Extracto
factor inducible por hipoxia-2α (HIF-2α, o EPAS1) es importante para la progresión del cáncer, y es un biomarcador putativo de mal pronóstico para el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen a la sobreexpresión EPAS1 no se conoce bien todavía. Exploramos un papel de un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP), rs13419896 situado dentro del intrón 1 de la
EPAS1
gen en la regulación de su expresión. Los análisis bioinformático supone que la región que incluye el SNP rs13419896 juega un papel en la regulación de la
EPAS1
la expresión génica y el SNP altera la actividad de unión de factores de transcripción.
in vitro
análisis demostró que un fragmento que contiene la función locus SNP como una región reguladora y que un fragmento con
Un alelo
mostraron una mayor actividad de transactivación de uno con
G
, especialmente en presencia de sobreexpresa c-Fos o c-jun. Por otra parte, los pacientes con CPNM con el
Un alelo
mostraron peor pronóstico que aquellos con
G
en el SNP incluso después del ajuste con diversas variables. En conclusión, el polimorfismo genético de la
EPAS1
gen puede conducir a una variación de sus niveles de expresión génica para conducir la progresión del cáncer y servir como un marcador pronóstico de NSCLC
Visto:. Putra AC , Eguchi H, Lee KL, Yamane Y, Gustine E, Isobe T, et al. (2015) El
Un
alelo en rs13419896 de
EPAS1
se asocia con mayor expresión y de mal pronóstico para los de células no pequeñas cáncer de pulmón. PLoS ONE 10 (8): e0134496. doi: 10.1371 /journal.pone.0134496
Editor: Tiffany Seagroves, Universidad de Tennessee Health Science Center, Estados Unidos |
Recibido: April 2, 2015; Aceptado: 9 Julio 2015; Publicado: 11 Agosto 2015
Derechos de Autor © 2015 Putra et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por la subvención-en-Ayudas a la Investigación Científica (C) (Nº 23.592.766) de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSP ), de Grants-en-Ayudas a la Investigación Científica en áreas innovadoras "(Nº 221S0001)" de Ministerio japonés de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología, y el Proyecto de Grant-aided Fundación para la Investigación estratégica de Universidades privadas, MEXT. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
factores inducible por hipoxia (HIF) son factores de transcripción heterodiméricos que son miembros de la familia Per-ARNT-Sim (PAS). Se activan por un número de entradas de señalización, incluyendo la hipoxia, el hambre de nutrientes, la inflamación, las señales oncogénicas, la tensión mecánica, y en algunos casos, los polimorfismos genéticos internos [1-4]. Los factores de HIF de transcripción se componen de subunidades alfa (HIF-1a, HIF-2α, HIF-3α) que están regulados por las señales antes mencionadas, mientras que las subunidades beta conocen como receptor de aril hidrocarburos translocador nuclear (ARNT) se expresan de forma constitutiva y estimulan la transcripción de más de un centenar de genes diana relacionados con la respuesta patofisiológica [5, 6]. Entre subunidades alfa, HIF-1α y HIF-2α han sido ampliamente estudiados. Aunque los miembros de las subunidades alfa comparten similitudes en su estructura, función y regulación
in vitro
, sus roles
in vivo
son dispares durante el desarrollo y la tumorigénesis [3, 5, 7].
El gen HIF-2α humana conocida como proteína de dominio PAS endotelial 1 (
EPAS1
), contiene 16 exones y abarca 90 kb en 2p21-p16. La expresión de HIF-2α humano se ha identificado en pulmón, cuerpos carotídeos, células endoteliales, células gliales, cardiomiocitos, fibroblastos renales y hepatocitos donde juega un papel importante en la regulación de la fisiología de oxígeno [3, 8]. Esto es de particular importancia en el pulmón, ya que constituye el sitio para el intercambio de oxígeno y proporciona la interfaz aire-líquido para este propósito. proteínas HIF-2α se expresan en los neumocitos tipo II y las células endoteliales pulmonares en respuesta a la hipoxia, así como en las estructuras epiteliales y mesenquimales que dan lugar al endotelio vascular [9, 10]. Además, los altos niveles de expresión de HIF-2α estaban relacionados con el aumento del tamaño tumoral, la invasión y la angiogénesis en modelos murinos de cáncer de pulmón [11,12]. Aumento de expresión de la proteína HIF-2α en el tejido de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) se informó de que un fabricante importante de mal pronóstico [13-15].
