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PLOS ONE: el reconocimiento de anticuerpos de gangliósidos relacionada con el cáncer y sus imitadores investigó el uso in silico Sitio Mapping


Extracto

gangliósidos modificados pueden sobreexpresa en ciertos tipos de cáncer, por lo tanto, se consideran un objetivo valioso en el cáncer inmunoterapia. conocimiento estructural de su interacción con anticuerpos se limita actualmente, debido al gran tamaño y alta flexibilidad de estos ligandos. En este estudio, aplicamos nuestra técnica de mapeo de sitios previamente desarrollado para investigar el reconocimiento de los gangliósidos relacionados con el cáncer por los anticuerpos anti-gangliósidos. Los resultados revelan un potencial motivo de unión a gangliósido en los cuatro anticuerpos estudiados, lo que sugiere la posibilidad de convergencia estructural en la respuesta inmune anti-gangliósido. La base estructural del reconocimiento de péptidos de gangliósidos-miméticos también se investigó mediante mapeo de sitios de reconocimiento y se compara con gangliósido. Se muestran los péptidos para actuar como miméticos estructurales de los gangliósidos mediante la interacción con muchos de los mismos residuos del sitio de unión como los epítopos de hidratos de carbono afines. Estos estudios proporcionan pistas importantes en cuanto a la base estructural de la mímica inmunológica de los hidratos de carbono

Visto:. Agostino M, Yuriev E, Ramsland PA (2012) el reconocimiento de anticuerpos de gangliósidos relacionada con el cáncer y sus imitadores investigado utilizando
in silico
la asignación de sitio. PLoS ONE 7 (4): e35457. doi: 10.1371 /journal.pone.0035457

Editor: Bostjan Kobe, Universidad de Queensland, Australia |
Recibido: 6 Febrero, 2012; Aceptado: March 19, 2012; Publicado: 20 Abril 2012

Derechos de Autor © 2012 Agostino et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Esta investigación el apoyo de una pequeña subvención de la Facultad de Farmacia y Ciencias farmacéuticas de la Universidad de Monash, a EY. MA es un destinatario del Premio a la Publicación de Monash Universidad de Postgrado. PAR es el Sir Zelman Cowen Investigador Senior (Sir Zelman Cowen Fondo de Becas, Burnet Institute). Los autores agradecen la contribución a este trabajo del Programa de Apoyo a la Infraestructura Operativa Victorian recibida por el Instituto Burnet. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

Los gangliósidos son glicoesfingolípidos que cuentan con uno o más residuos de ácido siálico. Con mayor frecuencia se asocian con la función del sistema nervioso, donde juegan un papel crucial en el mantenimiento de la estabilidad de la mielina y axones [1]. Las alteraciones en los niveles de expresión de gangliósidos se han asociado con varias condiciones neurodegenerativas, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington y la demencia asociada al VIH [2]. La producción de anticuerpos anti-gangliósido es uno de los rasgos bioquímicos clave del síndrome de Guillain-Barré, una neuropatía autoinmune [3]. Aunque se desconoce en la mayoría de los casos la causa específica del síndrome, que es precedido habitualmente por la infección por
Campylobacter jejuni
[4], [5].

Los gangliósidos se han identificado como tumores antígenos de carbohidrato -asociado (TACAS), un grupo que incluye Lewis y, Lewis X, Thomsen-Friedenreich y Thomsen-nouvelle [6]. Los gangliósidos se encuentran con mayor frecuencia en el sistema nervioso son GM1, GD1a, GD1b y GT1b [1], sin embargo, los gangliósidos considerados para la vacuna y la focalización basada en anticuerpos son intermedios general de biosíntesis de estos, tales como GM2, GM3, GD2 y GD3 [ ,,,0],7], [8], [9], [10] (Figura 1). Mientras se encuentra en bajas cantidades en el sistema nervioso, que a menudo aparecen en altas densidades en una variedad de tipos de células tumorales [11], [12], [13]; por lo tanto, son objetivos atractivos para la inmunoterapia del cáncer. Además de éstos, los gangliósidos que termina en
N
ácido -glycolylneuraminic (Neu5Gc), como
N
-glycolyl GM3 (Neu5Gc-GM3), también son dianas útiles para el tratamiento del cáncer [14] , [15]. A diferencia de
N
ácido -acetylneuraminic, Neu5Gc no pueden ser sintetizados por los seres humanos, debido a la falta de una hidroxilasa de ácido siálico funcional [16]. La aparición de Neu5Gc en células humanas se cree que se produce a través incorporación enzimática de la dieta [17]. Dado que la expresión Neu5Gc está restringida a las células de cáncer en los seres humanos, la orientación gangliósidos Neu5Gc-terminación es probable que lograr un resultado terapéutico altamente selectiva

