Extracto
Con el fin de explorar la utilización eficiente de los recursos vegetales de los humedales construidos, los anti potencial -metastatic efectos de los flavonoides de
Potamogeton crispus L.
fueron investigados en células de cáncer de ovario humano (ES-2). Dos flavonoides principales, luteolina-3'-O-β-D-glucopiranósido y flavona-6-C-β-D-glucopiranósido, se aislaron de
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crispus
e identificado. a continuación, se investigaron los efectos de estos flavonoides sobre la proliferación celular, la morfología celular, el ciclo celular, la apoptosis y la migración celular y la invasión. Además, se llevaron a cabo revertir la polimerasa con transcriptasa ensayos de reacción en cadena y análisis de transferencia Western para examinar el nivel de expresión de mRNA y proteína. Los resultados indicaron que luteolina-3'-O-β-D-glucopiranósido inhibida ES-2 migración celular y la invasión y suprimió la expresión de dos metaloproteinasas de matriz (MMP), MMP-2 y MMP-9, y flavona 6-C-β -D-glucopiranósido no tuvo efectos inhibitorios significativos en ES-2 células. Por lo tanto, este estudio demostró los potenciales propiedades anti-metastásicos de un
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flavonoide, y proporcionó un enfoque científico para el examen de los recursos naturales prometedores de humedales construidos para identificar productos útiles para su uso en las industrias farmacéutica y de salud
Visto:. Du Y, Feng J , Wang R, H Zhang, Liu J (2015) Efectos de los flavonoides de
Potamogeton crispus L.
sobre la proliferación, migración e invasión de células de cáncer de ovario humano. PLoS ONE 10 (6): e0130685. doi: 10.1371 /journal.pone.0130685
Editor: Jung weon Lee, de la Universidad Nacional de Seúl, Corea, República de
Recibido: 3 Febrero 2015; Aceptado: 24 de mayo de 2015; Publicado: 22 Junio 2015
Derechos de Autor © 2015 Du et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este estudio fue apoyado financieramente por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 31200426), Proyecto Especial Nacional del agua (núm 2012ZX07203-004), Ciencia y Proyecto de tecnología de Planificación de la provincia de Shandong (núm 2011GGH21605), y la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Shandong de China (No.ZR2014YL001). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
las plantas juegan un papel clave en la construcción de ambientes de humedales artificiales y deben ser manejados estrictamente para mantener la eficiencia de los humedales y reducir al mínimo el riesgo de contaminación secundaria y los efectos ecológicos negativos sobre el ecosistema. utilización eficiente de los recursos de biomasa de alta plantas de humedal es importante porque estimula la cosecha y el manejo sostenible de los humedales construidos.
Potamogeton crispus L.
es una de las plantas más importantes empleadas en los ecosistemas de humedales construidos [1]. En informes anteriores se han identificado los carotenoides, ácidos grasos, lignanos, diterpenos labdano, flavonoides y phytosterins en
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[2-5], y extractos de carotenoides a partir de
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fueron reportados para inducir la apoptosis en células HeLa
in vitro
[6]. Nuestro estudio preliminar mostró actividades antitumorales de un
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extracto de mama humano y líneas celulares de cáncer de ovario [7], análisis químicos y flavonoides sugirió a ser los principales componentes de este extracto.
Está bien establecido que los flavonoides tienen una amplia gama de actividades bioquímicas y juegan un papel importante en la industria de la salud humana [8-9]. Los datos epidemiológicos y clínicos indican que los flavonoides en la dieta hacen contribuciones importantes a la prevención y /o tratamiento de las enfermedades crónicas como el cáncer, la diabetes, las enfermedades cardiovasculares y la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana, [10-14]. La investigación reciente en las propiedades de flavonoides se ha centrado en sus actividades antitumorales citotóxicos, y los estudios experimentales han indicado que los flavonoides suprimen la migración y la invasión, afectan a la progresión del ciclo celular, e inducir la apoptosis en varias líneas de células tumorales [15-16].