Recientemente, se ha informado de que varios de un solo nucleótido polimorfismos (SNPs) de
EPAS1
están asociados con el desarrollo de la osteoartritis [16], retinopatía del prematuro [17], el máximo rendimiento metabólico en los deportistas de élite de resistencia [18] y la adaptación fisiológica en las poblaciones a gran altitud [19- 22], y la susceptibilidad hacia carcinoma de células renales (RCC) y el cáncer de próstata [23, 24]. Sin embargo, los efectos de estos SNPs en los niveles de expresión de la
EPAS1 ¿Cuáles son escasamente entendido
.
Entre estos SNP, que se centraron en los SNP Hap-etiqueta del gen
EPAS1
que pueden contribuir a la adaptación a la hipoxia de altura en sherpas [22], teniendo en cuenta pulmón como órgano diana. Los análisis bioinformáticos nos llevó a examinar el papel de los SNP rs13419896 en la regulación de la
EPAS1
la expresión génica y una asociación con el pronóstico de NSCLC.
análisis Materiales y Métodos
bioinformático
Hemos interrogado transcripción factor de inmunoprecipitación de cromatina (chIP-seq) conjuntos de datos de la Enciclopedia de Elementos de ADN consorcio (ENCODE) utilizando la Universidad de California, Santa Cruz (UCSC) Genome Browser (http://genome.ucsc.edu /codificación /) para averiguar los factores de transcripción candidato que pueden unirse en o muy cerca al sitio SNP rs13419896. vigilancia específica de alelo de factores de transcripción unidos al fragmento que contiene el rs13419896 SNP se llevó a cabo usando JASPAR NÚCLEO Vertebrata, una base de datos de acceso libre de los perfiles de nucleótidos basada en la matriz que describe la preferencia de unión de factores de transcripción [25].
la extracción de ADN y análisis de genotipado
ADN genómico se aisló de muestras de sangre periférica o los tejidos del pulmón no cancerosas congeladas descritas anteriormente [26, 27]. El siguiente conjunto de cebadores se utilizó para amplificar un fragmento que incluye el enfoque SNP en
EPAS1
intron1; Adelante: 5'-CCTAATGAGCCTCTGGGAAAGTGC-3 'y Reverso: 5'-CAATGGTGCCTCCTACCCTGTG-3'. Las condiciones de reacción de PCR fueron 40 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 30 s, hibridación a 63 ° C durante 30 seg, y extensión a 72 ° C durante 30 seg. La secuenciación de los productos de la PCR se llevó a cabo usando el kit BigDye Terminator Ciclo de Secuenciación y el sistema de secuenciación automática ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.).
Líneas celulares y cultivo celular
Veinte y cuatro líneas celulares de cáncer humano que consta de una células de hepatoma HepG2, líneas de carcinoma de células escamosas orales HSC-2, HSC-3, HSC-4, KB y KOSC2, los cánceres de mama MCF-7, MDA-MB-231, MDA -MB-435S, MDA-MB-453, MDA-MB-468, BT-20, BT-474, SK-BR-3, T-47D, y ZR-75-1 y el cáncer de líneas celulares de pulmón A549, PC- 6, PC-9, PC14, RERF-LC-Ad-1, RERF-LC-Ad-2, RERF-LC-KJ, y LC-S se obtuvieron de ATCC (Manassas, VA) o JCRB (Osaka, Japón) entre 2001 y 2007, y se mantuvieron en RPMI 1640 o medio de Dulbecco modificado de Eagle esencial mínimo (DMEM) (NACALAI TESQUE, Inc., Kyoto, Japón) que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS; Bio Whittaker, Verviers, Bélgica) como se describe anteriormente [28 -30].
