Extracto
Hasta reguladas SIRT1 (SIRT1), un NAD
+ dependiente de la clase III de la histona deacetilasa, deacetylates p53 e inhibe su actividad transcripcional, lo que lleva a la supervivencia celular. la sobreexpresión de SIRT1 se ha informado para predecir la supervivencia pobre en algunos tumores malignos, incluyendo el cáncer gástrico. Sin embargo, el efecto antitumoral de la inhibición de SIRT1 sigue siendo difícil de alcanzar en el cáncer gástrico. Aquí, hemos investigado los mecanismos antitumorales de un inhibidor de las sirtuinas, tenovin-6, en siete líneas celulares de cáncer gástrico humano (cuatro líneas celulares de tipo salvaje
TP53
, dos con los de tipo mutante
TP53
, y uno con nula
TP53
). Curiosamente, tenovin-6 inducida por la apoptosis en líneas celulares de todos, no sólo los que tienen de tipo salvaje
TP53, España, sino también de tipo mutante y nulos versiones, acompañados por la sobre regulación de receptor de muerte 5 (DR5). En la línea celular KATOIII (
TP53
-null), DR5 silenciamiento marcadamente atenuada apoptosis inducida 6 tenovin-, lo que sugiere que el mecanismo fundamental detrás de sus efectos antitumorales se basa en la activación de la vía de señalización del receptor de muerte. Aunque el estrés de retículo endoplásmico causada por los inhibidores de sirtuinas se informó de inducir DR5 sobre regulación en otras líneas celulares de cáncer, pero no hemos encontrado marcada activación de sus moléculas relacionadas, como ATF6, gratificación, y CHOP, en células de cáncer gástrico tratados con tenovin- 6. Tenovin-6 en combinación con docetaxel o SN-38 ejerce una ligera a moderada citotoxicidad sinérgica contra células de cáncer gástrico. En conclusión, tenovin-6 tiene una potente actividad antitumoral contra las células de cáncer gástrico humano a través de DR5 regulación. Nuestros resultados deben ser útiles para el futuro desarrollo clínico de los inhibidores de sirtuinas
Visto:. Hirai S, S Endo, Saito R, M Hirose, Ueno T, Suzuki H, et al. (2014) antitumorales Efectos de un inhibidor, Sirtuinas Tenovin-6, contra células de cáncer gástrico a través de la muerte de los receptores 5-Hasta Reglamento. PLoS ONE 9 (7): e102831. doi: 10.1371 /journal.pone.0102831
Editor: Andrei L. Gartel, Universidad de Illinois en Chicago, Estados Unidos de América
Recibido: 28 Octubre, 2013; Aceptado: June 23, 2014; Publicado: 17 Julio 2014
Derechos de Autor © 2014 Hirai et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas-en-Ayudas del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón (IH). Sin financiación externa adicional fue recibida para este estudio. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico es una de las principales causas de muerte por cáncer en todo el mundo [1], [2]. Aunque se han desarrollado diversas quimioterapias para el cáncer gástrico avanzado, el pronóstico es aún se necesitan medicamentos contra el cáncer pobres y novedosas para el cáncer gástrico. El cáncer gástrico es un cáncer biológica y genéticamente heterogéneo que implica numerosas mutaciones genéticas y epigenéticas alternancias [3]. Entre ellas, las anormalidades de la
TP53
gen supresor de tumores juegan un papel importante en la tumorigénesis [4], [5]. Aproximadamente el 30% de los pacientes con cáncer gástrico tiene
TP53
mutación [6]. Incluso en las células de cáncer de tipo salvaje (wt)
TP53
, se ha informado de que la función de
TP53
es suprimida por la regulación negativa incluyendo ubiquitinación, la metilación, y la desacetilación [7], [8]. En este contexto, sería una estrategia prometedora para asumir que la inhibición de estos reguladores resultados negativos en potenciación de los efectos antitumorales a través de la activación de p53 en peso
TP53