la metástasis del cáncer es la primera causa de mortalidad en pacientes con tumores malignos, y se estima que es responsable del 90% de las muertes relacionadas con el cáncer humano [17]; por lo tanto sigue un reto importante para la terapia del cáncer. La degradación de la matriz extracelular (ECM) es una característica crucial de los tumores metastásicos y este proceso está asociado con la sobre-expresión de metaloproteinasas de la matriz (MMPs) [18-19]. Se ha informado de que luteolina y baicaleína flavonoides inhibir la metástasis mediante la supresión de la expresión y secreción de MMP2 y MMP9 en células de cáncer de mama humano y células de carcinoma hepatocelular en (MHCC97H) (MDA-MB-231 MCF-7 y) [20-22] . Sin embargo, no está claro si los flavonoides tienen efectos anti-metastásicos en las células de cáncer de ovario.
En el presente estudio, nos purifica dos flavonoides de
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crispus Opiniones y examinado sus efectos sobre el cáncer de ovario humano línea de células ES-2. La proliferación, la morfología, la progresión del ciclo celular, la apoptosis, la migración y la invasión de estas células se investigaron con el objetivo de elucidar los efectos de
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flavonoides en es-2 células y los mecanismos implicados.
Materiales y Métodos
Ética declaración
El estudio de campo y recogida de muestras que participan en este estudio se llevó a cabo con el permiso oficial de la Oficina de Protección Ambiental de Weishan County y el Comité de Gestión de Xinxue río humedal artificial. El trabajo de campo no implicaba ninguna especies de plantas en peligro de extinción o protegidas o de cualquier especie animal. El protocolo de laboratorio fue aprobado por el comité de ética de la Universidad de Shandong.
Preparación de material vegetal
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se recogió crispus
material en el río Xinxue humedal artificial (117.16 ° E, 34.78 ° N), en Nansi lago, condado de Weishan, China. La colección se llevó a cabo a principios de julio, cuando
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tuvieron la biomasa máxima. Toda la planta se secó, en polvo, y se extrajo con etanol a reflujo calefacción tres veces, durante 90 minutos por extracción. A continuación, el extracto de etanol se suspendió en agua antes de la partición con éter de petróleo (PE), acetato de etilo (EtOAc), y n-butanol secuencialmente; éstas se concentraron a vacío para dar un extracto PE, un extracto de EtOAc, y un extracto de n-butanol. En base a los estudios anteriores [7], se seleccionó el extracto de EtOAc para una separación adicional. El extracto de EtOAc se sometió a cromatografía en una columna de gel MCI, seguido por cromatografía en columna Sephadex LH-20, los dos compuestos principales A continuación, se preparan usando cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) (Agilent 6270, EE.UU.). Los dos compuestos se identificaron mediante HPLC, la resonancia magnética nuclear (RMN) (AVANCE 600, Bruker, Alemania), y de alta resolución de la espectrometría de masas de ionización por electrospray (HR-ESI-MS) (LTQ Orbitrap XL, ThermoFisher, EE.UU.).
cultivo celular y tratamiento
la línea celular de cáncer de ovario humano ES-2 se obtuvo del Centro de Análisis y Ensayo de Shandong en agosto de 2014. las células fueron cultivadas en medio RPMI-1640 (Hyclone, EE.UU.) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) (Gibco, Life Technologies, EE.UU.) y antibióticos (100 mg /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina) (Hyclone). Los cultivos de células se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera humidificada con 5% de CO
2. Los compuestos se disolvieron a una concentración de 0,1 M en 100% de sulfóxido de dimetilo (DMSO) (Solarbio, China) para formar soluciones de reserva, se almacenaron a -20 ° C, y se diluyeron a las concentraciones indicadas con el medio antes de cada experimento. La concentración final de DMSO no excedió 0,1% durante todo el estudio, y todos los grupos de control se expusieron a 0,1% de DMSO.