EPAS1
estado de las células se determinó por análisis de secuenciación como se describe anteriormente.
preparación de ARN y RT-PCR
El ARN total se preparó a partir de sedimentos celulares congelados utilizando el QIAGEN RNeasy mini kit (QIAGEN, Inc., Valencia, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Dos microgramos de ARN total extraído de cada línea celular fue transcrito de forma inversa utilizando la alta capacidad de cDNA Archivo Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). Una dilución 1/200 del ADNc se sometió a tiempo real RT-PCR utilizando ensayos de expresión génica TaqMan (Applied Biosystems) para
EPAS1 Opiniones y Pre-Desarrollado Reactivos de ensayo TaqMan (Applied Biosystems) para
ACTB
como el control de la limpieza. Tres mediciones independientes se tomaron y se promedian con los niveles de expresión de genes relativos calculados como cocientes más de
ACTB
expresión para cada línea celular.
Análisis de inmunotransferencia
Para analizar la expresión de proteínas, células enteras extractos se preparan a partir de células cultivadas con o sin tratamiento hipóxico como se describe anteriormente [30]. Cincuenta g de proteína se transfirió a filtros de nitrocelulosa después de la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. Anti-EPAS1 (HIF-2α) (Cell Signaling Technology Japón, Tokio) o anti-β-actina (Sigma) se utilizaron como anticuerpos primarios diluidos como 1: 500 o 1: 5000. IgG anti-conejo o anti-Ig de ratón conjugado con peroxidasa de rábano (Amersham Life Science) se utilizó como anticuerpo secundario diluido como 1: 2000 o 1: 5000. Los inmunocomplejos se visualizaron utilizando el reactivo chemiluminiscence ECL Plus (Amersham Life Science).
Construcción de plásmidos y experimentos reportero de luciferasa
fragmentos de oligonucleótidos hibridados que contienen el
EPAS1
SNP rs13419896 locus ( 5'-GGTACCAGTGTCTGAAAGTGAAGCGCTAGGATTGGTTACTGACGGTACC-3 'o 5'-GGTACCAGTGTCTGAAAGTGAAGCACTAGGATTGGTTACTGACGGTACC-3') se subclonaron en el
Kpn I
sitio de pGL4.26 (Promega, Madison, WI) con un promotor mínimo de conducir el reportero de luciferasa de luciérnaga. C /EBP-β o c-MYC cDNA se amplificó a partir de ARN total de células MCF-7 o HSC2 por RT-PCR y se subclonaron en pRc /CMV (Invitrogen, Carlsbad, CA) o pcDNA 3.1 /V5-His-TOPO (Invitrogen ). Las construcciones fueron confirmadas por análisis de secuencia y se designó como pGL4.26-EPAS1_G, pGL4.26-EPAS1_A, pCMV-C /EBP-β, o pcDNA-c-MYC, respectivamente. Rata c-Jun impulsada por el promotor β-actina humana (c-Jun /β-actina) y vectores de expresión de c-fos humanos fueron generosamente proporcionado por el Dr. Masaharu Sakai (Universidad de Hokkaido) [31]. Se llevaron a cabo transfecciones transitorias en el cada constructo indicador pGL4.26-EPAS1 (0,2 g /15 mm también) con Renilla luciferasa de control de co-transfección (pRL-SV40, 100 pg /15-mm pocillo) (Promega) se mezcló con 0,4 l de Trans-IT LT1 reactivo de transfección (Takara, Japón) y se añadió al medio. En experimentos de co-transfección, 0,4 g de pRc /CMV, c-Jun /β-actina, c-Fos, pcDNA-c-myc o pCMV-C /EBP-β se mezcló con los reporteros EPAS1 que el anterior. Las células se incubaron con la mezcla durante 24 h antes de la cuantificación de la actividad de luciferasa en el single-muestra Mini Lumat LB 9505 luminómetro (Berthold Technologies GmbH & amp; Co. KG, Bad Wildbad, Alemania) usando el Dual Luciferase Assay Kit (Promega) .
actividad EPAS1
SNP reportero se calculó como cocientes más de la actividad luciferasa de Renilla y el promedio de tres o más ensayos para cada reportero se utilizó para las comparaciones.
