Extracto
Se ha informado de una nueva función para el aglutinante de dos moléculas Arl (BART) en las células de cáncer de páncreas. De BART inhibe la invasividad de las células del cáncer pancreático a través de la unión a un Ca
2 + dependiente, la proteína de fusión de membranas fosforilada, guanosina trifosfatasa (GTPasa), annexin7 (ANX7). Una función supresora de tumores de ANX7 se había informado anteriormente sobre la base de su papel pronóstico en los cánceres humanos y el propensas al cáncer fenotipo del ratón
ANX7 gratis (+/-). La investigación adicional ha demostrado que el complejo de BART-ANX7 se transporta hacia salientes de células en la migración de las células cuando Bart apoya la unión de ANX7 a la proteína quinasa C (PKC) isoforma PKCa. La evidencia reciente ha sugerido que la fosforilación de ANX7 por PKC potencia significativamente fusión ANX7 inducida de vesículas de fosfolípidos; Sin embargo, los datos actuales sugieren que el complejo BART-ANX7 reduce la actividad PKCa. El derribo endógena BART y ANX7 aumenta la actividad de PKCa, y los inhibidores específicos de PKCa abroga significativamente la invasividad inducida por BART y desmontables ANX7. Estos resultados implican que el BART contribuye a la regulación de la actividad PKCa mediante la unión a ANX7, lo que afecta la invasividad de las células de cáncer de páncreas. Por lo tanto, es posible que BART y ANX7 pueden regular distintamente la señalización aguas abajo de PKCa que es potencialmente relevantes para la invasión de células actuando como moléculas anti-invasivos
Visto:. Taniuchi K, Yokotani K, Saibara T (2012 ) de BART inhibe el cáncer de páncreas invasión celular por PKCa inactivación mediante la unión a ANX7. PLoS ONE 7 (4): e35674. doi: 10.1371 /journal.pone.0035674
Editor: H. Fazlul Sarkar, Wayne Facultad de Medicina de la Universidad del Estado, Estados Unidos de América
Recibido: 29 Enero, 2012; Aceptado: March 19, 2012; Publicado: 19 Abril 2012
Derechos de Autor © 2012 Taniuchi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una subvención-en-Ayudas del Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar de Japón. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El aglutinante de Arl dos (BART) molécula es una proteína soluble de 19 kDa purificada originalmente de cerebro bovino y se identificó como una pareja de unión de ADP-ribosilación similar al factor de 2 (Arl2) [1]. La unión de BART hasta Arl2 es de alta afinidad y depende de la unión de GTP a Arl2 [1]. funciones distintas se han deducido a partir de los hallazgos de que las ARL carecen de las actividades bioquímicas o genéticas características de los factores de ADP ribosilación (FIA), a pesar de la identidad de la secuencia de aminoácidos del 40% al 60% entre la FIA y las ARL [2]. Arl2 ha sido implicado como un regulador de la dinámica de los microtúbulos y [3] plegable, pero su función sigue siendo en gran medida desconocido. Hemos informado anteriormente de que la regulación de la modificación post-transcripcional de BART
a través de la unión a
G3BP en gránulos de estrés intracelular de CD24 contribuye a la inhibición de la invasión y metástasis de las células pancreáticas adenocarcinoma ductal (PDAC) [4]. G3BP N-terminal contribuye a la regulación post-transcripcional de BART de [5]. El estudio adicional demostró que el BART disminuye invasividad de las células PDAC mediante la inhibición de la disminución Arl2 mediada en la actividad de la proteína Rho GTPasa RhoA [6]. Estos datos sugieren que el BART juega un papel en la inhibición de la invasividad PDAC.
ANX7 es un miembro de la familia de anexina de proteínas y códigos de unión a fosfolípidos dependientes de calcio para un Ca
2 + GTPasa, activado.
