Múltiple
Extracto
Sólo en los últimos años tiene la fosfolipasa A
2 enzimas (PLA
2 s) surgió como objetivos cancerosas. En este trabajo, se presenta la primera detección de elevados PLA
2 actividades en el plasma de pacientes con cáncer colorrectal, de pulmón, de páncreas y cáncer de vejiga en comparación con los controles sanos. conjuntos independientes de muestras de plasma clínicos se obtuvieron a partir de dos sitios diferentes. El primer conjunto era de pacientes con cáncer colorrectal (CCR; n = 38) y controles sanos (n = 77). El segundo conjunto era de pacientes con cáncer de pulmón (n = 95), la vejiga (n = 31), o los cánceres de páncreas (n = 38) y controles sanos (n = 79). PLA
2 actividades se analizaron por un método de ensayo de fluorescencia cuantitativa validado y el subtipo PLA
2 actividades se definen en la presencia de inhibidores selectivos. El natural de PLA
2 la actividad, así como cada subtipo de PLA
2 la actividad se elevó en cada grupo de cáncer en comparación con los controles sanos. PLA
2 actividades se incrementaron en etapa tardía frente a casos de estadios tempranos en el CCR. PLA
2 actividades no fueron influenciados por el sexo, el tabaquismo, el consumo de alcohol, o el índice de masa corporal (IMC). Las muestras de los dos sitios independientes confirmaron los resultados. Plasma PLA
2 actividades tenía aproximadamente el 70% de especificidad y sensibilidad para detectar el cáncer. El valores de orientación de PLA
2 La actividad del marcador y se han sugerido
Visto:. Cai H, Chiorean EG, Chiorean MV, Rex DK, Robb BW, NM Hahn, et al. (2013) elevada de fosfolipasa A
2 Actividades en muestras de plasma de cánceres múltiples. PLoS ONE 8 (2): e57081. doi: 10.1371 /journal.pone.0057081
Editor: Mohammad O. Hoque, Johns Hopkins University, Estados Unidos de América
Recibido: 27 de septiembre de 2012; Aceptado 17 de enero de 2013; Publicado: 22 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Cai et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo está apoyado en parte por el Proyecto de Ingeniería de tratamiento del cáncer, Departamento de Defensa, USAMRMC, W81XWH-08-1-0065 y 10-1-0540 W81XWH-(http://www.grants.gov/search/search.do?mode = AGENCYSEARCH & amp; = agencia del Departamento de Defensa), así como los Institutos nacionales de Salud R21 CA133744 (http://www.cancer.gov/researchandfunding) y la Fundación Caritativa Mary Fendrich Hulman de YX. Los fondos para el Grupo de Oncología Estudio Hoosier fue proporcionado por la Fundación Instituto del Cáncer Walther, Indianapolis, IN. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia. Los autores han llenado una solicitud de patente PCT "actividad PLA2 como marcador de ovario y otros cánceres ginecológicos" en 2011. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
el cáncer es una de las principales causas de enfermedad en todo el mundo. Se prevé que más de 1,6 millones de nuevos casos de cáncer y más de 577.000 muertes por cáncer se producen en los Estados Unidos en 2012 [1]. El cáncer de pulmón (LC) y el cáncer colorrectal (CCR) se encuentran entre los tipos más frecuentes de cáncer. De páncreas y de vejiga cánceres cuentan para (3-7% de todos los cánceres), pero el cáncer de páncreas (CP) es uno de los cánceres más muertas, con una tasa de supervivencia a 5 años de pésimo 6% [1]. El éxito de los tratamientos actuales contra el cáncer depende en gran medida el momento del diagnóstico, con la detección temprana y la identificación de poblaciones de pacientes de alto riesgo que resulta en las supervivencias globales más favorables en estas enfermedades [1], [2]. Se espera que la detección precoz y el diagnóstico de las poblaciones de pacientes de alto riesgo pueden tener un impacto más significativo en la alteración de la supervivencia global de estas enfermedades. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de métodos de detección temprana eficientes y sensibles [3]. Mientras que los métodos de detección basados en imágenes, incluyendo la tomografía computerizada espiral axial (TC) y la colonoscopia son métodos de detección temprana eficaces para la LC y el CRC, respectivamente [4], son más bien caro e inconveniente. Además, las técnicas de imagen modernas tienen una alta incidencia de descubrimiento de nódulos pulmonares, muchos de los cuales son falsos positivos, pero todavía pidiendo exámenes adicionales y, a veces dolorosas [5]. enfoques moleculares para el diagnóstico de cáncer a través de biomarcadores medidos por medios no invasivos podrían mejorar significativamente la especificidad y la sensibilidad de la detección del cáncer [5]. En particular, los biomarcadores serológicos pueden ser los más útiles en la detección temprana debido a la mínima invasividad, la rentabilidad y conveniencia. Por otra parte, los biomarcadores serológicos identificación de nuevos genes y /o moléculas relacionadas con el cáncer puede proporcionar nuevos conocimientos sobre la biología del cáncer y también pueden convertirse en objetivos atractivos para el tratamiento [3].