proliferación de las células de ensayo
efectos de flavonoides sobre la proliferación celular se evaluó utilizando el MTT (bromuro de tiazolilo azul de tetrazolio) (Solarbio) de ensayo. ES-2 se sembraron las células (1 × 10
4 por pocillo) en una placa de 96 pocillos en medio RPMI-1640 suplementado con 10% FBS. Después de la incubación durante la noche a 37 ° C en 5% de CO
2, diferentes concentraciones (15 a 240 mg /ml) de los compuestos se añadieron en pocillos por triplicado. Después de la incubación durante 48 h, se añadió MTT a cada pocillo para lograr una concentración final de 0,5 mg /ml y la incubación se realizó durante 4 h adicionales. A continuación, el medio se sustituyó por la solución de parada (DMSO; 150 l por pocillo) y la absorbancia a 490 nm se midió en un lector de placas (Enspire, Perkin Elmer Corporation, EE.UU.). Los controles de DMSO 0,1% se midieron en paralelo. La citotoxicidad se expresa como la tasa de inhibición, que se calcula como sigue: donde A
control = la absorbancia de los pocillos de control; Un
= muestra de la absorbancia de los pocillos tratados; Un
0 = la absorbancia de los pocillos en blanco. software Origen 7.5 se utilizó para analizar los datos y calcular IC
50 valores. Los ensayos se repitieron al menos tres veces.
Observación de la morfología celular
ES-2 células fueron cultivadas como se describe para el ensayo de proliferación celular. Las células se trataron con 30 o 60 mg /ml luteolina-3'-O-β-D-glucopiranósido (LU3'O-GP) o 100 mg /ml de flavona-6-C-β-D-glucopiranósido (FL6C-GP ). observaciones de la morfología celular se llevaron a cabo después de la incubación durante 48 horas, utilizando un microscopio de fluorescencia invertido (Ti-S, Nikon, Japón).
ciclo celular ensayo de progresión
ES-2 células (5 × 10
4 por pocillo) se sembraron en una placa de 6 pocillos y se incubaron durante la noche a 37 ° C en 5% de CO
2 antes de la adición de los compuestos indicados preparados en medio completo durante 48 h. Después las células se recogieron por tripsinización, se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS), y se fijaron en 70% de etanol a 4 ° C durante 2 h. Las células se lavaron dos veces con PBS, y se centrifugaron a 2000 rpm durante 5 min; se descartó el sobrenadante. Las células se resuspendieron en 100 l de PBS que contenía RNAsa (50 mg /ml) y se incubaron a 37 ° C durante 30 min; a continuación, se detuvo la reacción mediante la colocación en hielo durante 2 min. ES-2 células se tiñeron por incubación con 10 mg /ml de yoduro de propidio (PI) con 0,1% Triton X-100 en la oscuridad a 4 ° C durante 30 min. Las muestras fueron analizadas por citometría de flujo (FACSAria, BD, EE.UU.) y los resultados fueron analizados por FlowJo 7.6.1.
apoptosis de las células de ensayo
La anexina-V-PE /7-AAD kit de detección de apoptosis (BD Pharmingen, EE.UU.) se utilizó para investigar los efectos de los compuestos de ensayo sobre la apoptosis en ES-2 células. Anexina V es una proteína que tiene una alta afinidad por la fosfatidilserina (PS). Durante la apoptosis, la PS se transloca desde la cara interna de la membrana plasmática a la superficie celular, donde puede detectarse utilizando un conjugado de anexina V fluorescente. ES-2 células se cultivaron y se sembraron como se describió anteriormente para el ensayo de la progresión del ciclo celular. Después de la incubación con
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flavonoides durante 48 h, las células se recogieron por tripsinización, se lavaron dos veces con PBS y se resuspendieron en 400 l de tampón de unión antes de la adición de 5 l de anexina V-PE, la incubación en la oscuridad a 4 ° C durante 15 min, y la tinción con 10 l de solución de 7-AAD. Las muestras se analizaron por citometría de flujo (FACSAria, BD) después de la incubación en la oscuridad a 4 ° C durante 15 min, y los resultados se analizaron por software FlowJo 7.6.1. Apoptóticos y células necróticas fueron identificados por la anexina V positivas /7-AAD tinción negativa y anexina V tinción positiva /7-AAD, respectivamente.
