Extracto
Antecedentes
Los pacientes diagnosticados con cáncer metastásico tienen un pronóstico casi uniformemente pobres. Los tratamientos disponibles para los pacientes con enfermedad diseminada por lo general no son curativos y tienen efectos secundarios que limitan la terapia que se puede dar. Un tratamiento que es selectivamente tóxico para los tumores sería maximizar los efectos beneficiosos de la terapia y minimizar los efectos secundarios, lo cual permite potencialmente un tratamiento eficaz que debe administrarse.
métodos y las conclusiones
Hemos postulado que el tumor-trópico propiedad de las células madre o células progenitoras podría ser explotada para entregar selectivamente un gen terapéutico para tumores sólidos metastásicos, y que la expresión de un transgén adecuado en loci tumor podría mediar cura de la enfermedad metastásica. Para probar esta hipótesis, se inyecta HB1.F3.C1 células transducidas para expresar una enzima que activa el profármaco eficaz anti-cáncer de CPT-11 por vía intravenosa en ratones con tumores de neuroblastoma diseminados. Las células HB1.F3.C1 migran selectivamente a sitios de tumor, independientemente del tamaño o la ubicación anatómica de los tumores. Los ratones se trataron luego sistémicamente con CPT-11, y se monitorizó la eficacia del tratamiento. Los ratones tratados con la combinación de células que expresan la enzima HB1.F3.C1 CPT-11-activación y este profármaco produjo la supervivencia libre de tumor de 100% de los ratones durante & gt; 6 meses (
P
& lt; 0,001 en comparación con los grupos de control).
Conclusiones
la novela y significativo hallazgo de este estudio es que puede ser posible explotar la propiedad de tumor trópico de células madre o progenitoras para mediar en efectivo, tumor terapia selectivo para tumores metastásicos, para los que no existen tratamientos curativos toleradas están actualmente disponibles
Visto:. Aboody KS, Bush RA, Garcia E, Metz MZ, Najbauer J, Justus KA, et al. (2006) Desarrollo de un Enfoque Tumor-Selective para tratar el cáncer metastásico. PLoS ONE 1 (1): e23. doi: 10.1371 /journal.pone.0000023
Editor Académico: Hans Clevers, Universidad de Utrecht, Países Bajos
Recibido: 8 Agosto, 2006; Aceptado: August 10, 2006; Publicado: December 20, 2006
Derechos de Autor © 2006 Aboody et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de /Instituto de Salud Nacional del cáncer (CA113446, CA79763, CA76202 y CA21765); . Fundación detener el cáncer, Psi Phi Beta Sorority, La Fundación Rosalinde y Arthur Gilbert, Fundación Familia Neidorf, Fundación Marcus, y organizaciones benéficas asociadas sirios libaneses Americanos (ALSAC)
Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no hay intereses en competencia existir.
Introducción
el neuroblastoma es el tumor sólido extracraneal más común en los niños. Por lo general, los pacientes con diagnóstico de enfermedad de alto riesgo demuestran una buena respuesta inicial a la terapia, pero hasta el 80% de estos pacientes recaen con enfermedad metastásica que es refractaria a la terapia. Como otros tumores sólidos, cuando neuroblastomas metástasis, son muy difíciles de tratar, y una mayoría de los niños con troquel neuroblastoma metastásico de su enfermedad [1] - [3]. Los tratamientos actualmente disponibles tienen una eficacia anti-tumor sino que también producen efectos secundarios no deseados al tejido normal, lo que limita el tratamiento que se puede administrar. Se necesitan enfoques novedosos y eficaces para el tratamiento del neuroblastoma
El enfoque descrito en este estudio se basa en la explotación de la propiedad de tumor trópico de células HB1.F3.C1 [4] -. [16] para ofrecer una agente terapéutico eficaz selectivamente a los tumores. El objetivo específico del estudio era demostrar que la administración intravenosa de células que expresan el HB1.F3.C1 CPT-11 carboxilesterasa -activating conejo enzima (irinotecán) (RCE) aumentaría significativamente el efecto antitumoral de dosis toleradas de CPT-11 en ratones portadores de tumores de neuroblastoma difundidos. El método descrito también podría ser adaptado al desarrollo de un tratamiento para los pacientes con otros tipos de tumores sólidos metastásicos.