fosfolipasa A
2 enzimas (PLA
2s) son las principales enzimas que producen la COX-2) de sustrato de la ciclooxigenasa-2 (, ácido araquidónico (AA), así como lisofosfolípidos. Ambas clases de productos son moléculas de señalización implicadas en el cáncer. Sin embargo, sólo en los últimos años tienen PLA
2 s surgió como objetivos de cáncer [6]. Más de 30 enzimas que poseen PLA
2 o actividad relacionada se han identificado en los mamíferos [7]. Se dividen en cuatro grupos basados en su localización celular, especificidad de sustrato, y el calcio-dependencia [8], incluyendo citosólica (la cPLA
2), independiente de calcio (iPLA
2), secretada (sPLA
2), y asociada a lipoproteína PLA
2 (Lp-PLA
2). En el cáncer, la mayor parte de la atención se ha centrado en el SPLA
2 y la cPLA
2 [8]. Nosotros y otros han demostrado que iPLA
2 es funcionalmente implicados en la promoción del desarrollo de cáncer de ovario (CO) y otros tipos de cáncer,
e in vitro
in vivo
[9] - [ ,,,0],13]. SPLA
2 y Lp-PLA
2 se secretan enzimas. Por el contrario, tanto la cPLA
2 y iPLA
2 son enzimas citosólicas y su existencia extracelular sólo se ha demostrado estar relacionada con exosomas de células RBL-2H3 (una línea de células mástil y basófilos) [14]. Los exosomas son vesículas de membrana 40-100 nm de diámetro liberados de cuerpos multivesiculares por células intactas y son conocidos para participar en la señalización intercelular [15]. Recientemente hemos detectado extracellular- y libre de exosome iPLA
2 y la cPLA
2 actividades en la ascitis y tejidos de pacientes OC [16].
En el presente trabajo nos hemos centrado en PLA
2 actividades en lugar de expresión de cada PLA
2 enzimas y examinado PLA
2 actividades en muestras de plasma sanguíneo de pacientes con diferentes tipos de cáncer, en comparación con los de los controles sanos. Utilizamos nuestra cuantitativo validado recientemente, conveniente PLA
2 Método de ensayo altamente reproducible, [16] y demostramos por primera vez que el plasma PLA
2 actividades de los pacientes con CCR, LC, PC, y el cáncer de vejiga (BC) fueron significativamente más altos que los de los controles sanos. Además, PLA
2 actividades se correlacionaron con las fases del tumor en el CCR. Otros factores influyentes potenciales, incluyendo el sexo, la edad, el tabaquismo y el consumo de alcohol también fueron examinados en este estudio.
