n
= 4; FLX + MNNG,
n = página 4). Todas las imágenes fueron tomadas como se ha descrito anteriormente.
Ratones y protocolo de tratamiento
Mujer ratones C57BL /6 (5 semanas) fueron suministrados por la Facultad de Medicina de Ribeirao Preto de la Universidad de Sao Paulo , Brasil. Todos los
in vivo
tratamientos estaban de acuerdo con el protocolo aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales (n ° 068/2012) de la Escuela de Medicina de la Universidad de Sao Paulo, y la guía para el manejo de los animales, como mínimo, número aceptable. Los ratones se aclimataron durante 1 semana antes de comenzar el experimento. ratones C57BL /6 fueron expuestos o no al agente carcinógeno MNNG y asignados aleatoriamente a uno de cuatro grupos, como control (CTRL) o MNNG-tratamiento (cuatro dosis sucesivas de MNNG [5 mg /ml; depósitos intrarrectal de 100 l; Sigma Aldrich, Louis, MO, EE.UU.] dos veces a la semana durante 2 semanas), y FLX-tratamiento (30 mg /kg /día; intraperitoneal, IP; Sigma-Aldrich, Louis, MO, EE.UU.) o MNNG + FLX-tratamiento. Cada grupo tenía cinco ratones, y se alojaron
por
jaula de plástico a 22 ± 2 ° C con 55% de humedad y 12 h de luz /oscuridad ciclo. FLX-aplicación se inició después de 2 semanas a partir del final de MNNG tratos, y continuó durante las siguientes 4 semanas. Todos los animales tuvieron libre acceso a comida y agua durante el experimento. Todos los ratones fueron sacrificados por CO
2 la exposición en la semana 8 del experimento. Se realizaron autopsias individuales, y muestras de tejido de colon se abrieron longitudinalmente y se fijaron plana en 4% de paraformaldehído neutral-buffer (24 h). Los ratones con secciones de tejido fragmentadas fueron descartados del análisis.
(A) Imágenes representativas de secciones de colon marcadas con anticuerpos anti-CD31 anti-CD133 y, y los núcleos teñidos con DAPI. Las flechas blancas indican las células positivas de un solo manchada y doble teñidas en áreas PCCS en las secciones del colon de (A1 a A3) MNNG sin tratamiento FLX, y (A4 a A6) grupos de tratamiento MNNG + FLX. (A3 y A6) células positivas doble teñidas se muestran mediante flechas blancas en las estructuras microvasculares similar cercanos fondos cryptal. Se tomaron fotos con FITC (495-521 nm), ultravioleta (358-461 nm), y Texas Red (595-605 nm) filtros. Todas las imágenes fueron tomadas a 600x aumentos, barras de escala representan 20 micras. (B) Imágenes representativas de secciones de colon manchados individuales con anticuerpo anti-CD31 (células positivas se ven con citoplasma de color marrón oscuro) de MNNG (B1) sin tratamiento FLX, y (B2) grupos de tratamiento MNNG + FLX. Fotos fueron tomadas en un aumento de 400x, barras de escala representan 50 micras. (B3) Número relativo de CD31 positivas agrupaciones de células detecta
por PCCS con Z. (** p & lt; 0,01; MNNG sin FLX,
n
= 4; FLX + MNNG,
n = página 4)
Análisis histopatológico
muestras de tejido de colon se seccionaron y se tiñeron con H & amp;. e y analizaron mediante microscopía de luz. Una visión general del tejido se realizó a 200 aumentos en las muestras de colon, donde fueron detectados y contados [26] focos de criptas aberrantes displásicos (ACF) con rasgos patológicos que van desde leve a displasia grave. Después, un segundo análisis se llevó a cabo un aumento de 400x en cada lesión detectada para la confirmación de las características displásicas y contando el número de criptas aberrantes (AC) y microvasos (MV). Toda el área de cada sección analizada se determinó con una lente graduada (100x
;
Nikon, Japón), y su área (mm
2) se calculó como
valores (V) x 0,9801 /121
. Los valores relativos de ACF-i (índice) y AC-i se calcula como el número total de
por
mm
2 [5], [17]. La displasia relacionados con la vascularización-se determinó que era
ACF x MV /AC Hotel.