Las células madre neurales (NSC) o células progenitoras (NPC) y células madre mesenquimales (MSC) Recientemente se han investigado como vehículos de administración para el tratamiento de xenoinjertos subcutáneos, así como para el tratamiento de tumores en el sistema nervioso central o en los pulmones de los modelos preclínicos. Este es el primer estudio que intenta explotar la notable tumor-tropismo de estas células para desarrollar tratamientos para metastásico, tumores sólidos difundidos. Dado que no existen tratamientos eficaces están disponibles para la mayoría de los tumores metastásicos, lo que demuestra que las células madre o progenitoras de origen fetal o adulto se puede utilizar para mejorar el pronóstico de los pacientes con enfermedad metastásica fatal sería muy significativo.
La línea celular utilizada en este estudio (HB1.F3.C1) se derivó a partir de células fetales telencéfalo. Las células primarias fueron inmortalizados por la inserción retroviral del v-
myc
gen que se requiere para sostener su potencial de replicación [17]. Después de la inmortalización, las células se replican HB1.F3.C1
in vitro
para formar células hijas idénticas o pueden ser inducidas a diferenciarse en otras células de linaje neuronal, exhibiendo por ello las características de ambas células madre y células progenitoras. Desde HB1.F3.C1 células administrarse por vía sistémica a migrar y localizar
in vivo
en los sitios de la patología incluyendo tumores, propusimos aprovechar esta propiedad para entregar selectivamente RCE para activar el profármaco anticanceroso CPT-11 [18] - [20]. La hipótesis de que el aumento de conversión de este profármaco en su metabolito activo (SN-38) en los sitios de tumores sería aumentar la actividad antitumoral selectiva. Se administró por vía intravenosa células HB1.F3.C1 transducidas por adenovirus que expresan una forma secretada de RCE a ratones con neuroblastoma diseminada. Los ratones se trataron luego sistémicamente con CPT-11 y se monitorizó la supervivencia a largo plazo de los animales. Los resultados obtenidos sugieren que la nueva enzima /profármaco se acerca a la terapia con células madre o progenitoras como vehículos de administración pueden tener utilidad en el tratamiento del cáncer metastásico.
Métodos
Líneas de células tumorales
Las tres líneas celulares de neuroblastoma humano utilizados en este estudio fueron NB-1691, NB-1643, y SK-N-AS [21], [22]. Estas líneas celulares se obtuvieron del Grupo de Oncología Pediátrica y de la American Type Culture Collection y reflejan diferentes fenotipos y genotipos de neuroblastoma: N-
myc
amplificada, N-
myc
no amplificado /sobreexpresado, N-
myc expresión
/bajo nivel no amplificado,
MDM2
amplificados, y diferentes proporciones de nuclear /citoplasmática de p53. Cada tipo de experimento se detalla a continuación se hizo con las tres líneas celulares; resultados de los experimentos representativos se muestran. Tres líneas celulares de neuroblastoma se utilizaron para demostrar que los resultados observados no fueron limitados a una sola línea celular; se observaron resultados similares con las tres líneas celulares. líneas de células tumorales se cultivaron en DMEM que contenía FCS al 10% a 37 ° C en un ambiente humidificado contiene 10% de CO
2.
HB1.F3.C1 Línea Celular
El HB1. F3.C1 línea celular es una línea celular pluripotente, clonado que fue generado por inmortalización de células obtenidas a partir del telencéfalo de un feto humano de 15 semanas de gestación, utilizando un retrovirus que codifica el v-
myc
de genes [17] , [23]. Se obtuvieron las células primarias de acuerdo con las directrices del Departamento de Anatomía Patológica del Hospital General de Vancouver, con el permiso de usar tejido fetal concedida por el Comité de Selección de Investigación Clínica en Seres Humanos de la Universidad de Columbia Británica. HB1.F3.C1 es una establecida, bien caracterizado, línea celular estable [23] - [27]. HB1.F3.C1 células auto-renuevan
in vitro
, no son tumorigénicos, y son multipotentes, ya que pueden ser inducidas a diferenciarse en neuronas, oligodendrocitos y astrocitos [17]. El uso de esta línea celular eludirse el problema importante de la limitada disponibilidad de grandes cantidades de células primarias y maximiza la reproducibilidad entre los experimentos. La línea celular se cultivó en DMEM con FCS al 10% a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 10% de CO
2.
transducción de células HB1.F3.C1 para expresar RCE
adenovirus de replicación deficiente que expresa una forma secretada de RCE bajo el control del promotor de citomegalovirus (CMV) (AdCMVrCE) se construyó usando métodos estándar, como se describe anteriormente [18], [20], [28]. HB1.F3.C1 células fueron co-cultivadas con AdCMVrCE durante 24 horas antes de la inyección intravenosa. El ensayo de actividad de enzima usada para cuantificar el nivel de expresión de RCE por HB1.F3.C1 células transducidas con adenovirus también se ha informado anteriormente [20].