Materiales y Métodos
Humano de recogida de muestras y procesamiento
Dos conjuntos de se obtuvieron muestras de plasma clínicos recogidos de forma independiente para este estudio. El primer conjunto de la Universidad de Indiana Facultad de Medicina (IUSM) se centró en pacientes con CRC y controles sanos seleccionados mediante colonoscopia y resultaron negativos para pólipos adenomatosos y CRC. Las muestras de sangre recogidas en presencia de EDTA se centrifugaron a 1750 g durante 15 min a 15-24 ° C, se dividió en alícuotas en tubos Eppendorf siliconados y se almacena a -80 ° C. El segundo conjunto de muestras fue de pacientes con cáncer de pulmón, la vejiga o el cáncer de páncreas, así como los controles sanos. Estas muestras fueron recogidas por el Grupo de Oncología de Indiana (HOG) en Indianápolis, IN como parte del estudio titulado, "una muestra biológica Colección Protocolo de pacientes con y sin metástasis de órganos sólidos Tumores malignos: Hoosier Oncology Group BANK09-138 Estudio". Las muestras de sangre se centrifugaron a 3500 rpm durante 30 min. Las muestras se dividió en alícuotas se almacenaron a -70 ° C. HOG es una organización de investigación médica sin fines de lucro. A pesar de que es una entidad separada, IUSM es una organización de apoyo para las citas de mesa y aprobaciones IRB para HOG. Tres protocolos IRB separados para la recogida y /o usar las muestras de sangre relacionados con este trabajo han sido aprobados por los mismos IUSM Junta de Revisión Institucional (números de protocolo: 0670-81, 0808-24, 0905-20). formularios de consentimiento informado por escrito se obtuvieron de todos los sujetos y se han realizado todas las investigaciones clínicas de acuerdo con los principios expresados en la Declaración de Helsinki.
Reactivos e inhibidores
El PLA sustrato
2 1 -O- (6-Dabcilo-aminohexanoil) -2-O- (6- (12-BODIPY-dodecanoil) aminohexanoil) -sn-3-glicerilo fosfatidilcolina (DBPC) era de Echelon Bioscience (Salt Lake City, UT, EE.UU.) . lactona bromoenol (BEL) y metil arachidonylfluorophosphonate (MAFP) eran de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EE.UU.).
PLA actividad
2 enzimática
análisis
PLA
2 actividades se analizaron mediante el DBPC sustrato fluorescente, un sustrato fluorogénico fosfatidilcolina [17]. Las muestras de plasma (0,1 mu l) se mezclaron con DBPC (0,2 g en PBS) a volumen final de 200 mL. La fluorescencia se leyó a intervalos durante varias horas en un lector de placas Victor 3V
(Perkin Elmer, Waltham, MA, EE.UU.). PLA
2 actividades se expresaron como cambio en la intensidad de fluorescencia /min /l de plasma. Como se ha descrito anteriormente [16], se seleccionaron las condiciones para distinguir PLA
2 la actividad deriva de diferentes subtipos: a) el "natural" PLA
2 de actividad sin ningún tipo de aditivos exógenos, b) el IPLA
2 en la actividad la presencia de EDTA 5 mM (un quelante de cationes divalentes para bloquear todo el PLA
2s que requiere calcio, incluyendo sPLA
2 y la cPLA
2), c) el 2 actividad sPLA
en la presencia de 1,2 cloruro mM de calcio (la concentración de calcio ionizado natural en sangre [18]) y MAFP (10 M, un inhibidor dual de la cPLA
2 y iPLA
2), y d) la 2 actividad la cPLA
en el presencia de 100 mM de cloruro de calcio y lactona bromoenol (BEL, 10 M, un inhibidor selectivo de iPLA
2).