gangliósidos del SNC:. A. GT1b. B. GD1a. C. GD1b. D. GM1. gangliósidos relacionados con el cáncer: E. GD2. F. GD3. G. GM3. H. Neu5Gc-GM3. Puesto que cada estructura se diferencia por la eliminación de uno o más residuos de GT1b, los enlaces glicosídicos especificados en GT1b se aplican a todas las estructuras, incluyendo Neu5Gc-GM3. símbolos de hidratos de carbono siguen la nomenclatura del Consorcio para Funcional Glycomics [63]:
N
ácido -acetylneuraminic - púrpura del diamante; galactosa - círculo amarillo;
N
-acetylgalactosamine - cuadrado amarillo; glucosa - círculo azul;
N
ácido -glycolylneuraminic -. Diamante azul claro

Los hidratos de carbono son considerados normalmente antígenos de células T
independiente, por lo general incapaces de inducir una fuerte respuesta inmune [18], [19]. Una manera de abordar este problema es mediante el desarrollo de miméticos de carbohidratos, capaces de inducir una respuesta inmune anti-carbohidrato. Los péptidos se han considerado para este propósito contra una amplia gama de objetivos [20]. imita peptídicos de la GD2 [21], [22], [23] y GD3 [24], [25] Se han identificado los gangliósidos, típicamente mediante presentación de fagos contra anticuerpos anti-gangliósidos. Algunos de éstos se han encontrado para inducir respuestas inmunes anti-gangliósidos [23], [25], [26]. compuestos peptídicos miméticos de anticuerpos anti-Neu5Gc-GM3 no se conocen en la actualidad, sin embargo, los anticuerpos anti-idiotípicos contra estos anticuerpos han sido identificados [27], [28].

Aunque los estudios estructurales anteriores en el reconocimiento de los gangliósidos y sus imitadores por anticuerpos se han realizado [21], [29], [30], [31], estas metodologías moleculares de conexión simples han utilizado generalmente. Anteriormente hemos desarrollado la técnica de mapeo de sitio, que hemos demostrado ser eficaz para el estudio de hidratos de carbono-anticuerpo [32], [33] y de hidratos de carbono-lectina reconocimiento [34], así como péptido-anticuerpo reconocimiento [35], [36 ], [37], [38]. A continuación, se evalúa una serie de programas de acoplamiento molecular por su capacidad para predecir los modos de unión de azúcares ácidos para anticuerpos y aplicar nuestra técnica de mapeo de sitios para estudiar el reconocimiento de anticuerpos de azúcares ácidos (Tabla 1). El enfoque computacional más adecuada para los casos de validación se utiliza entonces para investigar el reconocimiento de epítopos de hidratos de carbono de los gangliósidos por cuatro anticuerpos anti-gangliósidos: R24, ME36.1, chP3 y 14F7 (Tabla 2). Si bien no se resuelven experimentalmente estructuras nativas de todos los anticuerpos de interés disponibles, la estructura de uno de estos anticuerpos, chP3, no se encuentra un segmento corto del bucle clave HCDR3. Así, hemos ampliado la técnica de mapeo de sitios de considerar múltiples confórmeros de proteínas, en un proceso denominado "mapeo sitio dinámico". Por último, la técnica de mapeo del sitio se utiliza para investigar el reconocimiento de anticuerpos de los péptidos miméticos de gangliósidos, que se compara con el reconocimiento de los determinantes de carbohidratos de los gangliósidos.