Migración HB1.F3.C1 Cell, inyección y localización
para examinar si las células inyectadas por vía intravenosa, HB1.F3.C1, migran a los focos tumorales diseminadas en ratones, se inyectaron células tumorales del neuroblastoma por vía intravenosa en las venas de la cola de los ratones y se les permite a las semillas y el desarrollo de tumores durante dos meses. HB1.F3.C1 células (2 × 10
6) a continuación, se inyectaron
a través de
la misma ruta y órganos fueron cosechados 3-4 días después de evaluar la migración a los tumores macroscópicos y microscópicos.
Para los experimentos terapéuticos, HB1.F3.C1 células se administraron 2 semanas después de la inyección de células de neuroblastoma. En este punto del tiempo, los tumores son microscópicas y no detectable por el ojo humano y los
in vivo
imágenes. En consonancia con el inicio del tratamiento en este punto de tiempo, proponemos que el más probable utilidad clínica eventual del enfoque descrito será para erradicar la enfermedad mínima residual después de la terapia convencional. Este protocolo experimental refleja más directamente que la aplicación potencial.
En tanto la migración y los estudios terapéuticos, 2 × 10
6 HB1.F3.C1 células transducidas con adenovirus a una multiplicidad de infección (MOI) de 20 eran pre-marcado con CM-Dil (chloromethylbenzamido-1,1'-dioctadecil-3,3,3 ', 3'-tetrametilindocarbocianina perclorato, Molecular Probes, Eugene, OR) según las instrucciones del fabricante. Las células fueron lavadas 3 veces con PBS y se inyectaron en la vena de la cola de ratones portadores de tumores. CM-Dil fue elegido porque es no difusible en virtud de su unión a tioles celulares covalente, y se ha demostrado que son adecuados para el etiquetado y
in vivo
seguimiento de las células durante al menos 10 semanas [29] , [30]. En los experimentos incluidos en este documento, los ratones inyectados con células marcadas con Dil-CM se recogieron 3-4 días después de la inyección y el etiquetado.
Es1
e inmunodeficientes combinada (SCID) severa esterasa deficientes
El plasma de los ratones SCID contiene altos niveles de una carboxilesterasa roedor que activa CPT-11 [31], [32]. Por lo tanto, hemos utilizado ratones SCID esterasa deficientes para todos los
in vivo
estudios terapéuticos [33]. Estos animales tienen niveles de esterasa plasma comparables a las del plasma humano. Los animales fueron alojados en una instalación AALAAC acreditados y se les dio comida y agua ad libitum.
RT-PCR /PCR
La médula ósea se extrae de la tibia de ratones normales y portadores de tumores, y se extrajo el ARN para la detección de RT-PCR de la tirosina hidroxilasa (TH), un marcador celular de neuroblastoma. Se extrajo el ADN a partir de una alícuota separada de la médula ósea para la PCR de la v-
myc
gen para identificar HB1.F3.C1 células. Primer secuencias y condiciones de RT-PCR para TH han sido publicados anteriormente [21]. Los métodos estándar fueron usados para v-
myc
amplificación utilizando un cebador directo de 5'-CCTTTGTTGATTTCGCCAAT-3 'y un cebador inverso de 5' AGTTCTCCTCCTCCTCCTCG-3 ', con una etapa de recocido de 62,5 ° C durante 1 minuto durante 30 ciclos. El control positivo para la TH se ARN extraído de células NB-1691, y para el v-
myc
gen era el ADN de las células HB1.F3.C1. Los controles negativos no contenían RT o sin ADN, para TH y V-
myc
reacciones, respectivamente.
histoquímica, inmunohistoquímica e inmunofluorescencia Imaging
Los órganos fueron cosechadas, fijado en el 4 % de paraformaldehído /PBS, pH 7,4 y cryoprotected en 30% de sacarosa. tejidos fijados fueron incorporados en OCT, cryosectioned en serie (10 micras), descongelar montados en portaobjetos de vidrio y se almacenaron en seco a -20 ° C. Para el cribado histológico de rutina, las secciones de tejido se tiñeron con hematoxilina y eosina mediante procedimientos estándar.