Análisis estadístico
Las variables categóricas se resumieron como cuenta con los porcentajes y continua las variables se resumieron como medias con desviaciones estándar (SD) a través del control sano, y grupos de cáncer. Se utilizó la prueba de Chi-cuadrado para evaluar las asociaciones entre los estados de enfermedad y covariables categóricas tales como el sexo, la raza, el tabaquismo y consumo de alcohol. Para las covariables continuas, tales como la edad y el IMC, un modelo lineal se utilizó para probar la diferencia global y Student
t-test
se utilizó para probar la diferencia de pares a través de estados de enfermedad. La regresión lineal se utilizó para evaluar la asociación entre univariado PLA
2 mediciones y covariables. Se utilizó regresión logística para evaluar el rendimiento de la clasificación de PLA
2 mediciones. Bootstrap se utilizó para validar internamente la clasificación de rendimiento utilizando muestras de 1000 [19]. Cada muestra tenía el mismo tamaño que el conjunto de datos original y se utilizó para desarrollar el modelo. Los resultados fueron analizadas en los datos originales. Las áreas bajo la curva (AUC) se calcularon para cada repetición. Todas las pruebas fueron de dos caras. Dado el carácter exploratorio de este estudio, no se adoptaron ajustes para comparaciones múltiples.
Los valores P Restaurant & lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Todos los análisis se realizaron utilizando el software SAS versión 9.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC, EE.UU.).
Resultados
Datos demográficos Asunto
Los datos demográficos para el estudio los participantes se resumen en la Tabla 1. Para las muestras conjunto IUSM CRC, el 41,7% de los participantes en general eran hombres, el 88,7% eran blancos, y la edad media fue de 53,1 años. La edad, el sexo, y la composición de la raza no fueron significativamente diferentes en el control vs. grupos CRC (
valores de p & gt; 0,05, Tabla 1). Para el segundo conjunto de muestras, la edad en el grupo de control sano fue significativamente menor de cada uno de los tres grupos de cáncer (Tabla 1). Aunque los machos eran dominantes en cada grupo, no fueron significativamente diferentes de la segunda serie de controles sanos. 71,2% de los participantes en general eran hombres, el 90,4% eran blancos, y la edad media fue de 58,3 años (Tabla 1).
reproducibilidad y estabilidad de la PLA
2 ensayos
Hemos validado recientemente la naturaleza cuantitativa del PLA a base de DBPC
2 ensayos y optimizado las condiciones de fluidos biológicos y muestras de tejidos [16]. Cuando cada uno de 8 muestras de plasma representativos se analizaron tres veces, el PLA
2 valora la actividad reproducible, con una desviación media estándar (DE) de 13,5 (1,3%). También probamos la estabilidad PLA
2 la actividad mediante la comparación de ellos en las muestras antes de su almacenamiento a los que en las mismas muestras se almacenaron a -80 ° C durante un mes, así como el efecto de la congelación-y-descongelación en el PLA
2 actividades en 8 muestras representativas. Como se informó anteriormente [16], PLA
2 actividades se mantuvieron estables con desviaciones estándar & lt; 35,8 (5,8%). Además, hemos demostrado que, en presencia de todos los otros componentes del ensayo, incluyendo inhibidor (s) utilizado en este estudio, pero en la ausencia de sangre u otras muestras biológicas, la hidrólisis no específica del sustrato DBPC fue negativa y insignificante (datos que no se muestra).
El PLA naturales
2, la cPLA
2, iPLA
2, y el SPLA
2 actividades eran elevados en las muestras de cáncer en comparación con los controles sanos
sangre iPLA
2 y la cPLA
2 actividades no han sido reportados previamente en muestras humanas. Analizamos lo natural PLA
2 (definido como el PLA
2 actividades medidas en las condiciones y sin ningún modificador, que puede ser inferior a la suma del subgrupo PLA
2 actividades medidas en condiciones modificadas), como así como la cPLA
2, iPLA
2, y el SPLA
2 actividades en las muestras de plasma.