ANX7 gratis (+/-) ratones knockout tienen Ca
2 + defectos secretoras endocrinas dependientes [7]. ANX7 se fosforila por la PKC, lo que mejora significativamente la unión de ANX7 a vesículas de fosfolípidos fusionados en las células cromafines [8]. Activado PKC inducen la secreción de MMP-9, conducen a la activación de MMP-2, regular a la baja TIMP-1 y TIMP-2 secreción, y aumentar MT1-MMP en la superficie celular [9]. Por lo tanto, ANX7 puede ser uno de los factores asociados con la cascada de la secreción dependiente de PKC. Además, ANX7 es un gen supresor de tumor recién descrito para el cáncer de próstata, como lo demuestra la pérdida de heterozigosidad y redujo la expresión de proteínas ANX7 en una gran fracción de tumores metastásicos archivados [10]. ANX7 exhibe muchas propiedades biológicas y genéticas de un gen supresor de tumores y también está implicada en la carcinogénesis a través de las vías de señalización discretas que implican otros supresores de tumor, de reparación del ADN y los genes relacionados con la apoptosis [10], [11]. Estos informes han sugerido que ANX7 desempeña varias funciones diferentes implicadas en la exocitosis, la supresión de tumores y la carcinogénesis.
PKC es una familia de serina /treonina quinasas involucradas en la transducción de señales, incluyendo la señal de Ras, para la proliferación celular y la diferenciación [12], [13]. La familia PKC consiste en al menos 12 isoformas con diferentes patrones de expresión tisular, especificidades de sustrato y localizaciones subcelulares que están relacionados con las funciones celulares especializadas, incluyendo la proliferación celular, la diferenciación y la apoptosis [14]. Las PKC "clásicos" (α, β1, β2, y gamma) ésteres de forbol se unen y son Ca
2 + dependientes. Los "nuevos" (PKC δ, ε, η, y θ) no dependen de Ca
2 +, pero no obligar a los ésteres de forbol. La tercera subfamilia comprende las PKC atípicas '' (ξ, ι, λ y μ), que no se unen a cualquiera Ca
2 + o éster de forbol [14], [15]. receptores de superficie celular activados de forma constitutiva, tales como el receptor de EGF o el receptor de PDGF [16], o Ras [17], causa la hiperactivación de la PKC, así como la cascada de mitogen-activated proteína quinasa (MAPK). La sobreexpresión de PKC induce un fenotipo celular de cáncer de páncreas más maligno
in vivo
, a través de la modulación de la proliferación celular y la supervivencia [18]. Otro estudio demostró que la PKC activada induce la formación de lamelipodios y posterior aumento de la actividad migratoria de los fibroblastos subconjuntivales [19]. Por lo tanto, se ha sugerido que PKC inducen la proliferación de células /supervivencia, la invasión y la metástasis
.
En este estudio, ANX7 fue identificado como una pareja de unión novela de BART de, y Bart se encuentra asociado con ANX7-PKC la formación de complejos en las células PDAC. Por otra parte, los resultados actuales demuestran que la anulación de la invasión de células de BART induce mediante el aumento de la actividad PKCa a través de la pérdida de la formación de complejos ANX7-PKCa. Por lo tanto, la disminución de PKCa activa
a través de
tanto BART y ANX7 contribuye a la inhibición de la invasividad PDAC.
Resultados
de BART se une a las células ANX7 en PDAC
de BART aumenta desmontables invasión retroperitoneal y metástasis de células de hígado PDAC en un modelo de xenoinjerto ortotópico, tal como se describe en un informe anterior [4]. Para investigar el mecanismo por el cual el BART suprime la invasividad y la metástasis, inmunoprecipitación (IP) los experimentos se realizaron en la línea celular humana PDAC S2-013 utilizando un anticuerpo específico para el BART, para detectar complejos de de BART con otras proteínas. S2-013 es una sublínea clonado de una línea celular PDAC (SUIT-2) derivada de una metástasis hepática [20], y se obtuvo del Dr. T. Iwamura (Miyazaki Medical College, Miyazaki, Japón). fracciones inmunoprecipitadas de plata-manchado separadas en geles de SDS-PAGE reveló una banda de 50 kDa que no se observó en los inmunoprecipitados de control de isotipo (flecha en la Fig. 1A). La banda se escindió y se analizó por Q-TOF-MS después de la digestión con tripsina en gel, y se identificó como ANX7. La cobertura de la secuencia del péptido fue del 15% (Fig. 1B). Esta unión de ANX7 BART específica se demostró por co-IP de S2-013 células (Fig. 1C) y colocalización subcelular se analizó por inmunotinción de S2-013 células (Fig. 1D). BART y ANX7 coimmunoprecipitated y se colocalized en el citoplasma. Es de destacar que BART y ANX7 acumulado en lamellipodial protuberancias similares que son esenciales para la migración celular (flechas en la Fig. 1E).