Presencia de células HB1.F3.C1 en loci tumor neuroblastoma o en el tejido normal se examinó mediante microscopía de fluorescencia. En las secciones preparadas como se ha detallado anteriormente, los núcleos de todas las células se tiñeron con DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol; Sigma bioquímicos, St. Louis, MO; fluorescencia azul), y detectado usando filtros de epifluorescencia de excitación /emisión de 340 -380 /420 nm (LP) (UV-2A, Nikon). HB1.F3.C1 células, marcados con CM-Dil (fluorescencia roja), se detectaron utilizando filtros de excitación /emisión de 540-580 nm y 600-660 nm (Y-2E /C), utilizando un microscopio Nikon Eclipse TE2000-U (Nikon Instruments, Melville, NY) equipado con una cámara digital SPOT RT deslizante (instrumentos de diagnóstico, Sterling Heights, MI). Para detectar los tumores de neuroblastoma humano en tejidos de ratón, se realizó la tinción inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón que reconoce la proteína mitocondrial humano (Chemicon, Temecula, CA). Las secciones se post-fijaron en 4% de paraformaldehído durante 10 min, se enjuaga, se permeabilizaron con 0,3% Triton X-100 /PBS, 30 min y se incubaron en solución de bloqueo (5% de BSA + 3% de suero normal de caballo + 0,1% de Triton X-100 , 1 h). Las secciones fueron incubadas secuencialmente con anticuerpo primario (1:100 dilución) durante 16 horas a 4 ° C, biotinilado anticuerpo secundario anti-IgG de ratón (Vector Laboratories, Burlingame, CA) durante 2 horas, y avidina-FITC (Vector Laboratories) para 1 hora. Las secciones de tejido se contratiñeron con DAPI y se montaron con medio de montaje fluorescente (DAKO). La fluorescencia FITC fue detectado por el filtro de epifluorescencia (excitación 465-495 nm, 515-555 nm de emisión; B-2E /C).
Para la evaluación histológica de rutina de la presencia de tumores en varios órganos, secciones de tejido se tiñeron con hematoxilina y eosina. Las secciones adyacentes se procesaron para inmunoperoxidasa-3,3'-diaminobencidina (DAB) tinción de manera similar como tejidos procesados para la tinción de fluorescencia, excepto que después de la permeabilización, las peroxidasas endógenas se inactivaron con 0,3% de peróxido de hidrógeno /PBS durante 30 min. Anticuerpos de reactividad a la mitocondria humana se detectó posteriormente usando un Vectastain ABC
kit Elite (Vector Laboratories) y un kit de sustrato de peroxidasa (Vector Laboratories) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
baja y alta imágenes de aumento se obtuvieron utilizando un microscopio Nikon Eclipse TE2000-U (Nikon Instruments, Melville, NY) equipado con campo claro y la iluminación de fluorescencia. Las imágenes fueron grabadas y almacenadas utilizando el software SPOT avanzada y Adobe Photoshop.
Modificado células en la cámara de Boyden ensayo Migración
Modificados ensayos de cámara de Boyden se utilizaron para evaluar la
in vitro
tropismo de HB1.F3.C1 células a medio condicionado por células tumorales o para el control de medios de comunicación, usando métodos estándar. Brevemente, las células se tripsinizaron HB1.F3.C1 transducidas con un MOI de 0, 5, 10 o 20 AdCMVrCE, se lavaron, y se resuspendieron en DMEM que contenía 5% de BSA. Las células (3 × 10
4 células /100 l) se colocaron en cámaras superior e neuroblastoma medio condicionado por células en las cámaras inferiores. celular acondicionado Neuroblastoma medio tanto en las cámaras superior e inferior compone el control quimioquinesis sin un gradiente de quimioatrayente. Las células se dejaron migrar durante 4 horas en una incubadora de cultivo de células a 37 ° C y 5% de CO
2. El número de células HB1.F3.C1 migrados en la cámara inferior de cada pocillo se cuantificó usando CyQuant GR colorante fluorescente (Chemicon) y un lector de microplacas de fluorescencia (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Los ensayos se realizaron por triplicado.