a excepción de la salud frente a la cPLA CRC
2 la actividad, todas las demás comparaciones mostró que PLA
2 actividades fueron significativamente elevados en los grupos de cáncer (fig. 1A y 1B). PLA valores
2 la actividad en muestras de plasma de LC, AC, y los pacientes con CP no fueron significativamente diferentes (
P
valores & gt; 0,05): perfil
Comparación de PLA
2 actividades. en el control sano (colonoscopia normal, n = 77) y el CRC (n = 38) grupos. A. Comparación de PLA
2 actividades en los sanos (n = 79) y otros grupos de cáncer. El cáncer de pulmón (LC, n = 95), cáncer de vejiga (BC, n = 31) y el cáncer pancreático (PC, n = 38). La distribución de los grupos naturales e individuales de PLA se analizaron
2 actividades como se describe en Materiales y Métodos. Los valores medios de PLA
2 actividades fueron presentados por el signo "+" en la figura. *
P Hotel & lt; 0,05; **
P Hotel & lt; 0,01; ***
P
. & Lt; 0,001
Desde el SPLA
2 es secretada, se esperaba que el SPLA
2 la actividad explicaría la mayor parte de la PLA
2 la actividad detectada en la sangre. Sin embargo, en nuestros resultados, los altos niveles de iPLA
2 y la cPLA
2 y los bajos niveles de sPLA se observaron
2 actividades en todas las muestras de plasma. exosomas sanguíneos pueden ser los portadores de estas actividades [15]. Utilizamos las etapas de centrifugación diferencial como lo hemos descrito recientemente [16] para determinar si estas actividades podrían estar asociados con las plaquetas, los exosomas, u otros microvesículas. Dos muestras de sangre se centrifugaron primero a 1.750 g durante 15 min para eliminar la mayoría de las células de sangre y el sobrenadante se denominan S1. S1 se centrifugó a 20.000
g
de 20 min, lo que resultó en S2 y el sedimento 2 (P2; fragmentos de células y grandes vesículas). S2 se ultracentrifugó a 110.000
g
durante 2 horas, lo que resultó en S3 y P3 (exosomas). Una última centrifugación de S3 a 200.000
g
durante 2 horas dio lugar a S4 y P4 (microvesículas otros). Se encontró que todos los PLA
2 actividades se mantuvieron en el S1 a S4 fracciones, sugiriendo que eran "libres" y no está asociada con microvesículas (datos detallados no presentados). Esto es similar a lo que hemos informado recientemente en la ascitis de cáncer de ovario humano y nuevos mecanismos de secreción de iPLA
2s y la cPLA
2 s pueden estar involucrados [16].
Los parámetros clínicos y PLA
2 actividades en las muestras de plasma con cáncer
Curiosamente, la natural, iPLA
2, y el SPLA
2 actividades en plasma de pacientes con CRC se incrementaron en pacientes con las etapas finales (III y IV) en comparación con anterior etapa (I y II) enfermedad (
P = 0,0335
, 0,0367, 0,0778, y 0,0345 para PLA
2, iPLA
2, la cPLA
2, y el SPLA
2 , respectivamente; Fig. 2), lo que sugiere que estas actividades enzimáticas pueden estar implicados en la progresión del CRC. Se compararon las muestras (n = 14) PLA
2 actividades en el colon (n = 24) vs. rectal. A pesar de la naturaleza, así como el subgrupo PLA
2 actividades en los pacientes con cáncer de colon fueron más altos que los de los pacientes con cáncer rectal, las diferencias no fueron estadísticamente significativas (
P Hotel & gt; 0,05 en todos los casos ; Tabla 2). Además, no se encontraron diferencias en PLA
2 actividades entre los diferentes subgrupos de pacientes con CRC con tratamientos previos (cirugía, quimioterapia, radioterapia o sin tratamiento; Tabla 2). En contraste, se encontró que PLA
2 actividades no estaban correlacionados con cualquiera de las etapas T o N de LC, AC, o PC (Tabla 3).