Métodos

Validación y sistemas de prueba

Para la validación del método, los complejos de alta resolución (& lt; 2,5 Å) de los anticuerpos antichlamydial S25-2, S73-2 y S25-39 con poli-Kdo (ácido ketodeoxyoctulosonic) se obtuvieron los antígenos de la Protein Data Bank (PDB) (Tabla 1). Los sistemas de prueba examinados (anticuerpos anti-gangliósidos y sus ligandos) se resumen en la Tabla 2. Los anticuerpos fueron contados y CDR definidas siguiendo el esquema de numeración única IMGT [39].

acoplamiento molecular

Glide 5.6 [40], [41], ORO 4.1.1 [42], AutoDock 4.2 [43] y el muelle 6.4 [44] fueron evaluados por su capacidad para reproducir el modo de unión cristalográfica en cada uno de los sistemas de validación. Los ajustes que se utilizan para estos programas se detallan en otro lugar [34], [45]. En pocas palabras, los ligandos fueron tratados de forma flexible por cada programa de acoplamiento, con la excepción de los anillos de piranosa, que se mantuvieron en conformaciones de silla. En los casos de validación, todas las aguas cristalográficos y moléculas de amortiguación, así como iones, se retiraron de las estructuras. El Asistente de preparación en Maestro 9.2 de proteínas [46] se utilizó para agregar hidrógenos y determinar los estados de protonación más probables de los residuos de proteínas valorables en todos los casos.

mapeo del sitio

Se aplicó el procedimiento de mapeo del sitio a los sistemas de prueba como se describe anteriormente [32]. En pocas palabras, las interacciones que tienen lugar entre las 100 mejores poses clasificados obtenidos de acoplamiento molecular se cuentan de acuerdo con el residuo de proteína con el que ocurrieron y el tipo de interacción que tiene lugar (es decir, enlace de hidrógeno o de van der Waals). Los recuentos se normalizaron dividiendo el número de interacciones observadas con un residuo en particular por el número total de interacciones observadas. La normalización se realizó por separado para la unión de hidrógeno y las interacciones de van der Waals. Los recuentos normalizados están ordenados de mayor a menor contribución, y se calcula la suma acumulada. Todos los residuos que se producen por encima de una suma acumulada de corte determinado se consideran importantes para el reconocimiento.

Las métricas de reproducción y corrección se utilizaron en la evaluación de la calidad del mapa del sitio. La reproducción se calcula como el número de interacciones cristalográficas identificados por el mapa del sitio dividido por el número de interacciones cristalográficas observados. La corrección se calcula como el número de interacciones cristalográficas identificados por el mapa del sitio dividido por el número total de interacciones mapeadas. De reproducción y corrección valores cercanos a uno indican que el sitio generado mapas identifican con precisión las interacciones cristalográficas, sin la inclusión de contactos erróneos. El producto de la reproducción y la corrección se utilizó para evaluar la calidad de la cartografía; los valores más altos indican reproducción y corrección óptima. La suma acumulada de corte se ha optimizado para los sistemas de validación mediante la evaluación del producto medio de la reproducción y la corrección en intervalos de corte 10% de 0-100%. El punto de corte que proporciona el mayor producto medio para la serie de casos de validación (Tabla 1) se aplicó para investigar el reconocimiento de los gangliósidos y péptidos de gangliósidos mimético por los anticuerpos anti-gangliósidos seleccionados (Tabla 2).

Dynamic sitio de mapas

Tres residuos del bucle HCDR3 no se encuentran en la estructura de chP3 (AP 3IU4) [30]. La porción que falta se construyó de forma manual, y confórmeros de baja energía de esta parte, así como el residuo adyacentes a cada lado de la porción que falta (haciendo un total de cinco residuos), fueron generados con la herramienta de refinamiento de bucle en el primer [47]. El procedimiento de mapeo del sitio (véase más arriba) se realizó en los diez conformadores de energía más bajos. El confórmero más probable del conjunto se seleccionó sobre la base de su similitud con la media de conjunto de la unión de hidrógeno y de van der Waals mapas del sitio. Los mapas conjunto promedio se calcula un promedio de las contribuciones de interacción de cada residuo de mapeado de todo el conjunto de diez confórmeros. La similitud de la página web de cada confórmero asigna a la media de conjunto se determinó mediante la siguiente expresión: donde
a
es el punto de corte para la selección de importantes contactos de unión de hidrógeno (como una fracción),
b es
el punto de corte para la selección de importantes contactos de van der Waals (como una fracción),
r
2
HB
es el coeficiente de correlación calculado entre un confórmero particular y el conjunto promedio para los contactos de enlace de hidrógeno, y
r
2
vdW
es el coeficiente de correlación calculado entre un confórmero particular y el conjunto promedio de van der Waals contactos. El conformador que presenta la más alta similitud con los mapas media de conjunto fue seleccionado como el más probable conformador.