La migración de células de ensayo
ensayos de migración celular se llevaron a cabo usando Transwell cámaras (Corning Costar, EE.UU.) la cámara Transwell se llenó con albúmina de suero medio y 0,1% bovina (BSA) (Gibco, Life Technologies) se incluyó en el medio libre de suero en la cámara superior, para mantener la presión osmótica. ES-2 células fueron expuestas a las concentraciones de flavonoides se indica en un medio libre de suero durante 48 h antes de añadir las células (2 × 10
5) a la cámara Transwell superior. El medio contenido cámara inferior con 5% de FBS para servir como un quimioatrayente. Las cámaras se incubaron durante 24 h y las células no migratorias en el lado superior de la membrana Transwell se retiraron usando hisopos de algodón. La membrana se fija en el 100% de metanol; las células migradas fueron teñidas con 0,1% de cristal violeta durante 10 minutos, y se lavaron tres veces con PBS. La membrana fue fotografiada con un microscopio antes de ser lavada con ácido acético 33%; la absorbancia del eluyente se midió a 590 nm en un lector de placas (Enspire, Perkin Elmer Corporation).
invasión de la célula de ensayo
invasión celular se ensayó usando el protocolo descrito anteriormente para la migración celular ensayo, excepto que la cámara Transwell se revistió con Matrigel (BD Pharmingen) y el medio estaba libre de BSA.
Aislamiento de RNA total y reacción en cadena de la polimerasa transcriptasa inversa (RT-PCR)
ES-2 células fueron sembradas en una placa de 6 pocillos (4 × 10
5 células por pocillo) y se incubaron durante la noche antes del tratamiento con diversas concentraciones de LU3'O-GP (0, 30, 60, 90 mg /ml ) durante 48 h. Las células se recogieron por tripsinización y se lavaron en PBS. El ARN total fue aislado utilizando Trizol (Invitrogen, Life Technologies) y se utilizó 5 mg para sintetizar ADNc utilizando M-MLV (Invitrogen, Life Technologies). El cDNA se amplificó utilizando las siguientes secuencias de cebadores (BGI, China):
MMP2, adelante, 5'-GTTCATTTGGCGGACTGT-3 ', inversa, 5'-AGGGTGCTGGCTGAGTAG-3';
MMP9 , adelante, 5'-AATCTCACCGACAGGCAGCT-3 ', inversa, 5'-CCAAACTGGATGACGATGTC-3';
El gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), adelante, 5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3 ', inversa, 5' -CATGGGTGGAATCATATTGGAA-3 '
PCR se realizó con el siguiente programa:. 95 ° C durante 5 minutos; luego 45 ciclos de 95 ° C durante 10 s; 55 ° C durante 15 s; y 72 ° C durante 10 s. Las muestras se calentaron a continuación, (72 ° C durante 10 min) y se enfriaron a 4 ° C. GAPDH se usó como el control de carga de ARN. Los productos de PCR se separaron en geles de agarosa al 1% y se detectaron por tinción con bromuro de etidio. Los resultados fueron analizados por BandScan5.0.
Western Blot análisis
ES-2 células fueron sembradas en una placa de 6 pocillos (4 × 10
5 células por pocillo) y se incubaron durante la noche antes del tratamiento con diversas concentraciones de LU3'O-GP (0, 30, 60, 90 mg /ml) durante 48 h. Las células se suspendieron en 500 l de tampón de lisis a 4 ° C (40 mM Tris-HCl, EDTA 1 mM, KCl 150 mM, NaVO3 100, 1% de Triton X-100 PMSF, 1 mM, pH 7,5). Las proteínas se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio al 10% y se transfirieron a membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon posteriormente utilizando leche desnatada en 5% de solución salina tamponada con Tris con Tween-20 (TBST) a 37 ° C durante 1 h y se incubó durante la noche con anticuerpos primarios (MMP-2 de anticuerpos: Santa Cruz Biotechnology, EE.UU., MMP-9 anticuerpo: RabMab, Abcam, UK) en TBST que contenía 5% de leche desnatada a 4 ° C. Las membranas se incubaron con un anticuerpo secundario durante 1 h a temperatura ambiente. Las bandas se detectaron mediante quimioluminiscencia mejorada y fotografiado; los resultados se analizaron mediante el software Image J.
estadístico El análisis
Para cada ensayo, se realizaron experimentos por triplicado y los resultados se presentan como la media ± desviación estándar (SD). La significación de las diferencias entre grupos fue examinada usando la prueba t-Student de dos colas (software de Microsoft Excel).