La inmunohistoquímica (IHC) e inmunofluorescencia (FMI)
Según la descripción anterior [5], [27], y la tinción IHC FMI se realizaron en secciones de parafina de colon (4 m). Los anticuerpos primarios fueron adquiridos de Novocastra (EE.UU.), Santa Cruz de Biotecnología (Alemania), y Biocare Médico (EE.UU.). Las secciones se incubaron con anti-Ki67 (clon MMA en 1:100), anti-PCNA (clon PC 10 en 1:100), anti-c-
Myc
(9E11 clon en 1:100), anti -VEGF (clon a-20 en 1:100), anti-CD34 (clon QBEND /10 en 1:100), anti-CD31 (clon 1A10 en 1:100), y anti-CD133 (clon N /a en 1 :100) anticuerpos primarios durante la noche. El color marrón se visualiza mediante la incubación de las secciones con Picture-MAX Polímero Kit (Invitrogen, EE.UU.). Se mostró en las reacciones positivas de un precipitado de color marrón en el núcleo para Ki67, y PCNA, y en el citoplasma y /o el área perinuclei para
c-Myc
, VEGF, CD133, CD34, y CD31.
proliferación en las secciones del colon se analizaron con anticuerpos anti-PCNA en epitelial y áreas PCCS anti-Ki-67 y. Marcadores asociados con la vascularización (VEGF, CD133, CD34, y CD31) se contaron en áreas PCCS. Sin embargo, CD31 (o PECAM-1; endotelial de plaquetas molécula de adhesión-1) se contó como grupos de células positivas (más de 3 células positivas), ya que CD31 se expresa principalmente en la superficie de las células endoteliales [28]. Ratios de contar se determinaron entre núcleos teñidos positivamente y los núcleos no teñidas totales en el epitelio, mientras que las proporciones de las zonas PCCS se calcularon entre las células positivas (o conglomerados CD31) y el número total de áreas contados. Para las células positivas
por
grupo de CD31, la relación se calculó entre el número de células marcadas y el número total de racimos.
Haga doble etiquetado se realizó en muestras de colon fijas marcadas con anti-ratón CD133 humana- (1:100; Miltenyl Biotec, 715-090-422; anticuerpo secundario conjugado anti-ratón FITC, 1:400, Dianova, 715-095-150), de conejo anti-ratón de VEGF (1:100, Santa Cruz , sc-152; anti-rabitt Cy3 anticuerpo secundario conjugado, 1:400, Dianova, 111-165-144), rata anti-ratón CD34 (1:100, Applied Biosystems, ab 8158; anticuerpo secundario anti-rata conjugado con rojo Texas , 1:400, GeneTex, GTX 26732), y de conejo anti-ratón CD31 (1:100, Applied Biosystems, ab 28365; anti-rabitt Cy3 anticuerpo secundario conjugado, 1:400, Dianova, 111-165-144) anticuerpos. Los núcleos se tiñeron con DAPI. Las imágenes fueron adquiridas con una microscopía Olympus BX51 equipado con una cámara Olympus DP71 y un software cellSens Dimensión (Olympus, Alemania).
Análisis estadístico
Los datos fueron analizados con el programa estadístico GraphPad Prism 5.0 ( Graph Pad Software Inc., San Diego, California, EE.UU.). Bidireccional se aplicó la prueba de ANOVA (prueba post hoc de Bonferroni) para analizar los datos de los ensayos de anexina V /PI y del ciclo celular, y
in vivo
experimentos, ya que permite diferentes criterios de valoración que deben analizarse por separado. el estrés oxidativo y el daño en el ADN fueron analizados por ANOVA de una vía de ensayo (prueba post hoc de Bonferroni). lesiones preneoplásicas (ACF-i, AC-i, y la displasia relacionados con la vascularización-) se analizaron mediante la prueba de Mann-Whitney. Una probabilidad de P & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa. Todos los valores representan las medias ± desviaciones estándar.
Resultados
Efectos FLX en la producción de ROS, daño del ADN, la viabilidad celular, la apoptosis y del ciclo celular
Para entender si y cómo concentraciones terapéuticas y sobre-terapéuticas de FLX podrían desempeñar un papel en contra de la proliferación celular del cáncer de colon, se analizaron las células HT29 de cáncer de colon humano para la producción de ROS, el daño del ADN, la viabilidad, apoptosis, y la distribución de las fases del ciclo celular en el cultivo. Se encontró que la producción de ROS se aumentó 2,5 veces en las células HT29 por 100 FLX mu M después de 30 min de tratamiento, pero no se observó ningún aumento significativo con 1 y 10 mM FLX (Figura 1A). Otros experimentos demostraron que ROS fueron aproximadamente 2 veces menos en células HT29 expuestas a 100 mM FLX después de 4 h de después del tratamiento de 30 minutos (Figura 1B). Con el colorante específico más superóxido DHE se observó un patrón similar (Figura 1C y 1D). Un aumento de 2,8 veces con 100 mM FLX (Figura 1C), pero no un incremento de 1 mM y 10 mM FLX se encontró después de 30 min y se observó una mejora de 2 veces después de 4 h (Figura 1D), de nuevo solamente con 100 mM FLX. Por lo tanto, el aumento con 100 mM FLX era 1,4 veces menor después del tratamiento 4 h después de 30 min. Ninguna de las concentraciones FLX induce daño del ADN significativa en células HT29 después de 30 min o 4 experimentos h (Figura 1E y F).