estudios de pacientes
Un total de 76 no pequeñas de pacientes con cáncer de pulmón de células japoneses diagnosticados en el hospital de la Universidad de Hiroshima de 1991 a 1996 [4, 32] se inscribieron en este estudio. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los individuos. Este estudio fue aprobado por la genética institucional y Comité de Ética Médica de la Universidad de Hiroshima. Los pacientes y sus características clínico-patológicas de cáncer de pulmón fueron evaluados de acuerdo con el sistema internacional de estadificación para el cáncer de pulmón [33], y se muestran en la Tabla 1. En pocas palabras, un total de 76 pacientes con cáncer de pulmón, cuya media de edad fue de 65,8 (± 8,2), consistió en 56 varones y 20 mujeres; 43 adenocarcinomas (AD), 29 carcinomas de células escamosas (SCC), y 4 carcinomas de células escamosas (adeno-ADSCC). Distribución de los pacientes con cáncer de pulmón en etapas (31 pacientes se encontraban en estadio I, 7 en II, 25 en la III y IV al 13) está bien adaptado a la ampliamente representativa de la población japonesa cáncer de pulmón.
análisis estadístico
Los resultados primarios de este estudio fueron la mortalidad y el riesgo de muerte específica por cáncer de pulmón. El tiempo de supervivencia se calculó como el tiempo desde la cirugía primaria hasta la muerte por cáncer de pulmón, la censura a la fecha del último contacto o la muerte por cáncer no. Chi-cuadrado o la prueba exacta de Fisher se utilizó para examinar las distribuciones de las variables. Las diferencias en la supervivencia se examinaron mediante la prueba de log-rank. Cox modelo de riesgos proporcionales fue utilizado para estimar el riesgo relativo de muerte y los intervalos de confianza del 95% (IC). Los análisis estadísticos se realizaron utilizando un software estadístico JMP versión 10.0.2 (SAS Institute Inc., Cary, NC, EE.UU.), se especifique lo contrario. Se llevó a cabo extendido la prueba exacta de Fisher usando "R": (. Equipo Central R, R 2013. Fundación para la Computación de Estadística, Viena, Austria URL http://www.R-project.org/) un lenguaje y entorno de computación estadística con un paquete de "moneda". Hardy-Weinberg fue examinado para comparar las frecuencias genotípicas observadas y esperadas utilizando una prueba de Chi-cuadrado. La significación estadística de reportero experimentos y análisis de la expresión génica se analizaron mediante el software estadístico JMP versión 10.0.2 y el software Statview versión 5.0 (SAS Institute Inc.).
Resultados
Base de datos de vigilancia de los SNP de
EPAS1
en relación con su expresión génica
Entre los 3 SNP Hap-tag (rs13419896, rs4953354, rs4953388 y) que estaban implicados para contribuir a la adaptación a la hipoxia de altura en sherpas [22 ], encontramos sitios de unión y actividades de unión para el /EBP β-C, AP-1 o MYC familia de factores de transcripción en varios tipos de células cancerosas en la región de la
EPAS1
rs13419896 locus en el intrón 1 del gen mediante la vigilancia de los conjuntos de datos de chip-ss de la ENCODE (S1 figura). Curiosamente, cuando se analizaron las secuencias utilizando JASPAR Core Vertebrata, encontramos que las puntuaciones relativas, los índices de probabilidad de factor de transcripción de unión, de C /EBP-β y AP-1 se vieron afectados por el rs13419896 SNP entre los 3 factores de transcripción como se mencionó anteriormente ; C /EBP-β y AP-1 mostró mucho más altas puntuaciones de 0.842 y 0.855 en la secuencia con
Un
alelo en rs13419896, respectivamente, que aquellos con
G
alelo (0,734 y 0,744) . Estos datos nos llevó a examinar el papel de rs13419896 en la regulación de la
EPAS1
la expresión génica.