cánceres. Murino doble minuto 2 (MDM2) es un antagonista fisiológico importante de p53 [7]. Hemos informado anteriormente de que un inhibidor de MDM2, nutlin-3, demuestra efectos antitumorales potentes contra las células de cáncer gástrico a través de la activación de la vía de p53 [9]
SIRT1 (SIRT1), un NAD
+ -. dependientes histona deacetilasa (HDAC), tiene una variedad de funciones implicadas en el silenciamiento de la cromatina, la longevidad y la estabilidad genómica. Se encuentra en el núcleo y actúa como un sensor de estado metabólico celular en la supervivencia y la senescencia bajo genotóxico y el estrés oxidativo [10], [11]. Además de la desacetilación de histonas, estas funciones dependen en parte de la desacetilación de varias proteínas no histonas, que incluyen factores de transcripción: p53, caja forkhead (FOXO) proteínas de la familia, el factor kappa B nuclear, c-myc, N-MYC, E2F1, y inducibles por hipoxia factores de transcripción (HIF) 1α /2α; enzimas relacionadas con la cromatina: histona acetiltransferasa, P300, dependiente de ADN quinasa subunidad Ku80 y TIP60; elementos de reparación del ADN: Ku70, RAD51, y NBS1; y factores de señalización celular: STAT3, β-catenina, y Smad7 [11] - [13]. SIRT1 interactúa fisiológicamente con p53 y atenúa sus funciones a través de la desacetilación en su extremo C-terminal de residuos Lys382 [12]. La sobreexpresión de SIRT1 se encuentra en muchos tipos de cáncer, tales como el estómago y el colon [10], [14], e informó de funcionar como un promotor de tumores. SIRT2 es uno de los citoplásmica NAD
+ - histona desacetilasas dependientes y deacetylates histona H3 lisina 56 (H3K56) y α-tubulina. También comparte sustratos no histonas de FoxO1, FOXO3 y p53 con SIRT1 [11]. Sin embargo, la función exacta de SIRT2 sigue siendo difícil de alcanzar en la biología del cáncer.
En este contexto, se investigó si tenovin-6, un compuesto de molécula pequeña que inhibe las funciones de SIRT1 y SIRT2 [15], [16], ejerce efectos antitumorales a través de la activación de la vía de p53 en células de cáncer gástrico. Recientemente, se ha informado de que los inhibidores de SIRT regulados hasta el receptor de muerte 5 (DR5), un miembro de la familia de receptores del factor de necrosis tumoral, en algunos tipos de cáncer [17], [18]. Estamos, además, estudiamos la participación de este receptor en la actividad antitumoral de tenovin-6 para el cáncer gástrico. Además, se analizó el sinergismo de tenovin-6 con fármacos citotóxicos convencionales para el futuro desarrollo clínico en el cáncer gástrico.
Materiales y Métodos
Las líneas celulares
Siete celular de cáncer gástrico se utilizaron líneas: cuatro líneas celulares con peso
TP53 gratis (MKN-45, NUGC-4, STKM-2, SNU-1), dos líneas celulares con tipo mutante (MT)
TP53
(NUGC-3, STKM-1), y una línea celular con nula
TP53 gratis (KATOIII) [19] - [21]. Las líneas celulares con peso
TP53
(MCF-7 de cáncer de mama, células de riñón embrionarias humanas HEK293) y MRC-5 fibroblastos humanos normales se incluyeron como controles en este estudio. MKN-45, NUGC-4, KATOIII, y MRC-5 líneas celulares se obtuvieron de RIKEN BRC Cell Bank (Tsukuba, Japón). líneas SNU-1 y de células MCF-7 fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (Rockville, MD). líneas celulares NUGC-3 y HEK293 se obtuvieron de Ciencias de la Salud de Investigación de Recursos del Banco (Osaka, Japón). STKM-2 líneas celulares STKM-1 y fueron amablemente proporcionados por el Dr. Shunsuke Yanoma (Yokohama City University, School of Medicine, Japón).
Productos químicos
Tenovin-6 se adquirió de Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI). Docetaxel, SN-38, cisplatino, 5-fluorouracilo (5-FU), doxorrubicina y thapsigargin se obtuvieron de Wako (Osaka, Japón). Ellos se disolvieron en sulfóxido de dimetilo (DMSO) a una concentración de 20 mM y alícuotas se almacenaron a -20 ° C. Las soluciones madre se diluyeron a las concentraciones finales deseadas con medio de crecimiento antes de su uso.