Después de 24 h, 100 M FLX disminución de la viabilidad celular de manera significativa y la apoptosis inducida, aunque 1 y 10 M no fueron capaces de obtener efectos similares (Figura 1G). Por otro lado, 10 mM FLX provocó un retraso significativo de células en el G
0 G
1 /fase del ciclo celular durante un tratamiento de 24 h (Figura 1G). Cuando se investigó la relacionada con la progresión de la proteína p27 del ciclo celular, 10 mM FLX causó un ligero upregulation y se encontró un incremento de 1,3 veces después del tratamiento 24 h con 20 mM FLX (Fig. 2). Tomados en conjunto, un G
0 /G
1 retraso del ciclo celular se produjo a una concentración terapéutica FLX, que no fue causada por la producción o la inducción de daño en el ADN ROS.
Potencial de FLX contra la las lesiones preneoplásicas formación de
a partir de los resultados mostrados anteriormente, se verificó una actividad quimiopreventivo contra las lesiones preneoplásicas en el tejido del colon para el tratamiento FLX en ratones expuestos a carcinógenos. Los ratones fueron expuestos primero a MNNG, tratados con FLX durante 28 días, y lesiones preneoplásicas se enumeraron por análisis histopatológico. Se observó displasia severa inducida por MNNG (Figura 3A) en las secciones del colon, que no se observó a un grado tal en muestras de animales tratados con FLX (Figura 3B). La cuantificación de las lesiones displásicas (ACF) en MNNG y los ratones tratados con FLX MNNG + mostró que FLX reduce displasia 5,39 veces (Figura 3C). FLX tratamiento redujo significativamente los valores totales de CA
por
mm
2 7,94 veces (Figura 3D). Microvasos se extienden por todo PCCS hacia las zonas displásicas (Figura 3E), y encontramos que el tratamiento disminuye la FLX relacionados con la vascularización-displasia de 3.13 veces (Figura 3F). Nuestros datos sugieren que FLX actúa en diferentes áreas del colon, es decir, el epitelio y el estroma.
Actividad de FLX sobre la proliferación en el epitelio y PCCS Áreas
Ya que indentified efectos quimiopreventivos bajo FLX-tratamiento en el tejido del colon , se planteó la cuestión de si estos hallazgos se relacionan con actividades antiproliferativas en dos áreas diferentes, a saber colon epitelios y áreas PCCS (Figura 4A.1 y 2). secciones marcadas con anticuerpo anti-Ki67 revelaron que FLX atenuada (Figura 4B) el aumento inducido por MNNG en la proliferación, al epitelial y áreas PCCS (Figura 4C y D). PCNA tinción también mostró que FLX atenúa la actividad proliferativa inducida por MNNG en ambas áreas del colon (Figura 4E y F). Por otra parte, un alto
c-Myc
se encontró expresión en ambas áreas del colon en animales tratados con MNNG, en el que FLX-tratamiento impidió el aumento de expresión (Figura 4 G y H). Por lo tanto, nuestros resultados apoyan la hipótesis de que la inhibición de la proliferación juega un papel importante en los efectos quimiopreventivos del tratamiento con FLX.