El SNP rs13419896 alteró las actividades de gen indicador
Con el fin de probar funcional posible diferencias causadas por el locus rs13419896, el próximo indicador de luciferasa prepararon constructos que alberga el
EPAS1
fragmento que abarca el locus rs13419896 en frente del promotor mínimo (Fig 1A) y llevaron a cabo los análisis de transfección transitoria en A549, PC-9 y HSC líneas celulares de cáncer de -2. Las construcciones con los fragmentos que contienen el locus rs13419896 mostraron un aumento de las actividades de reportero en comparación con el reportero original de pGL4.26 en todas las líneas celulares ensayadas, independientemente del genotipo del SNP, lo que sugiere que esta corta secuencia dentro del intrón 1 de
EPAS1
función como elemento potenciador de la transcripción (
P Hotel & lt; 0,05, Fig 1B-1D). Curiosamente, la construcción de reporte que contiene el fragmento con el
Un
alelo de rs13419896 (pGL4.26-EPAS1-A) mostró una actividad significativamente mayor que uno con el
G
alelo (pGL4.26- EPAS1-G) en todas las líneas celulares ensayadas (
P
& lt; 0,01,
P
& lt; 0,05, como se muestra en la figura 1B-1D), lo que sugiere que el potenciador de la actividad de este elemento regulador se ve afectada por el genotipo de la rs13419896 SNP.
(A) representación esquemática de constructos de informador de luciferasa con diferentes alelos
EPAS1
SNP como se muestra. fragmentos cortos que contienen el
EPAS1
SNP locus (rs13419896) se subclonaron en el promotor mínimo plásmido informador de luciferasa pGL4.26. (B-D) Los gráficos de barras muestran la actividad de luciferasa después de los experimentos de transfección transitoria en el A549 (B), PC9 (C), y las células HSC-2 (D). reportero de la actividad de luciferasa se calcula como una relación a la actividad de luciferasa de Renilla generada por el control de co-transfección pRL-SV40. Cada valor representa la media + desviación estándar (SD) para al menos tres experimentos independientes.
P
-valores se calcularon utilizando de Student
t-test con
*:
P Hotel & lt; 0,05, **:
P Hotel & lt; 0,01 y ***:
P Hotel & lt; 0,0001.
Desde el rs13419896 SNP estaba implicado para alterar las afinidades de unión de AP-1 y C /EBP-β por el análisis de la bioinformática antes mencionado, el próximo realizado experimentos de co-transfección en células A549 para evaluar la efectos de la sobreexpresión de AP-1, c-myc, o /EBP-beta factores de transcripción C sobre las actividades reportero. Sorprendentemente, la expresión forzada de c-Jun o c-FOS, los componentes del factor de transcripción AP-1, aumentó significativamente la actividad de reportero de sólo el pGL4.26-EPAS1-A pero no el de pGL4.26-EPAS1-G (Fig 2A y 2B). Por otra parte, C /EBP-β aumenta la actividad transcripcional de ambos el reportero construye con una amplitud similar, mientras c-Myc no mostró alteraciones significativas en la actividad de ambas construcciones.
(A y B ) Para evaluar los efectos de la sobreexpresión de AP-1 (c-Jun y c-FOS), MYC, o /EBP-beta de factores de transcripción C en rs13419896 actividad indicador de luciferasa SNP, los experimentos de co-transfección se realizaron en células de adenocarcinoma de pulmón A549. Los gráficos de barras muestran la actividad de luciferasa de pGL4.26-EPAS1-G (A) o pGL4.26-EPAS1-A (B). reportero de la actividad de luciferasa se calcula como una relación a la actividad de luciferasa de Renilla generada por el control de co-transfección pRL-SV40. Cada valor representa la media + desviación estándar (SD) para al menos tres experimentos independientes.
P
-valores se calcularon mediante la prueba de Dunnett con ***:
P Hotel & lt; 0,0001.
Comparación de los niveles de expresión de
EPAS1
ARNm y proteínas en líneas celulares de cáncer por el SNP rs13419896
Con el fin de explorer efectos del SNP rs13419896 en endógenas niveles de expresión génica de la
EPAS1
, genotipo del SNP y los niveles evaluados de la expresión génica en diversas líneas celulares de cáncer. Cuando las células se dividieron en dos grupos por la presencia o ausencia de la
Un
alelo en el locus rs13419896, las células de cáncer con el
Un
alelo del rs13419896 demostraron significativamente mayor
EPAS1
niveles de expresión génica que para cualquier otro sin el
Un
alelo (
P = 0,022,
t
prueba de Welch) (figura 3A). Se analizaron adicionalmente los niveles de EPAS1 (HIF-2α) expresión de la proteína en varias líneas celulares de cáncer de pulmón por inmunotransferencia análisis. Como resultado, se detectaron proteínas EPAS1 en PC9 y LC-KJ con el
Un
allels incluso en condiciones de normoxia y, obviamente, se incrementaron en algunas de las células cancerosas hipóxicas, A549, PC9, LC-KJ, y LC-S (figura 3B)
(A) Los
EPAS1
los niveles de expresión de genes evaluados por tiempo real RT-PCR se compararon entre grupos de células cancerosas por estatus rs13419896.; uno con el
Un
alelo en el sitio de SNP (con
Un
alelo) y otros sin (w
A /S
alelo). Los niveles de expresión de
EPAS1
en cada línea celular se calculó como la relación con el de
ACTB
y cada valor representa la media de al menos tres experimentos independientes (círculo abierto). Cada barra indica la media del nivel de expresión de cada grupo.