A. Los inmunoprecipitados de S2-013 células usando IgG de conejo normal (control) y anticuerpo anti-de BART se examinaron por análisis de tinción de plata. Q-TOF-MS análisis investigó una banda prominente en el BART inmunoprecipitados (flecha). B. Porcentaje de cobertura ANX7 está representada por los péptidos identificados en la secuencia de la proteína total (número de acceso NM_004034). C. inmunoprecipitaron endógeno de BART o ANX7 de S2-013 se examinaron mediante transferencia Western utilizando anticuerpos anti-anti-ANX7 BART y. Normal de conejo o IgG de ratón se usó como un control de isotipo para BART y ANX7, respectivamente. D. inmunocitoquímica tinción de células S2-013 utilizando anti-de BART (verde) y anti-ANX7 (rojo) anticuerpos. Azul, tinción con DAPI. Bar, 10 micras. E. Las flechas indican que el BART (verde) y ANX7 (rojo) colocalize en lamellipodial protuberancias similares a las células de S2-013. Azul, tinción con DAPI. Bar, 10 micras.
inhibe la invasión de células ANX7 PDAC
Anteriormente, se generaron clones de células en las que el BART fue suprimida por establemente basado en vectores específicos horquilla corta de ARN interferente pequeño (siRNA) en S2-013 células que anteriormente expresan altos niveles de BART de [4]. Para determinar la función de los complejos de BART-ANX7, un ensayo de inmunotinción de curación de heridas se utiliza para observar la localización de BART y ANX7 en las células que migran polarizadas (Fig. 2A). Tanto BART y ANX7 fueron reclutados a los bordes de ataque durante la cicatrización de heridas del control S2-013 células (flechas en la Fig. 2A). El agotamiento de BART de inhibió la acumulación ANX7 en los bordes de ataque (paneles inferiores en la Fig. 2A). Combinado con el resultado de la Fig. 1E, estos resultados indican que BART y ANX7 interdependiente localizan en los bordes de ataque y en los salientes lamellipodial-como asociadas con la migración celular.
A. control mezclado negativo (SCR-1) y Bart RNAi (SIBART-1) fueron heridos S2-013 células en cultivos confluentes. Después de 4 h, las células fueron immunostained utilizando anticuerpos anti-de BART (verde) y anti-ANX7 (rojo) anticuerpos. Azul, tinción con DAPI. Flechas, colocalized BART y ANX7 en el borde delantero de las células control. Bares, 10 m. B. oligonucleótidos siRNA dirigidos ANX7 (siANX7) y control negativo revueltos fueron transfectadas transitoriamente en células S2-013 y PANC-1. Western Blot validado knockdown ANX7 en ambas líneas celulares. C. Transwell ensayo de la motilidad de las células tratadas como en (B). Se contaron las células que migraron en cuatro campos por grupo. Los datos son representativos de tres experimentos independientes.
Columnas
, media;
bares, Dakota del Sur. *
p Hotel & lt; 0,005 en comparación con las células control. D. Cuantificación de la invasión de ensayo de dos cámaras de las células tratadas como en (B). Se contaron las células invadidas en cuatro campos por grupo. Los datos son representativos de tres experimentos independientes.
Columnas
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bares, Dakota del Sur. *
p
. & Lt; 0,001 en comparación con las células control
in vitro
ensayos se utilizaron para examinar los efectos de ANX7 sobre la motilidad celular y la invasión. Como se muestra por análisis de transferencia Western, la expresión ANX7 se redujo notablemente en S2-013 y una línea celular PDAC, PANC-1, 72 h después de la transfección con los oligonucleótidos de ARNsi ANX7 de segmentación, en contraste con las células transfectadas con siRNA-oligonucleótidos revueltos (Fig . 2B). Supresión de la motilidad ANX7 mejorada en transwell ensayos de movilidad de S2-013 y PANC-1 en comparación con las células control (Fig. 2C). En los ensayos de invasión de dos cámaras, las células ANX7 RNAi fueron significativamente más invasivo que el S2-013 control y células PANC-1 (Fig. 2D). Estos resultados sugieren un papel importante para la unión de BART y ANX7 en la inhibición de la migración celular.