Actividad de FLX sobre la angiogénesis
Teniendo en cuenta que la angiogénesis tiene lugar dentro de PCCS, y la proliferación así como marcadores de células madre podría estar relacionado con que [15] - [16], [29] - [30], se investigó la posible relación entre estos hechos objeto de tratamiento FLX. Se encontraron células CD133 positivas expresan VEGF dentro PCCS en ratones sometidos ya sea para MNNG o tratamientos MNNG + FLX (Figura 4A). FLX tratamiento disminuyó su número relativo en el grupo carcinógeno expuestos en comparación con el grupo sin MNNG FLX (MNNG, 3,73 ± 0,44 [
n
= 4]
vs
MNNG + FLX, 1,97 ± 0,14 [
n
= 4]; p & lt; 0,001). Las células estromales expresan VEGF eran también disminuyeron en los animales expuestos-MNNG tratados con expresión FLX (Figura 5B). Curiosamente, sólo se encontraron células positivas CD133 que expresan CD34 glicoproteína entre los ratones tratados con MNNG (Figura 5C) mientras que el tratamiento FLX disminuyó significativamente el número de células CD34-positivas del estroma (Figura 5D). Además, el número total de células CD31 relativa-positivos se enumeró dentro de las áreas PCCS, y una disminución significativa se encontró en el grupo expuesto-MNNG bajo tratamiento FLX (MNNG, 3,5 ± 0,87 [
n
= 4]
vs
MNNG + FLX, 1,8 ± 0,2 [
n
= 4]; P & lt; 0,01). Una comparación entre CD34 y las células CD31-positivas mostró un aumento de 1,2 veces en los valores de celda CD31-positivo entre los ratones expuestos al MNNG.
Desde CD31 es un marcador relacionados con la angiogénesis [31] y se ha mejorado en virtud de MNNG- tratamiento, de doble tinción se realizó para comprender si las células CD133 positivas estaban expresando la glicoproteína CD31. En los grupos MNNG y MNNG + FLX, las células CD133 positivas expresan CD31 en las estructuras microvasculares y especies afines en áreas PCCS (Figura 6B). Se detectaron los sitios potenciales de microvasos en desarrollo enumeración de los grupos de células CD31-positivas dentro de PCCS (figura 6b.1 y B.2). grupos de células CD31-positivas se redujeron de manera significativa en FLX-tratamiento en ratones expuestos al MNNG (Figura 6B.3). Por lo tanto, estos datos conducen a la hipótesis de que una reducción de la formación de microvasos podría estar ocurriendo debido al control de FLX en el proceso de diferenciación de células del estroma.
Discusión
concentraciones terapéuticas de gama FLX de 10 a 30 M en el cerebro humano [32]. Esta concentración (10 mM) retrasa la progresión del ciclo celular, independientemente de la producción de ROS y el daño de ADN en células de cáncer de colon humano
in vitro
. Hallazgos similares de FLX bloquean la progresión del ciclo celular detención de las células en los tumores de mama G
O /T
1 fase se ha informado anteriormente [33]. Estos autores encontraron entre otras evidencias una acumulación de p27 y desarrollaron una hipótesis basada en el modelado que FLX puede interrumpir la asamblea de la quinasa dependiente de ciclina subunidad 1 (CKS1) con skp2 ubiquitina ligasa, ubiquitinación y la prevención de la degradación proteasomal de p27. También se detectó una regulación al alza de p27, que es consistente con la hipótesis de Krishnan et al. [33]. En otro informe utilizando células HT29, FLX ha demostrado inhibir ERK1 /2 fosforilación por hypophosphorylating
c-Myc
y CREB proteínas, lo que resultó en la regulación a la baja de la ciclina D1 y A, mientras que los genes con puesto de control del ciclo celular se upregulated , la reducción de la proliferación celular [20].
en cuanto a nuestras
in vitro
resultados en la actividad y quimiopreventivo de FLX contra la displasia inducida por MNNG mediante la reducción de la proliferación epitelial, parece posible que FLX promueve estos efectos mediante el control de la progresión del ciclo celular
in vivo
. Se sabe que las células mutadas bajo exposición MNNG pueden adquirir una mayor capacidad de proliferación celular a través de cambios en el oncogén y expresiones miARN [34]. Por otra parte, un retraso en la G
fase 2 /M del ciclo celular se informó en células de cáncer de colon expuestos a MNNG [35]. Además, la actividad cancerígena de MNNG se ha relacionado con la proliferación celular alta en el epitelio del colon [22], [36] - [37], mientras que un quimioprevención contra los efectos displásicas inducidas estaba relacionada con una disminución en la proliferación y la expresión de oncogenes, tales como
c-Myc
[36], [38]. Por lo tanto, MNNG altera la progresión del ciclo celular a través de la inducción de mutaciones que conducen a un aumento de la capacidad proliferativa. FLX fue encontrado para reducir la proliferación cryptal influyendo en la actividad serotoninérgica [5] y para inducir la expresión de los supresores de tumores p53, a saber, p27, p21 y [20], [33].
Desde alta proliferación juega un papel importante