P
-valores se calcularon utilizando
t
prueba de Welch con *:
P = 0,022
. (B) la proteína niveles de expresión EPAS1 se compararon entre los genotipos como anteriormente. Varias líneas celulares de cáncer de pulmón se incubaron en condiciones de normoxia (21% pO
2) o hipóxicas (1% pO
2) durante 24 horas. Extractos de células enteras preparadas a partir de cada línea celular fueron sometidos en el análisis de inmunotransferencia utilizando anti-EPAS1 (HIF-2α) o anti-β-actina como control.
El alelo A de SNP rs13419896 de
EPAS1
se asocia a peor supervivencia global de no pequeñas de pulmón de células cancerosas pacientes
Desde que se propuso el rs13419896 SNP para enlazar con una mayor expresión de
EPAS1
gen, entonces exploraron posibles asociaciones del SNP con factores clínico-patológicas de los pacientes con CPNM japoneses. Genotipos del SNP rs13419896 se determinaron en 76 pacientes con CPNM, y se encontró que en buen acuerdo con el equilibrio de Hardy-Weinberg (
P
= 0,45, prueba de Chi-cuadrado, Tabla 2). No se encontraron diferencias significativas entre las frecuencias genotípicas entre las muestras de NSCLC japonesa en este estudio y la población japonesa sana del proyecto HapMap (
P = 0,94
, se extendió la prueba exacta de Fisher, Tabla 2). A continuación, examinó la relación entre el
EPAS1
SNPs y diversas características clinicopatológicas (Tabla 3). La frecuencia del alelo menor de rs13419896 tendió a ser mayor en las hembras que en los machos: Una frecuencia de pacientes que poseen al menos un
Un
alelo de rs13419896 (
Un
/
o
Un
/
G
genotipo) fueron 70,0% (14 de 20) en las mujeres y el 44,6% (25 de 56) en los hombres, aunque esto no fue estadísticamente significativa (
P
= 0,07, prueba exacta de Fisher). Además, la distribución de la diferenciación tiende a diferir en el SNP con una significación marginal (
P = 0,06
, se extendió la prueba exacta de Fisher). Que no sea el género y la diferenciación, no encontramos ninguna asociación estadística del SNP con características clínico-patológicas, como la edad, la histología, el tamaño del tumor y el estadio.
luego evaluaron la asociación de la rs13419896 SNP con la supervivencia global para el NSCLC. El tiempo medio de supervivencia de pacientes con al menos un
Un
alelo de rs13419896 (
Un
/
Un
o
Un
/
G
) fue significativamente más corto que con el
G
/
G
homocigoto (28,0 meses frente a 52,5 meses,
P = 0,047
, log-rank test, la figura 4). Cuando se compara la supervivencia acumulada a los 12, 24 y 48 meses, los pacientes con el
G /G
homocigotos mostraron tasas mucho más altas que aquellos con
A /G
o
A /A
genotipo a los 12 y 48 meses (
P = 0,009
y 0.004, respectivamente) (Tabla S1). Un análisis multivariado de los 74 pacientes con CPNM (2 pacientes fueron excluidos debido a la falta de datos del tamaño del tumor) mediante un modelo de riesgo proporcional de Cox demostró que la posesión de
Un
alelo (
A /G
o
a /a
genotipo) de rs13419896, junto con el estadio clínico, era una variable independiente para la estimación del riesgo de la supervivencia global de los pacientes con CPNM [hazard ratio (HR) = 2,31, IC del 95% = 1,14-4,81 ,
P = 0,021
], después de ajustar por edad, sexo, estadio, histología, el tamaño del tumor, y la diferenciación.
gráficos de supervivencia de Kaplan-Meier estratificadas según genotipos de rs13419896 se muestran. Diferencia en la supervivencia global entre los grupos genotípicos de los pacientes con CPNM se examinó mediante la prueba de log-rank con
P-valores
como se indica.