La unión de ANX7 y PKC fosforilada se asocia con la inhibición de la invasividad de las células PDAC
Co-IP de la ANX7 y complejo PKC se ha realizado mediante anti-ANX7 o anticuerpo anti-PKC (10800) reaccionar con la PKCa, ß1, ß2, delta, isoformas varepsilon y eta en S2-013 células. La inmunotransferencia de los inmunoprecipitados reveló que ANX7 co-inmunoprecipitado con PKC (Fig. 3A). PKC expresión no era muy alta, pero había cantidades significativas en los complejos ANX7-inmunoprecipitaron sin secretagogos de PKC. Los efectos de derribar ANX7 en la regulación de la actividad de PKC se investigaron mediante transferencia Western utilizando un anticuerpo anti-fosfo-PKC (9379), que detecta las PKC clásicas (α, β1, β2 y γ) y nuevos PKC (δ, ε, η y θ) cuando está fosforilada en un residuo homóloga a Thr514 de PKCγ (Fig. 3B). ANX7 caída inducida por fosforilación de la PKC en S2-013 células, lo que indica que ANX7 juega un papel en la disminución de PKC fosforilada. Para investigar la colocalización subcelular de ANX7 y PKC fosforilada, se immunostained células S2-013. ANX7 y PKC fosforilada se colocalized en lamellipodial protuberancias similares (flechas en la Fig. 3C). Curiosamente, ANX7 y PKC fosforilada fueron reclutados y colocalized a los bordes de ataque durante la cicatrización de heridas de S2-013 células (flechas en la Fig. 3D), lo que indica que la PKC fosforilada se asocia con la función de anti-invasivo de ANX7. Desde ANX7 podría funcionar en la disminución de la actividad de PKC (Fig. 3B), es probable que esté asociado con disminución de la actividad de las isoformas de PKC clásicas específicos o novedosos inhibición ANX7 dependientes de la invasión de células. Por lo tanto, experimentos adicionales para el análisis de la inhibición asociada a BART-ANX7 de la invasión de células se centraron en las isoformas de PKC clásicas y novedosas a la que hace reaccionar el anticuerpo anti-fosfo-PKC (9379).
A. La inmunoprecipitación de ANX7 endógeno o PKC de S2-013 células. Los inmunoprecipitados se analizaron mediante transferencia Western utilizando anti-ANX7 y los anticuerpos anti-PKC. De ratón normal o IgG de conejo se utilizó como control de isotipo para ANX7 o PKC, respectivamente. blot B. Western con anticuerpos anti-fosfo-PKC muestran S2-013 células transfectadas transitoriamente con siRNA para ANX7 anti-PKC y, en comparación con las células transfectadas con control mezclado. C. tinción inmunocitoquímica en células S2-013, tal como se determina con anti-ANX7 (verde) y anticuerpos anti-fosfo-PKC (rojo). Azul, tinción con DAPI. Flechas, colocalized ANX7 y PKC fosforilada en lamellipodial protuberancias parecidas. Bar, 10 micras. resultaron heridos células confluentes D. S2-013. Después de 4 h, las células fueron immunostained utilizando anticuerpos anti-ANX7 (verde) y anticuerpos anti-fosfo-PKC (rojo). Azul, tinción con DAPI. Flechas, colocalized ANX7 y PKC fosforilada en el borde delantero. Bar, 10 micras.
Fosforilados PKC induce la invasión de células de las células PDAC
Un estimulador de la PKC, forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) es un promotor potente del tumor [21] que induce la migración de los fibroblastos subconjuntivales [19] y células de glioblastoma [9]. PMA interactúa con y activa las dos isoformas de PKC clásicas y novedosas [21]. Por lo tanto, se investigó el efecto de PMA en la invasión de células de S2-013 y PANC-1. Inmunotransferencia usando anticuerpos anti-fosfo PKC (9379) reveló que el tratamiento con PMA aumentó PKC activos (Fig. 4A). PMA estimuló significativamente la invasión de células de S2-013 y PANC-1 en
in vitro
ensayos de invasión (Fig. 4B), lo que indica que las isoformas de PKC PMA-sensibles contribuyen a la invasividad de las células PDAC. Para confirmar que la invasión inducida por PMA fue dependiente de PKC activos, las células se trataron inicialmente con un inhibidor de PKC (calfostina C, un inhibidor de ambos PKC clásicas y nuevos) y después se trataron con PMA. El tratamiento inicial con el inhibidor de PKC impidió el aumento inducido por PMA en la actividad PKC (Fig. 4A) y se inhibe la invasión de células mediada por PMA de S2-013 y PANC-1 (Fig. 4B). Estos resultados indican que las isoformas específicas de PKC clásicas y novedosas podrían inducir la invasión de células PDAC.