Los anticuerpos y el análisis de transferencia Western
electroforesis SDS-polyaclylamidegel y transferencia Western se realizaron como se describe anteriormente [22]. Los anticuerpos primarios y secundarios utilizados fueron los siguientes. anticuerpos policlonales de conejo contra SIRT1 (D739), acetilada (Ac) -p53 (Lys382), fosforilada (fosfo) -p53 (Ser15), Bcl-2, Ac-α-tubulina (Lys40), receptor de muerte 5 (DR5), Fas anticuerpos de dominio de muerte -asociado (FADD), poli escindido (ADP) polimerasa -ribose (PARP) (Asp214) y monoclonales de ratón contra p21
WAF /Cip1 gratis (DCS60), histona H3 (96C10) , β-actina (8H10D10), α-tubulina (DM1A) y la proteína C /EBP homólogo (CHOP) (L63F7), y monoclonales de conejo anticuerpos contra TRAIL (C92B9), caspasa-3 (8G10), la enzima que requiere inositol-(IRE ) 1α (14C10), y fosfo-ARN dependiente de la proteína quinasa retículo endoplásmico quinasa (PERK) (16F8) se obtuvieron de Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Ratón anticuerpo monoclonal para p53 (BP53-12) se adquirió de Cell Science (Canton, MA), anti-SIRT2 (4B11) anticuerpo monoclonal era de Sigma-Aldrich. (St. Louis, MO), y anti-factor activador de la transcripción 6 (ATF6) anticuerpo monoclonal (70B1413.1) era de Enzo Life Science (Farmingdale, NY). Anticuerpo de conejo policlonal para Ac-histona H3 (Lys18) era de Merck Millipore (Billerica, MA). Tanto peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado con IgG anti-ratón de oveja y anti-conejo de burro IgG sueros eran de GE Healthcare (Buckinghamshire, Reino Unido). La unión del anticuerpo se detectó usando un sistema ECL Western Blot Detección Primer (GE Healthcare), de acuerdo con el protocolo del fabricante. La intensidad de la señal se cuantificó usando Ez-II de captura sistema de imágenes de quimioluminiscencia (Atto, Tokio, Japón).
-PCR en tiempo real cuantitativa para el análisis de los
SIRT1
y
SIRT2
expresión
muestras de ARN de genes se extrajeron de lisado de células usando un kit de alta Pure Aislamiento de ARN (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de que el ADN genómico se eliminó por DNasa, cDNA se preparó usando un RNA a cDNA kit de alta capacidad (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA). PCR en tiempo real cuantitativa se realizó utilizando un Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Cebadores y la sonda TaqMan para
SIRT1
y
SIRT2
se obtuvieron de Applied Biosystems (ensayo ID: Hs01009005 y Hs00247263, respectivamente), y los de
18S ARN ribosomal (ARNr 18S)
diseñado y sintetizado por Sigma-Aldrich fueron como sigue: 5'-AACCCGTTGAACCCCATTCG (cebador directo), 5'-CGGGCGGTGTGTACAAAGG (cebador inverso), 5'-AACGCAAGCTTATGACCCGCACTTACTGG (sonda). Las reacciones se realizaron por triplicado en condiciones de ciclos térmicos estándar utilizando 30 ng de ADNc, cebadores 900 nM, 250 nM sondas, y una expresión génica TaqMan Master Mix (Applied Biosystems), de acuerdo con el protocolo del fabricante.
extrajeron los ARN de las células fueron analizadas por las cantidades relativas del gen diana (
SIRT1, SIRT2
) y el gen de referencia (
18S rRNA
) por cuantitativa en tiempo real PCR.
ensayos de WST-8 de viabilidad celular
WST-8 ensayos colorimétricos se realizaron con un Cell Counting Kit-8 (Dojin Laboratories, Kumamoto, Japón), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 5 × 10
3 células por pocillo con 100 l de medio de cultivo durante 24 h, se trató con tenovin-6 durante 72 h, se incubaron en presencia de WST-8, y después se analizaron con un lector de microplacas Imark (Bio-Rad, Hercules, CA).
Análisis de la apoptosis por citometría de flujo
Las células fueron sembradas en placas de 60 mm a una densidad de 5 x 10
5 por plato. Después de la incubación con tenovin-6 (10 mM) o una cantidad equivalente de DMSO durante 72 h, las células se levantaron suavemente con Accutase (US Biotecnologías, Parker Ford, PA) a temperatura ambiente durante 10 min. Después, las células se lavaron una vez con solución salina tamponada con fosfato. Las células apoptóticas se detectaron mediante doble tinción con yoduro de propidio (PI) e isotiocianato de fluoresceína (FITC) marcado con anexina V utilizando un kit de Anexina V-FITC Apoptosis Detección (Beckman Coulter, Brea, CA), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Seguidamente se realizó un análisis de citometría de flujo con un flujo FACS Calibur citómetro (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) y el software CELLQuest (BD Biosciences).