Péptido mímica de los gangliósidos

péptidos miméticos de gangliósidos se separa en fragmentos superpuestos hexapeptıdicos y se acopló al anticuerpo objetivos utilizando oro. La técnica de mapeo del sitio (véase más arriba) se aplica a los conjuntos resultantes de poses. Los datos de interacción para el conjunto de hexapéptidos se agruparon para dar una serie de mapas de sitio para los péptidos completos, como se describe anteriormente [36].

Comparación de los gangliósidos y el reconocimiento imitan

Para comparar la el reconocimiento de los gangliósidos y sus imita a base de péptidos, se generaron gráficos de dispersión que comparan las contribuciones de interacción de los residuos del anticuerpo en el reconocimiento de gangliósidos y el reconocimiento sinóptico. La distancia entre cada punto y la línea que representa la equivalencia de los gangliósidos y el reconocimiento mímica (
d
) se calculó como se describe anteriormente [36]. Positivo
d
valores indican un mayor número de interacciones por ese residuo con la mímica, mientras negativa
d
valores indican una mayor interacción con el gangliósido. Residuos con
d
mayor que un valor absoluto de 3,00 se consideraron para variar significativamente de la línea de equivalencia.

Resultados

acoplamiento molecular evaluación

Varios molecular se evaluaron los programas de conexión por su capacidad para predecir el modo de unión cristalográfica de una serie de anticuerpos antichlamydial en complejo con los antígenos de poli-Kdo (Tabla 1). Los resultados de la evaluación de acoplamiento molecular demuestran que la mayoría de los programas son generalmente éxito en la clasificación de precisión el modo de unión cristalográfica (Tabla 3). Sin embargo, todos los programas fueron capaces de identificar el modo de unión correcta (es decir, menos de 2,0 Å RMSD entre pose y modo de unión cristalográfica) para al menos un caso, independientemente de su clasificación. La excepción a esto es el oro, que fue capaz de identificar con precisión tanto y rango, como plantean la parte superior, el modo correcto vinculante en cuatro casos, que son todos los complejos S73-2 (AP códigos 3HZK, 3HZV y 3HZY), y el complejo de S25-39 con Kdoα (2 → 4) Kdoα (2-oTodos) (PDB 3OKK). Dos de estos casos exitosos se muestran en la Figura 2. En general, el aumento del tamaño y la flexibilidad del determinante de carbohidrato siendo examinado conducido a predicciones de calidad reducida. Por otra parte, la topografía sitio de unión también puede afectar a la calidad de las predicciones, como se ha observado anteriormente [45], sin embargo, muy pocos complejos modelos apropiados están disponibles para confirmar esto.

A. La comparación de mejor clasificado pose obtuvo de acoplamiento molecular (amarillo) con el modo de unión cristalográfica (azul) de la Kdoα (2 → 4) Kdoα (2-oTodos): S25-39 complejo (AP 3OKK). B. Comparación del mejor clasificado pose (amarillo) obtenido de acoplamiento molecular con el modo de unión cristalográfica (azul) de la Kdoα (2 → 8) Kdoα (2 → 4) Kdoα (2-oTodos): S73-2 complejo (AP 3HZV ). C. Representación esquemática de las interacciones en el Kdoα (2 → 4) Kdoα (2-oTodos): S25-39 predicho por acoplamiento molecular. D. Representación esquemática de las interacciones en el Kdoα (2 → 8) Kdoα (2 → 4) Kdoα (2-oTodos): S73-2 compleja. acoplamiento molecular llevó a cabo utilizando GOLD 4.1.1. Figuras 2A y 2B preparar usando PyMOL [64]. Figuras 2C y 2D preparados usando LIGPLOT [65]. Una explicación de las figuras 2C y 2D: enlaces de hidrógeno - guiones verdes; interacciones hidrofóbicas - arcos de color rojo; negro carbón; oxígeno - rojo; nitrógeno - azul; bonos ligando - púrpura; enlaces de la proteína -. naranja

Optimización de mapeo de sitios de reconocimiento de anticuerpos de azúcares ácidos