Discusión
Recientemente, varios SNPs de
EPAS1
se ha demostrado que se correlacionan con el desarrollo de diversas enfermedades como la osteoartritis [16], retinopatía del prematuro [17], la energía metabólica máxima en atletas de élite de resistencia [18] y la adaptación fisiológica de gran altitud poblaciones [19-22], y la susceptibilidad hacia el carcinoma de células renales (CCR) y el cáncer de próstata [23, 24]. Sin embargo, una relación mecanicista entre estos SNPs y los niveles de expresión génica de la
EPAS1
apenas se ha conocido, excepto por el rs17039192 situado en la región 5 'no traducida, que dieron alterada actividades de promotor en el ensayo de gen reportero en condrogénica las células [16].
en este estudio, los análisis bioinformáticas nos llevó a probar un papel de uno de los SNPs Hap-tag, rs13419896 situado dentro intron1 del gen, en la regulación de
EPAS1
expresión. De hecho, se encontró que un fragmento en el intrón 1 de
EPAS1
contiene elementos reguladores de la transcripción y de la diferencia de nucleótidos en el locus rs13419896 puede afectar funcionalmente actividades potenciadoras en líneas celulares de cáncer. Curiosamente, más experimentos de co-transfección indicaban claramente que la AP-1 factor de transcripción podría estar involucrado en la actividad transcripcional diferenciales entre los alelos rs13419896. La transactivación específica observada por los componentes exógenos AP-1 sólo en construcciones con
Un
alelo en el rs13419896 de acuerdo bien con la puntuación relativa más alta para AP-1 con
Un
alelo en el SNP como se muestra por análisis JASPAR Core Vertebrata. Anteriormente, se observó la sobreexpresión de las proteínas c-fos c-Jun y en 31 a 50 y 60%, respectivamente, de los tejidos de NSCLC [34, 35]. El overexpressed c-Jun o c-Fos pueden transactivar
EPAS1
expresión génica
vía
, al menos en parte, un elemento potenciador en el intrón 1 del gen de una manera específica de alelo en el locus rs13419896. Esto también fue apoyada por la observación de la expresión de genes y proteínas niveles de
EPAS1 fotos: por el rs13419896 SNP en varias células cancerosas. Aunque no confirmamos por completo los genotipos (incluyendo la pérdida alélica, amplificación, o mutaciones) de las líneas celulares de cáncer de prueba, se encontró que las células con
Un
alelo en rs13419896 de
EPAS1
mostraron significativamente mayor
expresión de genes y proteínas EPAS1
niveles en comparación con aquellos que carecen de
Un alelo
independientemente de las diferencias de origen genético. Tomados en conjunto estos datos, se sugiere fuertemente que el
Un
alelo en rs13419896 SNP de
EPAS1
juega un papel importante en la alteración de la afinidad de unión de AP-1, lo que resulta en niveles diferenciados de expresión del tejido EPAS1 en el CPNM.
la asociación observada de la
Un
alelo del SNP rs13419896 con el aumento de los niveles de expresión de EPAS1 nos inspiró a examinar más a fondo la posible función del SNP en el pronóstico de pacientes con CPNM japoneses, ya que se reportó la sobreexpresión de EPAS1 estar asociado con un mal pronóstico. Hemos demostrado por primera vez que el locus rs13419896 era una variable independiente para la estimación del riesgo de supervivencia global del NSCLC.