A. S2-013 y células Panc-1 pretratadas con o sin calfostina C se trataron con PMA, y la actividad PKC se evaluó por transferencia Western con un anticuerpo anti-fosfo-PKC. células B. S2-013 y PANC-1 tratadas como en (A) se sembraron en cámaras de invasión de Matrigel. Se contaron las células invadidas en cuatro campos por grupo. Los datos son representativos de tres experimentos independientes.
Columnas
, media;
bares, Dakota del Sur. *
p Hotel & lt; 0,001; **
p
& lt; 0,003 en comparación con células no tratadas de control. células C. S2-013 se trataron con o sin PMA y tinción inmunocitoquímica se llevó a cabo utilizando anti-E-cadherina y anticuerpos anti-beta-catenina (verde). Azul, tinción DAPI; bares, 10 micras.
la adhesión célula-célula también puede influir en la motilidad [22]. Tras la formación de contactos célula-célula, las células reducen su actividad tasa de migración y de la superficie celular saliente, y disminuyen sus microtúbulos y la actina de filamentos dinámica [23]. Para determinar el efecto de las PKC clásicas y novedosas en contacto célula-célula, S2-013 células se incubaron con PMA e inmunofluorescencia se realizó con anti-E-cadherina y anticuerpos anti-β-catenina (Fig. 4C). PMA redujo significativamente las proteínas de unión a regiones de contacto célula-célula, indican una disminución en la localización periférica de las proteínas de unión, resultando en uniones de adherencia con una disminución de la estabilidad. Estos resultados sugieren que PKC PMA-sensibles juegan un papel en la disminución de la estabilidad de los contactos célula-célula y, a su vez, la inducción de la invasión de células.
de BART apoya la unión de ANX7 para PKC y funciones activas en la disminución de PKC activa
para determinar el efecto de los complejos BART-ANX7 en la regulación de la actividad de la PKC, se investigaron los efectos de la caída de BART sobre la afinidad ANX7 de PKC constitutivamente activados mediante tratamiento con PMA (Fig. 5A). la estimulación con PMA causó un aumento significativo en la cantidad de complejos ANX7-PKC en células de control, mientras que no hubo diferencias en las células de BART RNAi S2-013. Por otra parte, si la unión puede ser inhibida por los inhibidores de PKC antes de la estimulación de las células de control con PMA se evaluó. Calfostina C y cloruro de queleritrina (un inhibidor de la PKCa, β, γ y δ) marcadamente disminuido interacción ANX7-PKC en células de control estimuladas con PMA (Fig. 5A). Además, BART inmunoprecipitó con el aumento de cantidades de ANX7 cuando S2-013 células se trataron con PMA, y la preincubación con calfostina C inhibió el aumento en la unión (Fig. 5B). Se realizó un análisis inmunocitoquímico para examinar la localización intracelular de complejos ANX7-PKC inducida por PMA en el control y las células de BART RNAi S2-013 (Fig. 5C). ANX7 colocalized con PKC estimuladas por PMA en células de control (flechas en la figura 5C.); Sin embargo, BART caída impidió la unión de PKC ANX7 y estimuladas con PMA (puntas de flecha en la Fig. 5C). Además, los experimentos IP utilizando anticuerpos anti-PKC fosforilada (9379) confirmaron que la anulación de BART de inhibió la unión de ANX7 y PKC fosforilada (Fig. 5D, E).