Puesto que el oro producido las poses más precisos, con independencia de la capacidad para clasificar esas poses, se utiliza para proporcionar la entrada del conjunto pose para la asignación de sitio. Una suma de corte acumulado de 80% para los dos enlaces de hidrógeno y de van der Waals se ha demostrado ser óptima cuando los anticuerpos anti-carbohidrato de mapeo sitio, donde más corto, menos flexible y menos funcionalmente se consideraron diversos hidratos de carbono [32]. Este corte también se ha aplicado con éxito a anticuerpos peptídicos-reconocer e interacciones de hidratos de carbono-lectina [34], [36]. Con el fin de determinar si este punto de corte fue apropiado para el estudio de reconocimiento de anticuerpos de azúcares ácidos con vínculos altamente flexibles (es decir, (1 → 6) o (2 → 8) enlaces), se investigó una serie de valores de corte (Tabla S1). Se encontró que el 90% de corte para ser más consistente, proporcionando una desviación estándar más baja en los datos del producto (es decir, la reproducción × corrección) obtenidos para el conjunto de casos (S.D. = 0,05). El punto de corte del 80% dio una media idéntica a la de corte de 90% en el conjunto de los casos estudiados, pero era un poco menos consistente que el 90% de corte (S. D. = 0,08). Sin embargo, el uso del punto de corte 90% resultó en mapa relativamente pobre exactitud (~0.5-0.6) en comparación con los casos anteriores [32], [34], [36]. Este bajo nivel de mapa corrección se puede atribuir a la inclusión de muchos contactos errónea de van der Waals.

Con el fin de optimizar la selección de interactuar residuos, enlaces de hidrógeno y de van der Waals contactos fueron considerados con puntos de corte separados, en vez de la misma ley de corte para cada tipo de interacción tal como se utiliza anteriormente [32], [34], [36]. Cuando el enlace de hidrógeno se considera solo, se encontró el 90% de corte para que sea óptimo para la gama de sistemas de prueba (Tabla S2) y dio resultados superiores a teniendo en cuenta tanto el enlace de hidrógeno y de van der Waals con el mismo corte. Se necesita Examen de algunos contactos de van der Waals para identificar las interacciones con cadenas laterales no polares. Se encontró que un corte de 40% para los contactos de van der Waals, en combinación con un corte de 90% para las interacciones de enlace de hidrógeno, siempre que la predicción óptima de contactos cristalográficos (Tabla S3).

El uso de este punto de corte optimizado, se se demostró que el mapeo del sitio y la parte superior plantean obtuvieron de acoplamiento molecular unos resultados comparables a la predicción de interactuar residuos (Figura 3, Tabla 4). Por otra parte, este punto de corte optimizado proporciona un mapa sitio de calidad comparable en la reproducción y la corrección de los sistemas en anticuerpos y lectina-carbohidrato previamente estudiados [32], [34].

Kdoα (2 → 4) Kdoα (2 → 4) Kdoα (2-oTodos) unión a S73-2 (PDB 3HZY) descrito por el mapa de enlace de hidrógeno (a) y van der Waals interacción de ruta (B). Kdoα (2 → 8) Kdoα (2 → 4) Kdoα (2-oTodos) unión a S25-39 (PDB 3OKO) descrito por el mapa de enlace de hidrógeno (C) y van der Waals interacción de ruta (D). La profundidad de color indica el nivel de participación de un residuo particular, en el reconocimiento del ligando; más fuertemente iluminados residuos están más involucrados en el reconocimiento de ligandos de residuos débilmente iluminadas. El modo de unión estructura cristalina se muestra en cada estructura en palos de colores según el tipo de átomo (C, amarillo; O, rojo). Las imágenes renderizadas usando PyMOL [64].