Resultados
Identificación de las dos principales
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flavonoides
HPLC, RMN, y HR-ESI-MS se llevaron a cabo para aislar e identificar los dos compuestos principales dentro de la
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extracto de EtOAc. Se identificaron y caracterizaron como luteolina-3'-O-β-D-glucopiranósido (LU3'O-GP) y flavona-6-C-β-D-glucopiranósido (FL6C-GP) mediante la comparación de sus datos espectrales (HPLC Estos compuestos , HR-ESI-MS,
1 H y
13C RMN) y propiedades físico-químicas con los reportados en la literatura [23-25]. Este es el primer informe de la extracción de estos dos flavonoides de
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crispus
. La estructura molecular de dos compuestos se muestra en la figura 1, y la pureza de tanto los compuestos estaba por encima de 90% (Figs a y b en S1 File).
LU3'O-GP inhibida ES- 2 proliferación de las células se incubaron
ES-2 células de cáncer de ovario durante 48 h con cinco concentraciones diferentes de LU3'O-médico de cabecera o FL6C-GP. Los resultados del ensayo MTT indicaron una disminución dependiente de la concentración de la viabilidad celular en presencia de LU3'O-GP (Fig 2). La viabilidad celular se redujo en 63,8% y 73,6% después de 48 h de exposición a 120 y 240 mg /ml LU3'O-GP, respectivamente, y la IC
50 valor fue de 57,1 mg /ml. Las mismas concentraciones de FL6C-GP tenido un impacto significativamente menor en la viabilidad celular y este compuesto tenía una IC
50 valor de 182,7 g /ml. Estos resultados indicaron que LU3'O-GP inhibe la proliferación de ES-2 células de una manera dependiente de la concentración
Las células se incubaron con cinco concentraciones diferentes de flavonoides o sulfóxido de dimetilo. (DMSO, control) durante 48 h. Los datos representan las medias de tres experimentos ± desviación estándar (SD) *
p Hotel & lt; 0.01.
LU3'O-GP afectados ES-2 morfología
exámenes morfológicos se llevaron a cabo para investigar más a fondo el efecto de LU3'O GP-ES-2 en las células. Las células ES-2 fueron tratados con concentraciones de LU3'O-GP asociados con baja citotoxicidad (30 y 60 mg /ml), o 100 mg /ml FL6C-GP. Las imágenes obtenidas por microscopía invertida después de 48-h incubaciones se muestran en la Figura 3. El control y las células de comparación FL6C-GP mostraron el patrón de células fusiformes clásica observada en las células de tumor de ovario. Las células tratadas con LU3'O-GP mostraron una pérdida significativa de la movilidad y los cambios en la morfología celular; el cambio morfológico importante fue la forma cytomere, que se convirtió esférica, con un tentáculo más corta. Estos cambios se produjeron de una manera dependiente de la concentración. El tratamiento FL6C-GP produjo ningún cambio significativo, en comparación con las células de control. Estos resultados indicaron que LU3'O-GP podría cambiar la morfología celular de ES-2 células y sugirió su posible influencia en la movilidad celular.