siRNA dirigidos a
DR5
siRNA dirigidos DR5 fue diseñado utilizando el software siDirect (http://sidirect2.rnai.jp/), como se informó anteriormente [22]. siRNA transfección se realizó utilizando Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Control de siRNA fue una secuencia artificial diseñado para tener la menor homología con genes humanos y de ratón. Las hebras sentido y antisentido de siRNA usadas en este estudio fueron los siguientes: DR5, 5'-CCGUUUGUGCGUACUUUGAGA-3 '(sentido), 5' UCAAAGUACGCACAAACGGAA-3 '(antisentido); Control de siRNA, 5'-CCGUACUAGCCAUUAUGCGUC-3 '(sentido), 5'-CGCAUAAUGGCUAGUACGGGU-3' (antisentido).
Para el análisis de los efectos de siRNA en el crecimiento celular y la viabilidad, las células se sembraron a una baja densidad (1 × 10
3 células por pocillo) en placas de 96 pocillos que contienen 100 l de medio RPMI 1640 con 10% de suero de ternera fetal (Sigma-Aldrich). La viabilidad de las células transfectadas se evaluó 72 y 120 h después de la transfección por WST-8 ensayo.
índice de combinación
Para determinar si tenovin-6 puede potenciar los efectos antitumorales de agentes quimioterapéuticos convencionales, nos utilizado un índice de combinación (CI) y un isobolograma calculado utilizando software Calcusyn (Cambridge, Reino Unido), de acuerdo con el principio de efecto mediano Chou y Talalay [23]. En este análisis, CI & gt; 1,3 indica antagonismo; CI = 1,1-1,3 antagonismo moderado; CI = 0,9-1,1 efecto aditivo; CI = 0,8-0,9 ligera sinergia; CI = 0,6-0,8 sinergia moderada; CI = 0,4 a 0,6 sinergismo; y CI = 0,2-0,4 fuerte sinergismo.
El análisis estadístico
Todos los experimentos se realizaron por triplicado y se repitieron al menos tres veces. Todos los datos se expresan como media ± desviación estándar (SD). La significación de las diferencias se determinó mediante la prueba t de Student y la prueba de Dunnett.
p-valores
& lt; 0,05 se consideró significativo
Resultados
La expresión de SIRT1, SIRT2, y acetilada (Ac) -p53 en líneas celulares de cáncer gástrico
.
en primer lugar, se examinaron los niveles de expresión de SIRT1, SIRT2, y Ac-p53 en siete líneas celulares de cáncer gástrico. Utilizamos células HEK293 para el control positivo de SIRT1 /2, y MCF-7 células tratadas con doxorubicina para el control positivo de Ac-p53 [24]. Todas las líneas celulares de cáncer gástrico, excepto para las células STKM-1 NUGC-4 y expresaron altos niveles de proteína SIRT1, y los niveles de expresión fueron bajos SIRT2 en todas las líneas celulares excepto MKN-45 células (Figura 1A). los niveles de expresión Ac-p53 eran muy bajos en todas las líneas celulares de cáncer gástrico con peso
TP53
A:. La expresión de SIRT1, SIRT2, p53, p53-Ac, y fosfo-53 en siete líneas celulares de cáncer gástrico y fibroblastos MRC-5 se examinó por transferencia de Western. Semi-cuantificación de la densitometría Blot normalización involucrados occidental de ß-actina niveles. MCF-7 *: las células MCF-7 tratadas con doxorubicina (1 M, 24 h). B: Expresión de
SIRT1
ARNm y
SIRT2
mRNA en células de cáncer gástrico. Los niveles de
SIRT1
ARNm y
SIRT2
ARNm se determinaron en células de cáncer gástrico y fibroblastos MRC-5 por cuantitativa en tiempo real PCR y normalizado al nivel de
18S rRNA
. los niveles de mRNA se muestran en relación con los de fibroblastos MRC-5.
Se analizó la expresión de genes de
SIRT1
y
SIRT2 fotos: por PCR en tiempo real cuantitativa. MKN 45 células exhibieron
SIRT1
expresión génica que era aproximadamente 2,5 veces mayor que en los fibroblastos, pero otras líneas celulares de cáncer gástrico no lo hicieron (Figura 1B). En NUGC-4 células, el nivel de expresión del gen de
SIRT1
fue baja, al igual que la proteína SIRT1. MKN-45 células mostraron ligeramente más alta
SIRT2
la expresión génica, mientras que otras líneas celulares mostraron bastante bajos niveles de expresión.