mapeo del sitio dinámico de chP3

La estructura de chP3 (AP 31U4) no se encuentra tres residuos desde el bucle HCDR3 [30] . Se sabe que los residuos de este bucle son importantes para el reconocimiento de antígenos por chP3. Con el fin de identificar la conformación más adecuada de este bucle, mapeo de sitios de "dinámica" de chP3, con lo cual mapeo de sitios de múltiples confórmeros chP3 - variando sólo en la conformación de la parte que falta del bucle HCDR3 - se llevó a cabo. Desde que se obtienen menos de diez poses al atracar Neu5Gc-GM3 a la cuarta más bajo confórmero de energía de la chP3 HCDR3, mapeo sitio no podría llevarse a cabo en esta estructura. Se utilizó el más bajo-XI confórmero de energía en lugar, para hacer un conjunto de diez estructuras
.
A partir de estudios de mutagénesis dirigida, se sabe que Arg111.2H (Arg100AH ​​de numeración de Kabat) es fundamental para el reconocimiento de gangliósidos [ ,,,0],30]. Por lo tanto, sería de esperar que este residuo está muy involucrado en las interacciones antígeno. Cuando el procedimiento de mapeo del sitio se llevó a cabo en la energía chP3 HCDR3 confórmero más bajo, Arg111.2H representó sólo el 5,31% de todos los enlaces de hidrógeno observados, mientras que otros residuos representaron un número significativamente mayor de enlaces de hidrógeno (Tabla S4). Por lo tanto, el conformador de puntuación superior no es potencialmente el más representativo del estado biológicamente relevante. mapas de sitio similar a este se observaron para el quinto y noveno más estructuras chP3 energía. La segunda más baja energía chP3 HCDR3 confórmero contó con casi ninguna interacción con Arg111.2H (0,90% de los enlaces de hidrógeno y 1,34% de van der Waals), lo que sugiere que el bucle es también probable que sea en una conformación biológicamente irrelevante. Tras la inspección de esta estructura, la cadena lateral de Arg111.2H apila con la cadena lateral de Trp57H, y por lo tanto no puede interactuar fácilmente con el ligando (Figura 4). En el tercero más bajo de la estructura energética, se observaron los enlaces de hidrógeno con la mayoría de Arg111.2H - poco más del 20% de todos los enlaces de hidrógeno. Por lo tanto, esta estructura es probable que sea representativa del estado biológicamente relevante. Otros contactos clave en esta estructura incluyen Ala112.1H, His107L y Tyr108L. El sexto más bajo estructura energética contó Arg111.2H y Ala112.1H como contactos clave, pero no prominente viene con los dos residuos de la cadena ligera, identificados como importantes para las interacciones en el tercero más bajo de la estructura energética. En su lugar, Ser38H fue identificado como un contacto clave. La estructura de energía más bajo octava fue similar a este, con un poco mayor énfasis en las interacciones con His107L y Tyr108L. En el séptimo más bajo estructura energética, Arg111.2H dominó las interacciones de enlace de hidrógeno, lo que representa casi un tercio de todos los enlaces de hidrógeno observados con esa estructura. Sin embargo, Ala112.1H, Gln112H, His107L y Tyr108L cada una el ~ 10% de todos los enlaces de hidrógeno. El xy y estructuras energéticas más bajas XI-sitio similar que ofrece mapas entre sí, con enlaces de hidrógeno con bastante uniformemente distribuidos entre Arg112.2H, Ala112.1H, Gln112H, Ala113H, His107L y Tyr108L.

A. La segunda más baja conformador de energía, destacando el apilamiento entre las cadenas laterales de Arg111.2H y Trp57H. B. El confórmero de energía décima más bajo, prevé que sea más probable que participen en la unión de ligando. C. mapa del sitio El enlace de hidrógeno para el confórmero de energía décima parte más baja. D. La van der Waals mapa para conformador de energía décima parte más baja. Los residuos que contribuyen al motivo de unión a gangliósidos-propuesta se destacan en los mapas de los sitios de unión de hidrógeno.

En todos los casos, de van der Waals contactos fueron dominados por Trp57H y Trp116L (cuadro S5). Los residuos hCDR3 - Arg111.2H, Ala112.1H y Gln112H - también fueron importantes para los contactos de van der Waals. Su importancia es por lo general de acuerdo con su importancia para el enlace de hidrógeno (es decir, los residuos que son muy importantes para el enlace de hidrógeno son típicamente muy importante para los contactos de van der Waals).

En el análisis de los mapas de los sitios generados, se determinó chP3 que el confórmero más representativo de la media estatal fue el confórmero-décimo lugar (Figura 4, Tabla 5). Este confórmero cuenta con enlaces de hidrógeno significativa con Arg111.2H, conocido por ser importante para el reconocimiento de los estudios de mutagénesis dirigida, pero también sugiere la importancia de los residuos cercanos HCDR3 (Ala112.1H, Gln112H, Ala113H) y los residuos de LCDR3 His107L y Tyr108L. Las interacciones de van der Waals se producen en gran medida con los residuos de triptófano en las posiciones 57H y 116L. Esta utilización de residuos es similar a otros anticuerpos anti-hidratos de carbono [32].