ES-2 células fueron tratadas con el indicado
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flavonoides durante 48 h, y fotografiado usando un microscopio de fluorescencia invertido
inducida LU3'O-GP detención del ciclo celular. en células ES-2
Para determinar si
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flavonoides afectados el ciclo celular, ES-2 células tratadas con cualquiera de LU3'O-GP o 100 mg /ml de FL6C-GP para la comparación, antes del análisis por citometría de flujo. Los resultados (figura 4) indicaron que el tratamiento LU3'O-GP causó aumentos dependientes de la concentración en el número de células en la fase G0 /G1, y las disminuciones en el número de células en fase S, mientras que el tratamiento FL6C-GP no tuvo efectos significativos en la progresión del ciclo celular en ES-2 células. Estos resultados demostraron que LU3'O-GP afectada ES-2 progresión del ciclo celular al causar la detención del ciclo celular en la interfase de la fase G1 y la fase S
(a) Control negativo.; (B) las células tratadas con 100 mg /ml de flavona-6-C-β-D-glucopiranósido (FL6C-GP); (C) células tratadas con 30 mg /ml luteolina-3'-O-β-D-glucopiranósido (LU3'O-GP); y células (d) tratados con 60 mg /ml LU3'O-GP. Las células se fijaron con etanol y se tiñeron con yoduro de propidio antes del análisis de la distribución del ciclo celular mediante citometría de flujo. El número de células en la fase G0 /G1 está representado por el primer pico, y los que están en fase G2 /M se representan por el segundo pico. Las células en fase S están presentes en el área entre el G0 /G1 y G2 /M picos. Estos datos representan la media de experimentos por triplicado. *
p & lt; 0,01
en comparación con el control
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crispus
flavonoides no tuvo ningún efecto sobre la apoptosis en células ES-2
La apoptosis es un modo activo y fisiológica de muerte celular que comúnmente se restauró por agentes anti-cáncer. La citometría de flujo se utilizó para determinar si LU3'O-GP afectada ES-2 apoptosis. Como se representa en la figura 5, la población de células en la zona Q3 representa las células apoptóticas, que eran anexina V positiva y 7-AAD negativo. Esta población no mostró ningún cambio evidente en la presencia de LU3'O-médico de cabecera o FL6C-GP, lo que sugiere que
P
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crispus
flavonoides no tuvieron efecto sobre la apoptosis en células ES-2
(a) Control negativo.; (B) las células tratadas con 100 mg /ml de flavona-6-C-β-D-glucopiranósido (FL6C-GP); (C) células tratadas con 30 mg /ml luteolina-3'-O-β-D-glucopiranósido (LU3'O-GP); (D) células tratadas con 60 mg /ml LU3'O-GP. Las células apoptóticas se muestran en la Q3.
LU3'O-GP inhibieron la migración y la invasión de las células ES-2
motilidad celular se considera que es un determinante importante del potencial metastásico de Células cancerígenas. El efecto de LU3'O-GP sobre la motilidad de las células cancerosas ES-2 se examinó usando un ensayo de migración celular. Como se muestra en la figura 6, la migración de ES-2 células se redujo significativamente de una manera dependiente de la concentración después de la exposición a LU3'O-GP. Esta inhibición fue de 67,7% y 88,1%, en comparación con las células de control, en presencia de 30 y 60 mg /ml LU3'O-GP, respectivamente. Las células tratadas con FL6C-GP no mostraron cambios significativos en la actividad de la migración, en comparación con las células de control.
Las células se expusieron a las concentraciones indicadas de luteolina-3'-O-β-D-glucopiranósido (LU3 ' O-GP) y flavona-6-C-β-D-glucopiranósido (FL6C-GP), y su migración se cuantificó usando una cámara Transwell. Los valores representan las medias de experimentos por triplicado. *
p Hotel & lt; 0,01, en comparación con el control;#
p Hotel & lt; 0,05, en comparación con la concentración indicada.
Durante la metástasis del tumor, las células deben pasar a través de la ECM. Para evaluar si LU3'O-GP afectada ES-2 invasión de células, ensayos de invasión de células se llevaron a cabo en una cámara Transwell recubierta con Matrigel. El tratamiento de la ES-2 células con concentraciones crecientes de LU3'O-GP condujo a una disminución significativa dependiente de la concentración de la tasa de invasión de células, en comparación con el control (Fig 7). Este proceso se inhibió en aproximadamente un 73,7% y 89,9% en presencia de 30 y 60 mg /ml LU3'O-GP, respectivamente, mientras que la inhibición inducida por 100 g /ml FL6C-GP fue sólo 6,7%. Los resultados de este ensayo demostraron que LU3'O-GP inhibe dramáticamente la invasión de ES-2 células.
Las células se trataron con luteolina-3'-O-β-D-glucopiranósido (LU3'O-GP ) o flavona-6-C-β-D-glucopiranósido (FL6C-GP), y su invasión se cuantificó en una membrana cámara Transwell con Matrigel. Los valores representan las medias de experimentos realizados por triplicado. *
p Hotel & lt; 0,01, en comparación con el control;#
p Hotel & lt; 0,05, en comparación con la concentración indicada.