En el NSCLC humano, la sobreexpresión de HIF-2α (EPAS1) fue consistentemente asociada con la histología como SCC es dominante , el aumento de tamaño del tumor y la angiogénesis, dando como resultado un peor pronóstico y la disminución de las tasas de supervivencia [13, 14]. En nuestro estudio, no se encontró ninguna asociación entre el SNP rs13419896 con la histología y el tamaño del tumor. Por otro lado, el índice de riesgo de la posesión de
Un
alelo sobre el
G
alelo en el modelo de riesgo de Cox fue de 2,31, que es comparable a la relación entre la alta expresión de HIF-2α obtenida previamente (2.01 y 1.71) [13, 14]. Metaanálisis reciente examen de la supervivencia global por la sobreexpresión de la proteína HIF-2α también demostró CR de 2,02 (IC del 95%: 1,47 a 2,77) [36]. Teniendo en cuenta estos, el SNP rs13419896 puede ser uno de los factores importantes que contribuyen a la sobre-expresión de HIF-2α en el tejido NSCLC y así ser un marcador pronóstico útil para el NSCLC. Se observó una diferencia estadísticamente significativa de la tasa de supervivencia acumulada entre los pacientes con
Un alelo
y sin que a los 12 meses después de la operación (S1 Tabla). Si nuestra observación es confirmada por otras cohortes en el futuro, la genotipificación de SNP puede llegar a ser clínicamente importante para considerar el cuidado de los pacientes y el asesoramiento inmediato. Además de NSCLC, también se informó de otros cánceres como el colorrectal y el cáncer de cabeza y cuello para mostrar un mal pronóstico con una sobre expresión del HIF-2α en el meta-análisis [37, 38]. Dado que la sobreexpresión de componentes AP-1 se puede observar para estos tipos de cáncer [39, 40], el rs13419896 SNP puede contribuir a la sobreexpresión de HIF-2α y ser un marcador pronóstico útil en varios tipos de cáncer.
En conclusión, encontramos aquí por primera vez que la diferencia de nucleótidos en el rs13419896 SNP puede afectar a
EPAS1
expresión de genes y proteínas, específicamente en respuesta a AP-1, y que el
Un
alelo de
EPAS1
SNP está asociado con un peor pronóstico de los pacientes con cáncer de pulmón. Para establecer el
EPAS1
SNP como marcador pronóstico clínico útil y para aclarar aún más sus mecanismos moleculares, estudios clínico-patológicos de mayor escala de cáncer de pulmón y /o otros tipos de cáncer será aportar información adicional sobre estos aspectos.
Apoyo a la Información
S1 Fig. UCSC Genome Browser representación de los datos de ENCODE Consorcio chip-Seq para el factor de transcripción unión superpuesta sobre hg19 genoma humano construcción.
Los paneles superiores muestran la estructura genómica de la
EPAS1
gen compilado a partir de la UCSC, y RefSeq GenBank con barras gruesas que indica la codificación de secuencias exónicas, barras delgadas que muestra regiones no codificantes de exones (5 'y 3' UTRs) y flechas que denotan intrones con direccionalidad 5 'a 3'. El eje horizontal muestra la posición del genoma en pb en el intervalo de ChR2: 46,514,938-46,626,784. La posición de la SNP rs13419896 se indica en rojo y su posición relativa se extrapola a través de todos los conjuntos de datos como una línea azul roto. datos de chip-Sec se muestra en el mismo lugar del genoma con el eje vertical que indica chip enriquecimiento del factor de transcripción vinculante para CEBPB (negro), MYC (rojo), FOS (verde), Jun (azul), JUNB (violeta) y JUND ( naranja) en las líneas celulares especificadas. La barra de escala indica la distancia genómica de 50 kb
doi:. 10.1371 /journal.pone.0134496.s001 gratis (PDF) sobre Table S1. Las comparaciones de las tasas de supervivencia acumulada entre los pacientes con genotipos
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doi:10.1371/journal.pone.0134496.s002
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Acknowledgments
The autores agradecen Prof. N. Kohno, emérito profesor K. Inai (Universidad de Hiroshima), el Prof. F. Yunus y el Dr. E. SYAHRUDDIN (Universidad de Indonesia) por su amable apoyo y aliento. También se agradece a la Sra C. Oda por su asistencia técnica. Parte de este trabajo se llevó a cabo en el Centro de Análisis de Ciencias de la Vida, Universidad de Hiroshima.