La determinación de la probabilidad de gangliósido reconocer motivo

Hemos investigado el reconocimiento de gangliósidos por los cuatro anticuerpos anti-gangliósidos (Tabla 2) usando el enlace de hidrógeno idénticos y van der Waals puntos de corte, de acuerdo con nuestro trabajo previo [20], [32], [34], y esto identifica algunos de los residuos que puedan estar involucrados en el reconocimiento de gangliósidos [48]. Para confirmar los resultados de este estudio preliminar, estos casos han ahora volvieron a ser examinados usando los valores de corte optimizados. Los correspondientes epítopos de hidratos de carbono de los gangliósidos se acoplan a R24, ME36.1 y 14F7, y se aplicaron los puntos de corte optimizados para identificar los residuos de anticuerpos probablemente implicadas en el reconocimiento de gangliósido. Los mapas de los sitios generados, así como la generada por el procedimiento de mapeo dinámico aplicado a chP3, se utilizaron para identificar la presencia de un potencial motivo de unión a gangliósido en los anticuerpos anti-gangliósidos. Los residuos clave involucrados en el reconocimiento de gangliósidos se resumen en la Tabla 6.

gangliósidos reconocimiento por los anticuerpos fue generalmente dominada por la interacción con la cadena pesada (Figuras 4 y 5). En los casos de mAbs R24 y 14F7, el reconocimiento era totalmente dependiente de los residuos de la cadena pesada, mientras que para mAbs ME36.1 y chP3, aproximadamente un tercio de todas las interacciones se produjo con residuos de cadena ligera. Estas diferencias en la utilización de CDR se pueden explicar en términos de las topografías de sitios de unión de cada uno de los anticuerpos; las cavidades de unión de R24 y 14F7 se incluyen tanto en su totalidad de los residuos de la cadena pesada, con acceso a los LCDRs bloqueados por HCDR2.

El enlace de hidrógeno y de van der Waals mapas del sitio de R24 (A y B), ME36.1 (C y D) y 14F7 (e y F). Los residuos que contribuyen a la probable motivo de unión a gangliósidos están etiquetados en los mapas de los sitios de unión de hidrógeno.

A pesar de las diferencias en las topografías de sitio de unión, hay similitudes fundamentales entre los anticuerpos que se pongan de manifiesto en el examen estructural de la mapas del sitio. Cuatro residuos, dispuestos en una "espiral" relativamente similares alrededor de cada sitio de unión del anticuerpo, son en gran parte responsables de las interacciones de enlace de hidrógeno con los gangliósidos. Procediendo las agujas del reloj, el probable motivo de unión a gangliósido-de los anticuerpos antigangliósidos comprende dos residuos polares (típicamente Ser, seguido de Tyr, Thr o Asp), un residuo aromático (típicamente Tyr) y un residuo básico (Arg). No todos los anticuerpos ajustarse estrictamente a este motivo; por ejemplo, R24 cuenta con un residuo de treonina donde se esperaría una arginina, y chP3 cuenta con un residuo de alanina en donde sería de esperar una serina

Péptido mimetismo de los gangliósidos

El péptido mimético de GD3. - RHAYRSMAEWGFLYS - podía replicar casi todos los de la interacciones de van der Waals hechas por el gangliósido con R24, pero algunos marcadas diferencias en el perfil de unión de hidrógeno producido (Tabla S6). Los mapas revelaron que el péptido no puede replicar el número de enlaces de hidrógeno hechas entre el trisacárido GD3 y de los residuos del anticuerpo Gly38H y Ser58H. Sin embargo, se observó un aumento significativo de enlaces de hidrógeno con el HCDR3 residuos, Tyr113H y Tyr114H. El potencial reducido del péptido para penetrar profundamente y consistentemente el sitio de unión a través del conjunto pose puede explicar por qué se observaron menos interacciones con Gly38H y Ser58H. Tyr113H y Tyr114H pueden ofrecer una mayor interacción con el péptido, ya que son más fácilmente accesibles. De la comparación de la ganglioside- y mapas del sitio de péptidos derivados (Figura 6), el péptido parece ser un imitador estructural parcial de GD3 [20]. Este mimetismo estructural parcial podría dar cuenta de la mímica inmunológica observada de GD3 por este péptido [25].