Tenovin-6 inhibe el crecimiento de células de cáncer gástrico
para confirmar la actividad tenovin-6, se estudió si tenovin-6 afectó a la acetilación de las histonas H3 y α-tubulina. Tenovin-6 aumentó la acetilación de la histona en tres (MKN-45, NUGC-4, y KATOIII) de las cuatro líneas celulares de cáncer gástrico probados, lo que indica la inhibición de la actividad de desacetilación SIRT1 (Figura 2A). Ac-α-tubulina se incrementó sólo en una línea celular (MKN-45) tratados con tenovin-6, por lo tanto, la inhibición de la actividad de desacetilación SIRT2 no pudo ser definitivamente muestra en células de cáncer gástrico
A:. Gástrico células cancerosas eran cultivadas con tenovin-6 (10 mM) durante diversos periodos de tiempo y se analizaron para los niveles de SIRT1, SIRT2, Ac-H3, y Ac-α-tubulina por Western Blot. B: Tenovin-6 inhibió el crecimiento de células de cáncer gástrico, independientemente de
TP53
de estado. Todos los experimentos se evaluaron mediante WST-8 de ensayo y se llevaron a cabo por triplicado. Los resultados se expresan como la media ± desviación estándar. C: WST-8 ensayo se realizó en células MRC-5 para comparar la toxicidad de tenovin-6 a las líneas celulares de cáncer. La inhibición del crecimiento de tenovin-6 en NUGC-4 células fue significativamente mayor que en células MRC-5. La significación de las diferencias se evaluó mediante la prueba t de Student.
A continuación, se evaluó el potencial efecto antitumoral de tenovin-6 en contra células de cáncer gástrico. Cada línea celular de cáncer gástrico se cultivó en presencia de tenovin-6 (0,2, 1, 5, 10, 20, y 50 mu M) durante tres días. Se observó una inhibición del crecimiento dependiente de la dosis en todas las líneas celulares, no sólo aquellos con peso
TP53
sino también MT y versiones nulos (Figura 2B). Sus IC
50 valores oscilaron entre 2.34 a la 4.28 M. Además, WST-8 ensayo se realizó en la línea celular de fibroblastos humanos MRC-5 (IC
50: 6.09 M) para comparar la toxicidad de tenovin-6 a las líneas celulares de cáncer gástrico. La viabilidad de NUGC-4 células tratadas con tenovin-6 fue significativamente menor que la de células MRC-5, como se muestra en la Figura 2C.
Tenovin-6 inducida por la muerte celular por apoptosis en células de cáncer gástrico
Como se muestra en la Figura 3A y S1, el tratamiento tenovin-6 aumentó la expresión de p53 y p21 en peso
TP53
células (MKN45 y NUGC-4). Sobre regulación de Ac-p53 se muestra en la MKN-45 células, pero no en NUGC-4 células. El aumento de expresión de p21 también se observó en tm
TP53
células (NUGC-3). Por el contrario, bcl-2 expresión no cambió en casi todas las cuatro líneas celulares de cáncer gástrico. Se observaron aumentos de DR5 y la expresión de PARP escindida en todas las líneas celulares ensayadas. Los niveles de expresión de TRAIL, que funcionan como un ligando en la señalización de la muerte de acoplamiento, se aumentó ligeramente en todas las líneas celulares, aunque la expresión de FADD, un adaptador importante, no se vio afectada por tenovin-6.
A : análisis el curso temporal de la expresión de p53, p21 aguas abajo de su molécula de
WAF /Cip1
y moléculas relacionadas con la apoptosis en células de cáncer gástrico tratados con tenovin-6 (10 mM). La intensidad relativa de la expresión de las proteínas se muestra en la Figura S1. Tenovin-6 induce la expresión de Ac-p53 y p21
WAF /Cip1
, pero no Bcl-2. DR5 expresión fue fuertemente inducidos por tenovin-6. TRAIL, y PARP escindida se incrementaron ligeramente, pero la expresión de FADD no se vio afectada. Un doblete de DR5 muestra su precursor (banda superior) y las isoformas maduros (banda inferior). B: Cuatro líneas de células fueron tratados con tenovin-6 (10 mM) o un vehículo de control durante 72 h, doble teñidas con FITC-anexina V y PI, y se analizaron por citometría de flujo. La significación estadística de las diferencias entre grupos se evaluó mediante la prueba t de Student. *
p Hotel & lt; 0,01; **
p
. & Lt; 0,05
Hemos examinado si tenovin-6 disminuyó la viabilidad de las células de cáncer gástrico a través de la inducción de la muerte celular por apoptosis. Las células cancerosas se expusieron a la misma a una concentración de 10 mM o una cantidad equivalente de vehículo de control (DMSO) durante 72 h, y luego se tiñeron con FITC-anexina V y PI. Se analizaron por citometría de flujo: las células negativas tanto para anexina V y PI se consideran no-apoptóticos, se consideraron células positivas para anexina V solamente se consideraron apoptótica temprana, y las células positivas tanto para anexina V y PI a llegar tarde de apoptosis o necrosis. La exposición de las células MKN-45 a tenovin-6 aumentó las fracciones de las fases tempranas y tardías de la apoptosis de 2,8% a 52,1% y del 1,8% al 18,5%, respectivamente (Figura 3B). Se observaron aumentos similares en las poblaciones en fases tempranas y tardías de la apoptosis en otras líneas celulares (NUGC-4, NUGC-3, y KATOIII). Tenovin-6 induce la apoptosis en todas las líneas celulares ensayadas, independientemente de
TP53
de estado.