A. La inmunoprecipitación de PKC de control y las células de BART RNAi S2-013 estimulada por PMA con o sin tratamiento previo de cloruro de calfostina C o queleritrina se examinó mediante transferencia Western utilizando anti-ANX7 y los anticuerpos anti-PKC. *, ANX7 con PKC co-inmunoprecipitado en las células de BART RNAi S2-013. B. La inmunoprecipitación de BART desde S2-013 células tratadas como en (A) se examinó por transferencia de Western usando anti-ANX7 y anticuerpos anti-BART. C. inmunocitoquímica tinción de control (paneles superiores) y Bart RNAi (paneles inferiores) S2-013 células estimuladas por PMA utilizando anti-PKC (verde) y anti-ANX7 anticuerpos (rojo). Azul, tinción con DAPI. Flechas, ANX7 colocalized con PKC PMA-sensibles en las células de control; puntas de flecha, PKC PMA-sensibles no colocalized con ANX7 en las células de BART RNAi. Bares, 10 m. D. La inmunoprecipitación de PKC fosforilada de control y las células de BART RNAi S2-013 se examinó mediante transferencia Western utilizando anti-ANX7 y los anticuerpos anti-fosfo-PKC. E. Análisis densitométrico de los resultados de la Figura 5D. El nivel de ANX7 en los precipitados se evaluó después de la normalización de las señales ANX7 a las señales de fosfo-PKC de lisados celulares. blot F. Western con anticuerpos anti-BART y anti-fosfo-PKC muestran dos S2-013 clones transfectadas con siRNA para el BART (SIBART-1 y 2) en comparación con el control simulado (Neo-1) y revueltos (Scr-1) clones.
células de BART RNAi S2-013 tenían niveles elevados de PKC activos y niveles de estado estacionario sin cambios de PKC (Fig. 5F). Este resultado indica que el BART puede estar asociada con niveles disminuidos de PKC activa. Nuestra hipótesis es que el BART regula las interacciones entre ANX7 y formas activas de PKC como objetivo una molécula de andamio y /o una proteína de carga de ANX7, permite ANX7 para disminuir la actividad de PKC de destino y, a su vez, inhibe la invasión celular.
PKC la actividad no está regulada directamente por ANX7
Para investigar el papel de la PKC en la regulación de la fosforilación de ANX7, como se informó anteriormente en las células cromafines [8], las células S2-013 y PANC-1 fueron metabólicamente marcadas con [
32P] -orthophosphoric ácido, y después se estimularon con PMA. El-ANX7 marcado radiactivamente se inmunoprecipitó con anticuerpo monoclonal anti-ANX7 y se analizó mediante formación de imágenes de fósforo (Fig. 6A). Si ANX7 es un sustrato de PKC específicos, el nivel de fosforilación ANX7 deberían provocar un incremento significativamente los cambios en respuesta a PMA. Sin embargo, la estimulación con PMA no aumentó los niveles de fosforilación ANX7 en cualquier línea celular. A continuación,
in vitro
se utilizaron ensayos de fosforilación para determinar si la actividad de la PKC fue regulada directamente por ANX7 (Fig. 6B). cerebro purificada de rata, con una pureza de & gt; 95% y que contiene isoformas de PKC clásicas y novedosas, se incubó con proteína recombinante ANX7 con o sin proteína de BART recombinante. ANX7 no cambió la actividad de la PKC y la adición de proteína de BART no se asoció con la regulación de la actividad de PKC. Estos resultados sugieren que ANX7 no es un sustrato de la PKC, y que ANX7 no cambia los niveles de fosforilación de la PKC objetivo directamente.
A. S2-013 y células PANC-1 se premarcan con ácido -orthophosphoric [
32P] y se estimularon con PMA o no. ANX7 se inmunoprecipitó, separados por SDS-PAGE, y se analizaron por autorradiografía. Una inmunotransferencia se realizó en el lisado celular como control de carga. B.
in vitro
ensayos de fosforilación para investigar el efecto de BART y ANX7 de PKC-fosforilación. cerebro de rata purificada se incubó con ANX7 recombinante con o sin el BART recombinante. Los productos de reacción se analizaron mediante un ensayo ELISA. ABS en
Y
eje y medios de absorbancia a 492 nm como referencia, medida con un lector de microplacas.
PKCa se asocia con complejos BART-ANX7
Para identificar específica isoformas de PKC que se unen a ANX7 en este sistema, un perfil de expresión precisa de PKC clásicas y novedosas se generaron por transferencia de Western usando anticuerpos individuales anti-fosfo-PKC en células de BART RNAi derivados de S2-013 (Fig. 7A). Dado que los niveles de fosforilación de PKC de destino se incrementaron en las células de BART de RNAi (Fig. 5F), upregulated fosfo-PKC en células de BART RNAi se seleccionaron para su posterior análisis. Entre estos, PKCa se activó de manera significativa por el BART caída en S2-013. Además, PKCa era abundantemente fosforilada en células ANX7 RNAi de S2-013 y PANC-1 (Fig. 7B). A continuación, la unión de ANX7 con PKCa fosforilada fue demostrado por inmunoprecipitación y análisis de transferencia de Western en S2-013 células (Fig. 8A). Fosfo-PKCη no se inmunoprecipitó con ANX7. Para investigar la colocalización subcelular de PKCa fosforilada, se immunostained células S2-013. Fosforilada PKCa se localizó en lamellipodial protuberancias similares (flechas en la Fig. 8B). Además, ANX7 y PKCa fosforilados fueron reclutados a los bordes de ataque durante la cicatrización de heridas del control S2-013 células (paneles superiores en la Fig. 8C). El agotamiento de BART de no indujo acumulación de ANX7 en los bordes de ataque y posterior colocalización con PKCa fosforilada (paneles inferiores de la Fig. 8C). Estos resultados indican que PKCa se asocia de manera interdependiente con BART y ANX7 en la modulación de la migración celular PDAC.