A. El enlace de hidrógeno sitio mapa que describe el reconocimiento de péptidos (RHAYRSMAEWGFLYS) por R24. B. van der Waals mapa del sitio que describe la interacción de reconocimiento de péptidos por R24. El sitio de mapas generados y representa utilizando PyMOL [64]. C. Comparación del sitio de enlace de hidrógeno mapas que describan GD3 y el reconocimiento del péptido. D. Comparación de van der Waals sitio de mapas que describan GD3 y el reconocimiento del péptido. En las Figuras 6C y 6D, puntos blancos indican los residuos que se desvían significativamente de la línea que representa la equivalencia de los hidratos de carbono y péptidos interacciones (es decir, |
d
| & gt; 3,00). La cuestión pendiente que no estén etiquetados en la figura 6C corresponde con Tyr114H.

El péptido mimético de GD2 podría carbohidratos más de cerca imitar la unión a ME36.1 en comparación con el péptido mimético de unión a GD3 R24 (Tabla S7) . Similar a los hidratos de carbono y el péptido de unión a R24, las interacciones de van der Waals de los hidratos de carbono se replican muy bien por el péptido, mientras que se observaron algunas diferencias menores en el perfil de unión de hidrógeno. Se observó un aumento significativo de enlaces de hidrógeno con Asp55H y Ser108H, acompañado de un ligero descenso en los enlaces de hidrógeno con Tyr55L y Ser56L. A pesar de estas diferencias, el ganglioside- y mapas de los sitios de péptidos derivados de ME36.1 son en general muy similares entre sí. Puesto que el péptido es conocido por ser un imitador inmunogénica de GD2 [23], esto representa un caso de mimetismo estructural se traduce en mimetismo inmunológica (Figura 7) [20].

A. El enlace de hidrógeno sitio mapa que describe el reconocimiento de péptidos (LDVVLAWRDGLSGAS) por ME36.1. B. van der Waals mapa del sitio que describe la interacción de reconocimiento de péptidos por ME36.1. C. Comparación del sitio de enlace de hidrógeno mapas que describan GD2 y el reconocimiento del péptido. D. Comparación de van der Waals que describen los mapas del sitio de reconocimiento GD2 y el péptido.

Discusión

carbohidratos y proteínas reconocimiento es particularmente difícil para acoplamiento molecular para predecir con exactitud, debido a la multitud de químicamente grupos hidroxilo equivalentes en hidratos de carbono y su potencial para formar muchas interacciones específicas, incluyendo CH-π interacciones [45], [49]. Evaluación de una variedad de acoplamiento molecular planteamientos contra los casos de prueba adecuado es deseable asegurar el desarrollo de un protocolo de modelado óptimo. Hemos demostrado previamente que el acoplamiento molecular puede ser una herramienta eficaz para el estudio de reconocimiento de anticuerpos de hidratos de carbono simples estructuralmente [45]. Sin embargo, los gangliósidos disponen de diversa funcionalidad química, incluidos los grupos carboxilato y cadenas hidroxilados flexibles. Por otra parte, GD2 y GD3 contienen α (2 → 8) los vínculos, que cuentan con un grado adicional de libertad conformacional en comparación con, por ejemplo, (1 → 3) y (1 → 4) enlaces, que hemos investigado anteriormente [45]. Para nuestro conocimiento, tales sistemas no han sido evaluadas apropiadamente con acoplamiento molecular. Mientras que los complejos de gangliósidos en anticuerpos de alta resolución no están disponibles para su uso en la evaluación de métodos, una serie de estructuras de alta resolución de anticuerpos antichlamydial en complejo con hidratos de carbono Kdo que contienen están disponibles [50], [51], [52] (Tabla 1); éstos representan los sistemas modelo más adecuado para la evaluación de la probabilidad de éxito en la predicción de reconocimiento gangliósido-anticuerpo. Otro problema con acoplamiento molecular es la necesidad de considerar el potencial de múltiples modos de unión de ligando. Su efecto sobre el reconocimiento por las proteínas puede ser importante para ligandos altamente flexibles, tales como hidratos de carbono y péptidos [49]. Con el fin de considerar el efecto de los modos de reconocimiento de unión de las proteínas [53] múltiples ligando, hemos desarrollado la técnica de mapeo del sitio, que hemos demostrado ser eficaz para el estudio de los hidratos de carbono-anticuerpo [32] y el reconocimiento de hidratos de carbono-lectina [34],

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