Los estudios en animales
neuroblastoma diseminada se produce mediante la inyección de 5 × 10
5 NB-1691, NB-1643, o células SK-N-AS en el venas de la cola de los ratones. Típicamente estos ratones requieren eutanasia ~ 75 días después de la inyección de células de neuroblastoma. tumores brutos en múltiples órganos son visibles en la necropsia. Este modelo neuroblastoma metastásico ha sido bien caracterizada y es altamente reproducible con respecto a la evolución de la enfermedad y la implicación de órganos [34]. Además, el modelo recapitula el patrón clínico de neuroblastoma metastásico en que los tumores se desarrollan en loci múltiples, incluyendo la glándula adrenal, médula ósea y el hígado.
Cada grupo de tratamiento incluía 10 ratones, monitoreados diariamente por la presencia de la enfermedad o mala salud. El programa semanal de la administración de células HB1.F3.C1 y CPT-11 (7,5 mg /kg) se ilustra en la Figura 8. Este régimen se administró durante 2 semanas consecutivas, seguido de un período de descanso de 2 semanas y luego otro 2- curso de una semana de terapia. Todos los animales protocolos fueron aprobados por la Ciudad de la Esperanza o de Investigación Infantil St. Jude Hospital de IACUC. Cuando los ratones parecían estar en malestar o angustia como se juzga por el personal de cuidado de animales independientes sin conocimiento del diseño de protocolo, se sacrificaron los animales. Todos los ratones sacrificados fueron verificadas como portadores de tumores mediante la necropsia. El punto final para el estudio terapéutico fue la supervivencia a largo plazo.
células SK-N-AS (5 × 10
5) transducidas para expresar luciferasa se inyectaron en las venas de la cola.
Uno meses después de la inyección de las células tumorales, los ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal con luciferina y la imagen usando un sistema de imagen Xenogen IVIS, según las instrucciones del fabricante.
tumores múltiples estuvieron presentes en el 100% de los ratones.
Dos ratones representativos.
neuroblastoma humano se inyectan por vía intravenosa células tumorales para producir tumores diseminados.
En un momento apropiado después de la inyección de células de neuroblastoma, células madre neurales o progenitoras neurales las células transducidas con adenovirus para expresar una enzima activadora del profármaco (en este estudio, una forma secretada de la carboxilesterasa conejo [RCE]) se inyectan por vía intravenosa.
Después de la migración de las células madre o células progenitoras de focos tumorales y un retraso de 3-4 días para permitir la expresión nivel relativamente alto de la enzima activadora del profármaco en el medio extracelular en los sitios tumorales, los ratones son tratados con el profármaco (en este estudio, CPT-11).
el profármaco se activa selectivamente en focos tumorales, para aumentar el índice terapéutico del profármaco
(a) hígado disecado de un animal representativo con metástasis hepáticas.; el animal fue sacrificado dos días después de la inyección de las células HB1.F3.C1 en la vena de la cola.
(B) bajo y (C) de alta potencia de magnificación de una sección del hígado afectados por el tumor, se tiñeron con . hematoxilina y eosina
Las células tumorales aparecen (flechas negras) de color púrpura oscuro; . Tejido normal aparece de color rosa
(D) Sección de hígado teñidos con un anticuerpo anti-proteína mitocondrial humano y de contraste con hematoxilina
micrometástasis tumorales se tiñen de color marrón oscuro (flechas rojas).; tejido hepático normal es de color púrpura.
(E) La inmunofluorescencia microscopía de la sección del hígado.
HB1.F3.C1 células fueron CM-Dil-etiquetados antes de la inyección y son evidentes como los glóbulos rojos.
La sección del hígado fue teñido con DAPI; focos tumorales se identifican por zonas de núcleos de células tumorales DAPI-manchado densamente empaquetadas.
Las flechas rojas muestran células HB1.F3.C1 extravasated proximal de la vena hepática (v).
El recuadro es de alta magnificación de una célula HB1.F3.C1 DiI marcado dentro del tumor. (M-H) sección del hígado de un animal portador de un tumor que recibieron células HB1.F3.C1 marcados con CM-Dil se tiñó con un anticuerpo específico mitocondrial humano conjugado con FITC
.
(F) Red CM-Dil HB1.F3.C1 células -etiquetados.
(G) La misma sección que muestra marcada con FITC (verde) células tumorales humanas y células HB1.F3.C1.