A fin de determinar la influencia de LU3'O-GP en los factores de aguas arriba que son importantes para la regulación de la invasión de células tumorales, el ARNm y la proteína de expresión de MMP2 y MMP9 se investigaron. Los resultados del ensayo de RT-PCR se muestran en la figura 8. Los niveles de MMP2 y MMP9 mRNAs se redujeron de una manera dependiente de la concentración mediante tratamiento con LU3'O-GP, análisis de transferencia Western (Fig 9) mostró una supresión similar de MMP 2 (pro-MMP-2 y MMP-2) expresión de la proteína y MMP-9 por LU3'O-GP. Estos resultados sugieren que los flavonoides, LU3'O-GP, la expresión de MMP-2 y MMP9, tanto a nivel de ARNm y proteínas suprimida
(a) Efectos LU3'O-GP de MMP-2 expresión.; (B) efectos LU3'O-GP sobre la MMP-9 expresión. los niveles de mRNA fueron investigados por reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR), usando gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa como el control de carga. productos de RT-PCR se detectaron por tinción con bromuro de etidio. Los valores representan las medias de experimentos por triplicado. *
p Hotel & lt; 0,05, en comparación con el control
(a) Efectos LU3'O-GP de MMP-2 (pro-MMP-2 y MMP-2).; (B) efectos LU3'O-GP sobre la MMP-9 expresión. Los niveles de proteína fueron investigados por el análisis boltting occidental. Los valores representan las medias de experimentos por triplicado. *
p Hotel & lt; 0,05, en comparación con el control.
Discusión
En este estudio, los dos principales flavonoides, LU3'O-GP y GP-FL6C, se aislaron e identificaron a partir de
P
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crispus Vaya con el objetivo de explorar los potenciales efectos anti-metastásicos de este recurso vegetal humedal construido. La metástasis es la causa principal de muerte en pacientes con cáncer y el desarrollo de nuevos regímenes de tratamiento que inhiben la difusión tumor es crucial para la terapia del cáncer exitosa y la prevención. Sin embargo, lo más altamente citotóxicos fármacos contra el cáncer sintéticos poseen una baja especificidad; esto produce efectos sobre los tejidos normales, además de las células tumorales, lo que lleva a los resultados clínicos pobres. Por lo tanto, el énfasis considerable se ha dado a la identificación de nuevos agentes contra el cáncer a partir de fuentes naturales, y los recursos comestibles son particularmente valiosos debido a su alto margen de seguridad; muchos agentes dietéticos naturales están actualmente en ensayos clínicos de fase temprana [26]. Los flavonoides proporcionan uno de los recursos naturales más destacados en este contexto. flavonoides en la dieta casi todos existen como glicósidos en la naturaleza y los glucósidos flavonoides más abundantes de las plantas son flavona O /C-glucósidos de flavonol y O-glucósidos [27].
LU3'O-GP es una flavona O-glucósido y FL6C-GP es una flavona C-glucósido. Sin embargo, el presente estudio indicó que LU3'O-GP producido efectos significativos sobre la proliferación ES-2, la morfología, la progresión del ciclo celular, la migración y la invasión, mientras que FL6C-GP no tuvo efectos aparentes sobre estas células. La hipótesis de que esta diferencia se relaciona con dos diferencias entre estos compuestos. En primer lugar, las agliconas flavonoides pueden mostrar diferentes actividades biológicas. Luteolina, las agliconas de LU3'O-GP, y algunos luteolina C-glicósidos se han demostrado para inhibir la supervivencia de células tumorales y la metástasis en varias células cancerosas epitelioides humanos incluyendo células LNM35 MCF-7, MDA-MB231, y [21, 28 29]. En segundo lugar, los glucósidos flavonoides son demasiado a difundirse a través de la membrana celular soluble en agua, mientras que las agliconas son más hidrófobos y pueden entrar fácilmente en las células por difusión pasiva; por lo tanto, la desglicosilación de glucósidos flavonoides a sus agliconas se considera que es la primera etapa del metabolismo, la producción de efectos
in vivo
[30]. Por lo tanto, diferentes restos de azúcar unidos a agliconas de flavonoides podría influir en su desglicosilación y el metabolismo en un cierto grado y resultar en diferencias en la bioactividad [31]. En el presente estudio, LU3'O-GP no indujo la apoptosis en ES-2 células, aunque luteolina se había informado anteriormente para inducir la apoptosis en algunas células cancerosas humanas y en células de neuroblastoma de ratón [32-33]. Por lo tanto, nuestros resultados también pueden proporcionar evidencia de la variación relacionada glicosilación de flavonoides en la actividad.