Efecto de
DR5
caída en la apoptosis inducida por tenovin-6
a continuación, para verificar si
DR5
silenciamiento afectado apoptosis, la viabilidad celular y la tasa de apoptosis tenovin-6 inducida fueron analizados por WST-8 ensayo y citometría de flujo, respectivamente, en
TP53
-null KATOIII células. La inhibición de la expresión de DR5 por siRNA (Figura 4A) redujo significativamente la muerte celular inducida por tenovin-6 y la apoptosis en células de KATOIII (Figura 4B y 4C). Se han utilizado tres diferentes siRNAs en nuestro experimento preliminar, y conseguimos los resultados similares con los siRNAs
A:. KATOIII células fueron transfectadas con 1 nM de control de siRNA o siRNA contra DR5 ARNm. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se trataron con 5 mM tenovin-6 por 24 h. Western Blot mostró la regulación por disminución de DR5 de siRNA transfección. Un doblete de DR5 muestra su precursor (banda superior) y las isoformas maduros (banda inferior). B: Las células fueron transfectadas con el control 1 nM siRNA o DR5 siRNA durante 48 h, se trató con 0,2, 1, y 5 mM tenovin-6 durante 72 h y después se sometieron a mediciones de la viabilidad celular por WST-8 ensayo. La significación estadística de las diferencias entre grupos se evaluó mediante la prueba t de Student. *
p Hotel & lt; 0,01; **
p Hotel & lt; 0,05. C: El efecto de DR5 caída en tenovin-6 inducida por la apoptosis se analizó por citometría de flujo utilizando tinción con PI. Los resultados se expresan como la media ± SD. La significación estadística de las diferencias entre grupos se evaluó mediante la prueba t de Student.
Se investigó la activación de la vía de estrés del retículo endoplásmico (RE), que está vinculada a DR5 regulación, como se informó anteriormente [ ,,,0],17]. CHOP es uno de los más potente inductor de DR5 y aguas arriba de la apoptosis, y con frecuencia se libera durante el estrés ER. Como se muestra en la Figura 5A y 5B, aunque CHOP fue marginalmente hasta reguladas por tratamiento tenovin-6 en las cuatro líneas celulares de cáncer gástrico, el aumento de los niveles fueron significativamente más bajo que en las células control tratadas con thapsigargin, que es un inhibidor selectivo de la sarcoplásmico /retículo endoplasmático Ca
2 + - ATPasa y ampliamente utilizado como un factor de estrés celular ER [25], [26]. En las otras manos, IRE1, que es un sensor de estrés ER y situado en aguas arriba de CHOP, fue ligeramente hasta reguladas por tratamiento tenovin-6 en todas las líneas celulares, pero no PERK fosforilada y ATF6. [27], [28]. No parecía probable que tenovin-6 provocó estrés ER conduce a la inducción de DR5 en nuestras células de cáncer gástrico
A:. La expresión de proteínas asociadas con el estrés ER en líneas celulares de cáncer gástrico antes y después del tratamiento con 10 mM tenovin-6 . Tapsigargina en 3 M se administró a las células HEK293 como control. Un doblete de DR5 muestra su precursor y isoformas maduros. B: La intensidad relativa de expresión de CHOP en líneas celulares de la prueba se muestra. La significación estadística de las diferencias entre grupos se evaluó mediante la prueba de Dunnett.