(H) superposición de (células CM-Dil roja HB1.F3.C1) F y G (verde FITC HB1.F3.C1 y células tumorales).
HB1.F3.C1 células (células de color naranja /amarillo indicadas por las flechas blancas) migrado a micrometástasis hepáticas (células verdes) y infiltrado en el parénquima tumoral en la proximidad de un vaso sanguíneo (bv, líneas de puntos blancos)
barras de escala:. 1 cm (a), 2 mM (B), 500 micras (C), 200 m (F, G), 100 micras imagen
radiografía de la extremidad posterior de un ratón con (D, E, H), 10 micras (E recuadro). neuroblastoma en estadio avanzado (Día 82; panel de la izquierda, la barra de escala: 1 cm)
Confirmación de la masa tumoral como humano SK-N-AS células de neuroblastoma se realizó por inmunohistoquímica usando anticuerpo anti-mitocondria humana (que no se muestra. )
las células HB1.F3.C1 marcados con CM-Dil (glóbulos rojos, inyectados en la vena de la cola de 3 días antes del sacrificio) localizada al tumor en la médula ósea (panel de la derecha.; barra de escala:. 200 micras) guía empresas
Detección concordantes de v-
myc gratis (células HB1.F3.C1) por PCR y la expresión de TH (células de neuroblastoma) por RT-PCR en muestras de médula ósea.
muestras de médula ósea aisladas de animales inyectados con células HB1.F3.C1 se analizaron para la presencia de v-
myc
(células HB1.F3.C1) o la expresión de TH (células NB-1643).
HB1.F3.C1 células estaban presentes en la médula ósea sólo cuando las células tumorales también estuvieron presentes.
no se detectaron células HB1.F3.C1 en la médula ósea de los animales no portadores de tumores
.
los controles positivos (+) se extrajeron el ADN de las células HB1.F3.C1 para v-
myc
, y el ARN extraído de NB -1691 células TH para
Los controles negativos. (-) no contenían plantilla de ADN o ARN, respectivamente
normal y los órganos fueron cosechados, se seccionaron y se tiñeron con portadores de tumores. DAPI. HB1.F3.C1 células no se detectaron en el riñón normal (A) cerebro, (B), (C) corazón, (D) delgado, o (E) tejido de la piel.
Rare, solo, HB1. se observaron células F3.C1 (flechas blancas) en (F) pulmón, (G) y de hígado (H) bazo
barras de escala:. 200 micras (a-e), 100 m (F-H) .
las barras representan el número medio de células migradas ± SEM de los pocillos por triplicado en ensayos de cámara de Boyden modificadas.
Un día antes de ser utilizado en los tratamientos, las células fueron transducidas con la construcción de AdCMVrCE (ver texto).
el esquema de tratamiento se basó en el curso temporal de la expresión de la forma secretada de RCE, después de la transducción adenoviral de células HB1.F3.C1 (Danks, observación no publicada) y en un programa de administración de CPT-11 que ha demostrado ser relativamente eficaz para los pacientes con neuroblastoma [35].
análisis estadísticos
Todos los datos fueron analizados con el software GraphPad Prism (San Diego, CA). Los análisis de los resultados de la migración celular (número de células ± S.E.M. significar.) De las células no transducidas se compararon con la de las células transducidas con adenovirus. Estos datos se analizaron mediante un dos colas
t-test
. El análisis de Kaplan-Meier parcelas comparó la supervivencia de los 10 ratones por grupo utilizando un método de log-rank (Mantel-Haenszel).