Los grupos naturales e individuales de PLA
2 actividades se aumentaron progresivamente por etapa de tumor. Etapa I y II (n = 7), de la etapa III y IV (n = 31). * Prueba t de Student,
P
. & Lt; 0,05
Impacto de otros factores de PLA
2
actividad
han recogido otros factores que podrían influir en PLA
2 actividades, como el tabaquismo, el consumo de alcohol, y el índice de masa corporal (IMC). Para el estudio de CRC, a partir de los 80 sujetos con la información disponible fumar (27 CDN y 53 casos sanos), la mayoría (96%) de las personas no fumaba cuando se recogieron las muestras, con un promedio de 50,5% de las personas nunca habían fumado y el 45,7% del pasado fumador, y sólo el 9,4% y el 19,2% tenían personas de segunda mano exposición al tabaco en cada grupo. Los estados de fumadores se distribuyeron de manera similar en los dos grupos (
P
valores & gt; 0,05; datos detallados en la Tabla 4) y no hubo diferencias estadísticas en PLA
2 actividades entre los diferentes estados de fumar (figura 3A. ). En el segundo grupo de estudio, los estados de fumadores fueron significativamente diferentes entre los controles sanos y cada uno de los grupos de cáncer con mayores porcentajes de personas que se encontraban en curso, anterior o fumadores de segunda mano en grupos de cáncer (P
valores & lt; 0,05, excepto en una comparación, la Tabla 5). Sin embargo, no se observaron diferencias estadísticas en el PLA
2 actividades entre los diferentes estados de fumadores, que apoyan el concepto obtenido a partir de la primera serie de estudios que el plasma PLA
2 actividades no se ven afectados por el tabaquismo (Fig. 3B).
Las actividades PLA2 en muestras sanas y CRC con diferentes estados de fumadores (a) y los estados de segunda mano para fumadores (b). A. Comparación de las actividades PLA2 entre diferentes estados de fumadores (a) y los estados de segunda mano para fumadores (b) en los participantes con LC, AC y PC.
El consumo de alcohol en el grupos CRC control y no fueron significativamente diferentes (Tabla 4). Los consumidores de alcohol en los grupos de CRC tienden a tener niveles más altos de plasma PLA
2 actividades, pero las diferencias no fueron estadísticamente significativas (Fig. 4). Sin embargo, debido al bajo número de grupo de consumo no alcohol (n = 7), debemos interpretar estos datos con cautela. Para otros tipos de cáncer, se obtuvieron resultados similares. Aunque hubo importantes porcentajes más altos de los sujetos de consumo de alcohol en otros grupos de cáncer (Tabla 5), el EPL
2 actividades no fueron significativamente relacionados con el alcohol (Fig. 5).
Comparación de las actividades PLA2 entre " grupos alcohol "con los participantes sanos y CRC sin alcohol" y ". A. Comparación de las actividades PLA2 entre "sin alcohol" y "alcohol" groupsin la segunda serie de estudios con sana, LC, AC, y los participantes de PC.
Comparación de la actividad PLA2 en hombres y mujeres en los sanos y los grupos de CRC. A. Comparación de la actividad PLA2 en hombres y mujeres en los grupos de cáncer y otras sanas. También se presentan datos de todos los sujetos en cada grupo de estudios.
Las diferencias en PLA
2 actividades entre sexos no alcanzó una significación estadística en el cáncer de ningún grupo de control o en cualquier conjunto de estudios (Figs. 5A y 5B). De manera similar, no había diferencia o correlación en PLA
2 actividades en los sujetos con un IMC & lt; 25 vs. IMC ≥25 grupos en el estudio CRC (. Figuras 6A y 6B), aunque el índice de masa corporal media en el CRC y los grupos de PC fueron significativamente menores que los de los grupos de control (Tablas 4 y 5)
El objeto en los grupos sanos y CRC se dividieron en dos grupos:. IMC de 18,5 a & lt; 25 (para todos los sujetos, n = 43) y BMI & gt; 25 (Para todos los sujetos, n = 80). A. El objeto, en los grupos de cáncer y otras sanas se dividieron en dos grupos: BMI≤25 (Para todos los sujetos, n = 80) y el IMC & gt; 25 (Para todos los sujetos, n = 148) guía empresas