A. Western blot con anticuerpos contra las isoformas de PKC clásicas y novedosas que muestran dos S2-013 clones transfectadas con siRNA para el BART en comparación con el simulacro y revueltos control de los clones. B. oligonucleótidos siRNA dirigidos ANX7 y el control negativo revueltos fueron transfectadas transitoriamente en S2-013 y las células PANC-1. Se realizó Western blot con anticuerpos contra las isoformas de PKC clásicas y novedosas.
A. La inmunoprecipitación de ANX7 (a la izquierda paneles) o fosfo-PKCa (paneles de la derecha) a partir de células S2-013 fue examinado por Western Blot utilizando anticuerpos contra ANX7, fosfo-PKCa y fosfo-PKCη. B. inmunocitoquímica tinción en S2-013 células, como se determina con el anticuerpo anti-fosfo-PKC (verde). Azul, tinción con DAPI. Flechas, PKC fosforilada en lamellipodial protuberancias similares. Bar, 10 micras. resultaron heridos culturas C. confluentes de células de control y de BART RNAi S2-013. Después de 4 h, las células fueron immunostained utilizando anticuerpos anti-ANX7 (verde) y anticuerpos anti-fosfo-PKCa (rojo). Azul, tinción con DAPI. Bares, 10 micras.
Los inhibidores específicos de PKCa inhiben aumento de la migración celular por desmontables de BART y ANX7
Para examinar si la señalización PKCa está involucrado en una mayor migración de BART o por caída en ANX7 S2-013, un inhibidor /β1 PKCa Ro-32-0432 y un inhibidor específico safingol PKCa se aplicaron en
in vitro
ensayos de invasión en. Como se muestra en la Fig. 9A y 9B, fosforilada PKCa se redujo específicamente por Ro-32-0432 y safingol tratamiento, pero las expresiones de fosfo-PKCη no se cambió. La mayor migración de células S2-013 se produjo después de eliminar a de BART o ANX7; Sin embargo, el aumento de la migración fue inhibida por la preincubación con Ro-32-0432 (Fig. 9C) y safingol (Fig. 9D). Aumento de la capacidad de invasión por el BART o knockdown ANX7 no fue impedida por la preincubación con un inhibidor de myristoylated pseudosustrato PKCη (Fig 9E.) Y un inhibidor de PKC (rottlerin; datos no mostrados). Estos resultados sugieren que se requiere la activación de PKCa para la migración celular inducida por PDAC de BART o desmontables ANX7.
A. células de BART RNAi S2-013 y S2-013 células transitoriamente transfectadas con siRNA-ANX7 fueron pretratadas con o sin transbordo 32-0432. La actividad de PKCa y η se evaluó por transferencia Western. B. Las células que se muestran en (A) se trataron previamente con o sin safingol. La actividad de PKCa y PKCη se evaluó por transferencia Western. C. El efecto de Ro-32-0432 sobre la invasión celular se investigó mediante el ensayo Transwell invasión. Se contaron las células que migraron en cuatro campos por grupo. Los datos son representativos de tres experimentos independientes.
Columnas
, media;
bares, Dakota del Sur. *
p Hotel & lt; 0,001 en comparación con las células no tratadas. D. El efecto de safingol en la invasión de células se investigó mediante el ensayo transwell invasión. Los datos son representativos de tres experimentos independientes.
Columnas
, media;
bares, Dakota del Sur. *
p Hotel & lt; 0,001; **
p
& lt; 0,003 en comparación con las células no tratadas. E. El efecto de rottlerin y pseudosustrato PKCη inhibidor de la invasión de células se investigó mediante el ensayo Transwell invasión. Los datos son representativos de tres experimentos independientes.