Sin embargo, es posible que los efectos de la glicosilación sobre la bioactividad de flavonoides
en vitr sobre O pueden ser diferentes a los observados
in vivo
. glucósidos flavonoides se han reportado para mostrar actividades similares o incluso mayores antidiabético, anti-inflamatorios, anti-degranulación, anti-estrés y anti-alergia que sus agliconas flavonoides
in vivo
[31]. En general, es muy difícil sacar conclusiones generales relacionadas con el impacto de la glicosilación de flavonoides y bioactividades se necesita más investigación para entender la relación entre la glicosilación de flavonoides y bioactividad
in vivo
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in vitro
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MMP-2 y MMP-9 son enzimas cruciales que son considerados como contribuyentes importantes a los procesos de metástasis y la angiogénesis invasiva en diversos tumores [34-37]. los niveles de MMP-9 y MMP-2 de expresión son significativamente elevados en una serie de carcinomas [36, 38]. Por lo tanto, la inhibición de MMP-2 y MMP-9 expresión debe ser una alta prioridad durante la terapia del cáncer. En el presente estudio, ES-2 células fueron tratadas con LU3'O-GP a concentraciones asociadas con baja citotoxicidad con el fin de evaluar la actividad anti-metastática de este compuesto, y también se llevó a cabo un ensayo de apoptosis. Estos hallazgos indicaron que LU3'O-GP, inhibió ES-2 migración celular y la invasión y estos efectos estaban estrechamente relacionados con una expresión reprimida de MMP-2 y MMP-9 en el ARNm y el nivel de proteína en la ausencia de efectos citotóxicos o apoptóticos. Además, dado que la diseminación metastásica de las células tumorales es un proceso de múltiples etapas que implica una serie de eventos fisiológicos complejos, MMP-2 y la expresión de MMP-9 está regulado por una complicada red de vías de señalización que puede ser activado por una serie de crecimiento factores, citoquinas, y productos químicos tales como PI3K /Akt, p38-MAPK, NF-kB, EGFR, ERK1 /2, y TPA, que actúan a través de una serie de vías, tales como la vía MAPK /ERK [39-45]. Esto indica que los mecanismos de la metástasis subyacentes pueden ser específicos para diferentes tipos de células tumorales. Por lo tanto, la inhibición inducida por LU3'O clara GP-ES-2 de la metástasis debe ser explorado en otros tipos de células tumorales.
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crispus
es una especie ampliamente utilizados en humedales construidos y que se deben cosechar en el momento apropiado para mantener la remoción de contaminantes eficaz y para evitar la contaminación secundaria y los efectos ecológicos negativos. La gran cantidad de
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crispus
biomasa puede hacer que los procedimientos posteriores a la cosecha desafiante. Productos naturales y hierbas medicinales son prometedoras fuentes de nuevos agentes terapéuticos para la industria de la salud humana [46]. En este estudio, los flavonoides con actividad anti-metastásico se aislaron de
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crispus
, lo que indica que esta especie tenía beneficios potenciales para la salud. Nuestro estudio proporciona una base científica para la proyección de los recursos naturales prometedores como fuente de medicamentos y sugirió un enfoque potencial para la utilización eficiente y sostenible de los recursos vegetales en los humedales construidos.
Apoyo a la Información
S1 Archivo. La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) análisis de dos flavonoides aislados de
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crispus
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Luteolina-3'-O-β-D-glucopiranósido (LU3'O-GP) (figura a). flavona-6-C-β-D-glucopiranósido (FL6C-GP) (Fig b). La HPLC empleó una columna de Agela C18 (simetría R 4,6 × 250 mm) con metanol y H
2O (40%: 60%) como la fase móvil, a una velocidad de flujo de 1 ml /min durante 40 min y se utiliza . detección UV /V
doi: 10.1371 /journal.pone.0130685.s001 gratis (TIF)
Reconocimientos
Estamos agradecidos al editor académico y los revisores por su valiosa sugerencias. También queremos agradecer a los editores profesionales de Editage para su edición de Inglés.