Efecto antitumoral de tenovin-6 en combinación con agentes quimioterapéuticos
Por último, se examinó si tenovin-6 mejoró la antitumoral efectos de los agentes quimioterapéuticos que incluyen docetaxel, SN-38, cisplatino y 5-FU, en líneas celulares de cáncer gástrico. Cuatro líneas celulares con peso
TP53 gratis (MKN-45, NUGC-4), mt
TP53 gratis (NUGC-3), y nula
TP53 gratis (KATOIII) fueron tratados con solos o en combinación con dos dosis (2 y 5 micras) de tenovin-6 estos agentes. Las concentraciones fueron 0,25 docetaxel nM, 1 nM SN-38, 0,5 o 1 M de cisplatino, y 0,25 M 5-FU. Como se muestra en la Tabla 1 (y la figura S2), docetaxel y SN-38 mostró un ligero a moderado efecto sinérgico en el tratamiento tenovin-6 en tres líneas celulares, y cisplatino con tenovin-6 mostró un efecto sinérgico moderado en dos líneas celulares, mientras 5-FU en combinación con tenovin-6 mostraron un efecto más bajo que los otros agentes. Se examinó la expresión de DR5 después de la administración de tenovin-6 con agentes quimioterapéuticos. DR5 sobre regulación de tenovin-6 se ha mejorado con una combinación de docetaxel en MKN-45 células (Figura S3).
Discusión
Hemos demostrado que tenovin-6 mostró potente antitumoral la actividad acompañado de muerte celular por apoptosis en células de cáncer gástrico humano con peso
TP53
, así como aquellos con tm
TP53
. Varios inhibidores específicos de las sirtuinas, como sirtinol, suramina, salermide, y tiobarbitúricos, se reportaron para inhibir el crecimiento celular en varios tipos de cáncer [29]. La mayoría de los investigadores describieron los efectos antitumorales de los inhibidores de sirtuinas en líneas celulares con peso
TP53
[15], [29] - [31], y los atribuyen a la activación de la apoptosis a través de la acetilación de p53. Mientras tanto, varios informes fueron publicados en los últimos años que mostraron las actividades antitumorales de los inhibidores de sirtuinas en líneas celulares con tm
TP53
a través de vías independientes de p53 [17], [18]. Hemos demostrado que DR5 caída atenúa los efectos antitumorales de tenovin-6 en
TP53
células de cáncer gástrico-null. La activación de la vía de señalización del receptor de muerte a través de la regulación de DR5 juega un papel fundamental en la muerte celular tenovin-6 inducida, como se ha mencionado en otros informes sobre los inhibidores de sirtuinas.
Se ha informado de que salermide una mayor expresión de DR5 y la apoptosis inducida en células de cáncer de pulmón de células no pequeñas humanas llevando MT
TP53
[17]. En ese informe, el silenciamiento simultáneo de
SIRT1
y
SIRT2
, así como salermide hasta reguladas DR5, acompañado por la sobre regulación de las proteínas relacionadas con el estrés ER, como ATF4 y CHOP. Estos resultados sugieren que el estrés ER participó en esta inducción DR5. Especulamos que tenovin-6 también condujo a un aumento de la expresión de DR5 través de la activación de estrés ER mediada por PERK, IRE1, ATF6 y CHOP. Sin embargo, contrariamente a lo esperado, no fue, obviamente, detecta la vía de señalización de estrés ER activado por tenovin-6. Sin embargo, no hubo pruebas claras de que fue inducida por DR5 tenovin-6. Hay otras vías de CHOP mediada por DR5 regulación: especies de oxígeno reactivas (ROS), la
quinasa 2-terminal (JNK) y la vía c-Jun NH, la vía de la proteína quinasa activada por mitógeno p38, etc. [ ,,,0],32] - [38]. Sin embargo, no examinamos estas vías aquí porque no hemos podido identificar la activación CHOP en nuestro estudio. Nuestros resultados sugieren que otras vías p53 y CHOP-independientes participan en la expresión de DR5 tenovin-6 inducida en células de cáncer gástrico.