Resultados
modelo de ratón de neuroblastoma metastásico
intravenosa inyección de 5 × 10
5 NB-1691, NB-1643, o células de neuroblastoma SK-N-AS humano produce difundido neuroblastoma en 100% de los ratones SCID esterasa deficientes. La naturaleza diseminada de tumores es evidente en la Figura 1 en dos ratones que recibieron inyecciones de la cola de la vena de células SK-N-AS transducidas para expresar luciferasa. Un mes después de la inyección de células de neuroblastoma, el sustrato luciferina luciferasa se inyectó por vía intraperitoneal para visualizar tumores
In situ
. De acuerdo con informes publicados, los tumores estaban presentes en múltiples órganos y localizaciones anatómicas, incluyendo abdomen, la médula ósea, el hígado y los pulmones [21], [34]. Desde 100% de los ratones inyectados con células de neuroblastoma disemina la enfermedad que finalmente resulta en la muerte, este modelo facilita la evaluación de los experimentos terapéuticos que se llevaron a cabo de acuerdo con el esquema en la figura 2. Esta figura ilustra la hipótesis a comprobar. Los ratones inyectados con células de neuroblastoma humano desarrollan múltiples tumores. Dos semanas después de la inyección de células de neuroblastoma, células HB1.F3.C1 transducidas con adenovirus que codifica una enzima activadora de profármaco se administran por vía intravenosa. Tres días más tarde, después de HB1.F3.C1 células han localizado preferentemente a los sitios tumorales y la enzima activadora del profármaco (RCE en este estudio) se expresa en niveles altos, se inicia profármaco (CPT-11) administración, determinado en una óptima predeterminada programar. La eficacia antitumoral de profármaco solo se puede comparar entonces con la co-administración de células HB1.F3.C1 y profármaco, usando la supervivencia como criterio de valoración.
localización de las células HB.F3.C1 a Neuroblastoma Tumor en el hígado
para confirmar primero que HB1.F3.C1 células migran hacia y localice en los tumores de neuroblastoma difundidos, los ratones con tumores establecidos NB-1643 fueron inyectados por vía intravenosa con 2 × 10
6 CM-Dil etiquetados HB1.F3. C1 células. Después de 3 días, los órganos normales y portadores de tumores se cosecharon y se seccionaron, y se evaluaron microscópicamente. Como se muestra en la figura 3, múltiples tumores fueron evidentes mediante inspección bruto en el hígado de un ratón representativo (panel A), y también por evaluación microscópica de las secciones con hematoxilina /eosina manchado (paneles B y C, las áreas de color púrpura) y la tinción de inmunoperoxidasa para humana proteína mitocondrial (panel D, áreas marrones). HB1.F3.C1 células co-localizada con estos focos tumorales, como se demuestra por las células marcadas con Dil-CM, rojo visto en el panel E. Este panel también muestra la extravasación de las células HB1.F3.C1 y su migración fuera de la vena hepática (v). Panel F muestra HB1.F3.C1 NSC (CM-Dil-etiquetados, rojo) y el panel G muestra misma sección teñida con el anticuerpo mitocondrial-FITC humanos (NSC humanos y células tumorales, verde). Panel H, una superposición de los paneles F y G, demuestra co-localización de las células HB1.F3.C1 (naranja /amarillo, indicado por flechas blancas) y células tumorales (verde), en los sitios inmediatamente adyacente a y distante del vaso sanguíneo (BV). Se observaron resultados similares para los tumores en varios otros órganos, como el ovario (no se muestra) y la médula ósea (Figura 4).
HB1.F3.C1 Las células de neuroblastoma Localizar a metástasis en la médula ósea
Dado que la médula ósea es un sitio frecuente de metástasis de neuroblastoma y aspirados de médula ósea o biopsias se usan para documentar el estado de la enfermedad en pacientes de alto riesgo, hemos tratado de determinar si las células HB1.F3.C1 también se infiltraron en los tumores en este sitio. El panel izquierdo de la figura 4 muestra la radiografía del fémur de ratón que lleva un tumor macroscópico que se originó en la médula ósea. Este animal se inyectó por vía intravenosa con células HB1.F3.C1 marcados con CM-Dil y la eutanasia tres días más tarde. El área del hueso indicado por el rectángulo rojo se procesa entonces para la microscopía de inmunofluorescencia. El panel derecho de la Figura 4 muestra claramente HB1.F3.C1 células (fluorescencia roja) la infiltración de la médula ósea que tiene un tumor, la documentación de que estas células migran hacia y co-localizada con tumores macroscópicos (Figura 4), así como tumores microscópicos (Figura 3 ). Sin embargo, si bien es interesante, hemos considerado que es más importante y relevante para demostrar la migración de las células HB1.F3.C1 a tumores microscópicos en la médula ósea (Figura 5), como enfermedad en la recaída se cree que se origina a partir de células tumorales residuales presentes en la médula ósea o en los sitios primarios. También, es esencial para la aplicación clínica exitosa de este enfoque para demostrar que las células HB1.F3.C1 no están presentes en el tejido normal (Figuras 5, 6).