Columnas
, media;
bares, Dakota del Sur.
Discusión
PDAC es uno de los cánceres más mortales debido a su capacidad de invadir los tejidos circundantes y ampliamente metástasis en una etapa temprana [24 ]. Extensa infiltración local y la metástasis son las principales causas de muerte en PDAC [25]. A la luz del papel de BART de inhibir la invasión celular PDAC, este estudio fue diseñado para identificar proteínas asociadas con la invasión de células PDAC unión de BART. Las características más destacadas de este informe son los siguientes:.
BART y ANX7 puede funcionar juntos en el complejo para inhibir la migración de células
BART y ANX7 puede inhibir la invasión celular por la disminución de la PKC activa en bordes de ataque.
Fosforilados PKCa es responsable de la mayor capacidad de invasión de las células PDAC visto con Bart o desmontables ANX7. PKCa se asocia de manera interdependiente con BART y ANX7 en la modulación de la invasividad de las células PDAC.
No se observó pérdida frecuente de la expresión ANX7 en cáncer de próstata, especialmente en la metástasis y la recurrencia local de la enfermedad refractaria hormonal [7]. Considerando nula
ANX7
- /- ratones mueren durante la embriogénesis, los ratones heterocigotos ANX7 (
ANX7
+/-) desarrollar, madurar y la edad normal, y más interesante, tener un fenotipo propensa al cáncer [10]. Una amplia gama de tumores espontáneos se han detectado en
ANX7
+/- ratones, incluyendo en el hígado, próstata, endometrio, glándula salival, y el timo [11]. En el ratón, la haploinsuficiencia de expresión ANX7 parece conducir la progresión a cáncer debido a la inestabilidad genómica a través de una vía de señalización discreta participación de otros genes supresores de tumores, genes de reparación del ADN, y los genes relacionados con la apoptosis. Nuestros datos sugieren que BART y ANX7 juegan un papel en la disminución del nivel de fosforilación de PKCa en células PDAC.
in vitro
experimentos fracasaron en demostrar que la disminución de ANX7 directamente la actividad de la PKC (figura 6B.); sin embargo, la Fig. 6A muestra definitivamente que ANX7 no era un sustrato para la PKC en células PDAC. Aunque el mecanismo por el cual ANX7 regula la actividad de PKC sigue siendo desconocida, es notable que BART y ANX7 podrían funcionar juntos para disminuir la actividad de la isoforma PKCa y, a su vez, suprimir invasividad de las células PDAC. Esta evaluación habilitado estudio de una vía de señalización celular regulada por la
ANX7
gen supresor tumoral en el PDAC. Se necesitan más estudios para determinar cual las moléculas de suprimir directamente PKCa, y para identificar sustratos precisas de PKCa, con el fin de comprender los mecanismos implicados en la inhibición mediada por BART-ANX7 de la invasión celular.
El papel de PKCa en PDAC la migración de células no ha sido ampliamente estudiado. Varias líneas de evidencia indican que PKCa juega un papel crítico en la proliferación celular /migración /invasión, incluyendo el cáncer humano pobremente diferenciado hepática [26], cáncer de endometrio [27] y el cáncer gástrico [28]. vías de participación de la familia PKC señalización celular se inició mediante la unión de un ligando, tal como un factor de crecimiento, a su respectivo receptor de la superficie celular, lo que desencadena la descomposición de fosfolípidos por fosfolipasas C y D y producción de diacilglicerol (DAG). DAG se une y activa la mayoría de las isoformas de PKC, que luego se translocan a compartimentos subcelulares específicos que varían dependiendo de la isoforma PKC y tipo de pila. En última instancia, MAPKs, incluyendo la proteína quinasa extracelular de señal regulada (ERK), c-jun N-terminal quinasa (JNK), y p38MAPK, juegan un papel crucial en la migración celular mediada por PKC activadas por PMA [19], [29 ]. Eso BART y ANX7 abrogan la fosforilación de ERK en células PDAC se ha demostrado (datos no presentados), lo que sugiere que PKCa puede estar asociada con la modulación de la actividad de ERK posiblemente asociado con la inhibición relacionado BART-ANX7-de invasividad. Además, es posible que la exocitosis inducida por PKCa modula la migración celular.