Hemos demostrado que tenovin-6 inducida por la muerte celular por apoptosis mediante la activación de la vía de DR5. Sin embargo, parecía poco probable que participe en esta inducción de p53 DR5 y cortar las vías, y el mecanismo de DR5 regulación sigue siendo poco clara. Hemos, recientemente, investigado los efectos antitumorales de tenovin-6 en varias líneas celulares de cáncer de colon, y encontrado su potente actividad antitumoral frente a la mayoría de ellos con regulación de DR5 así como [39]. Sin embargo, en las células de cáncer de colon CaCo2 (MT
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), apoptosis la muerte celular por tenovin-6 era menos evidente y la expresión de DR5 no estaba fuertemente regulado hasta. células CaCo2 se han reportado para expresar alto nivel de proteínas de choque de calor conocido como un supresor de DR5 [40] - [43]. Esta relación debe ser estudiado más en el futuro. SIRT1 puede deacetylate lisina histona H4 16 (H4K16), así como H3K9, H3K14 y H1K26, que están estrechamente relacionados con el silenciamiento de genes [11]. Además, tiene muchas correspondientes sustratos no histonas: factores de transcripción, elementos de maquinaria de reparación del ADN, los receptores nucleares, enzimas modificadoras de histonas, y moléculas de señalización celular, tal como se describe en otra parte [11] - [13]. Estas numerosas y complicadas asociaciones de la actividad de SIRT1 participan en diversas funciones biológicas, como la regulación de la expresión génica y el ADN a reparar el daño. Las células cancerosas tienden a requerir estas funciones de SIRT1 con el fin de sobrevivir, proliferar, y reparar el daño genómico catastrófica. Estudios recientes han identificado la capacidad de tenovin-6 para inducir la diferenciación e inhibir la autofagia como parte de sus efectos anti-neoplásicas en células de leucemia [44], [45]. Esto puede depender de comportamiento de las células del cáncer de cómo tenovin-6 afecta a la actividad neoplásica. Se necesitan más estudios para aclarar la relación entre la vía de la muerte tenovin-6-mediada y las complejas funciones de SIRT1.
Hemos examinado los efectos de la combinación de docetaxel, SN-38, cisplatino y 5-FU con tenovin -6 porque han sido ampliamente utilizados para el tratamiento de pacientes con cáncer avanzado gástrico [46], [47]. Leve a moderada efectos sinérgicos de docetaxel y SN-38 con tenovin-6 en las líneas celulares de cáncer gástrico, independientemente de
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estado, no se encontraron.
A pesar de los tratamientos que implican combinaciones de docetaxel y sirtuinas inhibidores no se han reportado, se ha informado de combinaciones de docetaxel y otros inhibidores de HDAC tales como tricostatina a y suberoilanilida del ácido hidroxámico (SAHA) para tener efectos sinérgicos relacionados con la activación de la caspasa o la acetilación de tubulina en varias líneas celulares de cáncer [48] - [50] . En nuestro estudio, no queda claro si la acetilación de tubulina por tenovin-6 siempre se ve afectado el efecto antitumoral, debido a que la acetilación de tubulina se muestra sólo en una línea celular. SN-38 (la forma activa de irinotecán) es un inhibidor de la topoisomerasa I de ADN que actúa solamente durante la fase S y interfiere con la replicación del ADN y la división celular [51], [52]. inhibidores de HDAC inducen la acetilación de las histonas y aflojar la estructura de la cromatina, en el que inhibidor de la topoisomerasa puede acceder más fácilmente a ADN, facilitando de daño en el DNA [51], [53]. Además, un aumento notable de la generación de ROS se ha informado en las células de cáncer de pulmón de células pequeñas con la exposición simultánea a SAHA y topotecan (un derivado de la camptotecina) [51]. El aumento de la potencia de tratamiento que combina tenovin-6 y SN-38 podrían ser atribuibles a la regulación de cooperación de la respuesta al daño del ADN.
La ventaja de la terapia combinada con tenovin-6 y cisplatino o 5-FU fue menor que la con los otros agentes en células de cáncer gástrico, aunque varios informes han demostrado la mejora de la apoptosis por el tratamiento combinado con cisplatino o 5-FU y otros inhibidores de HDAC en otros tumores [54] - [57].
en cuanto a la evaluación de la toxicidad de tenovin-6, se utilizó una línea celular de fibroblastos como las células no tumorigénicas alternativos para predecir la toxicidad frente a células normales se hace referencia a los informes anteriores [15], [18]. Era difícil encontrar un control normal apropiado para estudios comparativos, y por lo tanto es definitivamente necesario para estudiar la toxicidad de tenovin-6 (en combinación con medicamentos contra el cáncer)
in vivo
, utilizando modelos animales de xenoinjertos.
En conclusión, un inhibidor de sirtuina, tenovin-6, mostró un efecto antitumoral robusto frente a las células de cáncer gástrico humano. Esto es independiente de
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de estado y fue inducida a través de la regulación de DR5.