Evidencia molecular para HB1.F3.C1 Cell y tumor Cell Co-localización en la médula ósea
para hacer frente a la primera de estas dos preguntas, se evaluó la migración de las células HB1.F3.C1 a las células tumorales en la médula ósea, utilizando un enfoque molecular sensible para detectar la presencia de números mínimos de células tumorales y /o células HB1.F3.C1. Para este fin, se cosecharon ósea de ratones que habían sido inyectados por vía intravenosa con células NB-1691, seguido de HB1.F3.C1 células dos semanas más tarde. Como se señaló anteriormente, en esta "etapa" de la enfermedad, los tumores no son detectables al microscopio. A continuación, utiliza PCR para detectar la v-
myc
gen presente en HB1.F3.C1 células y RT-PCR para detectar la tirosina hidroxilasa (TH), un marcador celular de neuroblastoma. Los datos en la Figura 5 muestran que, o bien tanto v-
myc
y TH o ninguno de estos marcadores se detectaron en ninguna ósea dado. Si la médula ósea contiene células tumorales como se indica mediante una señal detectable de células TH, HB1.F3.C1 (una señal positiva para v-
myc
) también estuvieron presentes. Por el contrario, cuando no se detectaron células de neuroblastoma, células HB1.F3.C1 fueron igualmente indetectable. Esta "co-localización" se produjo dentro de 1 hr después de la inyección y persistió durante al menos 7 días. Estos datos son consistentes con los resultados en las figuras 3 y 4, y muestran que las células migran HB1.F3.C1 rápidamente a las células tumorales
in vivo
.
HB1.F3.C1 pocas células están presentes en el tejido normal
para que la terapia sea-selectiva del tumor, sino que también era esencial para demostrar que las células HB1.F3.C1 no migrar a otros tejidos normales. En consecuencia, 2 × 10
se inyectaron 6 células marcadas con CM-Dil por vía intravenosa en ratones con tumores NB-1643 y después de 3 días, todos los órganos se recogieron y se evaluaron para la presencia de células HB1.F3.C1. La Figura 6 demuestra que pocas, si alguna, las células HB1.F3.C1 estaban presentes en el cerebro normal, riñón, corazón, intestino o tejido de la piel (paneles A-E, respectivamente). De vez en cuando, se observó una sola célula en el pulmón, hígado o bazo (paneles F-H, respectivamente), pero no el enfoque de la fluorescencia de CM-Dil fue visto en cualquier tejido normal de cualquiera de los cinco ratones examinados. Llegamos a la conclusión de que las células migran HB1.F3.C1 selectivamente a células de neuroblastoma después de la inyección intravenosa.
Eficacia terapéutica para el tratamiento del neuroblastoma metastásico
Una vez establecido que las células son HB1.F3.C1 a tumores trópico
in vivo
, que evaluó la eficacia antitumoral de nuestra neuronal madre /progenitoras enzima profármaco dirigida por células (NDEPT) enfoque de la terapia, usando HB1.F3.C1 células transducidas para expresar una forma secretada de un conejo carboxilesterasa (RCE) y el profármaco anticanceroso CPT-11. En primer lugar confirmó, utilizando ensayos de cámara de Boyden modificadas, que la transducción adenoviral y expresión de RCE no alteran las propiedades de las células trópico HB1.F3.C1 (Figura 7). También se determinó que el nivel máximo de expresión de RCE se produjo 3-4 días después de la transducción (datos no mostrados). A continuación, las células transduced HB1.F3.C1 con adenovirus de replicación deficiente que codifica ICE, y se inyecta por vía intravenosa las células transducidas en ratones con tumores SK-N-AS diseminados. Los ratones se trataron según el protocolo mostrado esquemáticamente en la Figura 8. Como se muestra en la figura, cuatro días después de la inyección de las células HB1.F3.C1 + AdCMVrCE (tres días después de la inyección de las células HB1.F3.C1), se inició el tratamiento con CPT-11 (7,5 mg /kg) en un diario x 5 calendario, un calendario óptimo de administración para los pacientes con neuroblastoma. Este tratamiento se repitió la semana siguiente, seguido de un período de descanso de 2 semanas y luego otro curso de 2 semanas de la terapia. El gráfico de Kaplan-Meier en la Figura 9 muestra los datos de supervivencia de los ratones no tratados en comparación con los ratones tratados con CPT-11 solamente, o con la combinación de células que expresan HB1.F3.C1 RCE y CPT-11.