la edad es uno de los factores de riesgo más claramente identificadas para desarrollar CCR y otros tipos de cáncer. La Sociedad Americana del Cáncer y el Grupo de Trabajo de Servicios Preventivos de Estados Unidos recomiendan que las personas reciben evaluaciones de colonoscopia cada 10 años a partir de los 50 años lo tanto, analizados los efectos de la edad sobre PLA
2 actividades dividiendo los sujetos en dos grupos (edad y lt; 50 años, n = 37 y ≥ 50 años, n = 78). Aunque hubo una tendencia al aumento de PLA
2 actividades en el ≥ 50 años de edad, grupo en el grupo de CRC, las diferencias no fueron estadísticamente significativas (Fig. 7A). Del mismo modo, no se detectaron diferencias entre los dos grupos de edad en la LC, AC, y juego de PC, aunque cuando se combinaron todos los sujetos (incluyendo los controles sanos), hubo aumentos significativos en PLA
2 activa en los sujetos de mayor edad ( La Fig. 7B)
Los participantes en los grupos sanos y CRC se dividieron en dos grupos:. edad & lt; 50 (Para todos los sujetos, n = 42) y edad ≥50 (Para todos los sujetos, n = 153). Se realizó la prueba t de Student para analizar las diferencias entre estos dos grupos. A. Los participantes en grupos de cáncer sanos y otros se dividieron en dos grupos: edad & lt; 50 (Para todos los sujetos, n = 61) y la edad ≥50 (Para todos los sujetos, n = 144). Se realizó la prueba t de Student para analizar las diferencias entre estos dos grupos. *** P & lt;. 0.001
Una comparación directa de los dos conjuntos de controles sanos mostró que a pesar de su sexo, edad, tabaquismo de segunda mano, y el consumo de alcohol eran diferentes, no hubo diferencias en cualquier PLA
2 actividad medida (Tabla 6). Esto además apoyos que el plasma PLA
2 actividades no se ven afectados de manera significativa por la edad, sexo, consumo de alcohol y /o fumar.
El rendimiento de clasificación de plasma PLA
2 actividades
se utilizó regresión logística para evaluar el rendimiento de la clasificación de PLA
2 actividades en los cánceres. Los cuatro PLA
2 mediciones se mantuvieron como predictores independientemente de su significado. Las actuaciones de clasificación fueron resumidos por el receptor de funcionamiento (ROC) curvas características (Fig. 8). fórmulas de predicción se generaron utilizando las estimaciones de los parámetros.
casos de CCR en comparación con sujetos sanos. A. Todos los tipos de cáncer en comparación con sujetos sanos en el segundo set. cáncer de pulmón vs B. sujetos sanos. cáncer de vejiga C. vs sujetos sanos. cáncer pancreático D. vs. sujetos sanos. . E. Todos los tipos de cáncer en comparación con todos los sujetos sanos con combinados dos conjuntos
La fórmula de predicción para separar los casos de CCR de sujetos sanos es: donde "
P>
CRC" gradas para la probabilidad de tener CRC. La curva ROC se muestra en la Fig. 8A tiene un área bajo la curva (ABC) = 0,7502
.
Desde validaciones externas requerirían un estudio independiente, que en vez adoptado métodos internos para validar las actuaciones de clasificación. Entre los diferentes métodos de validación interna, se ha demostrado que la rutina de carga supera navaja de bolsillo, la validación cruzada y los métodos de división de datos [19]. Por lo tanto, se adoptó de arranque para su validación. En particular, la fórmula de predicción se obtuvo mediante el ajuste del mismo modelo para cada muestra bootstrap. La fórmula se aplicó a los datos originales para calcular las probabilidades de predicción. El rendimiento para esta muestra de arranque en particular fue resumida por el ABC de la curva ROC. El rendimiento global fue evaluada con un resumen de las AUC a través de 1.000 muestras bootstrap. En el 95% de las 1000 muestras bootstrap, AUC son mayores que 0,7143 para CRC vs. saludable. Por lo tanto, estos resultados confirman internamente las actuaciones de clasificación de los modelos desarrollados anteriormente.
La fórmula de predicción y la curva ROC para separar los casos de cáncer de sujetos sanos en el segundo grupo de estudio son los siguientes y se muestra en la Fig. 8B, con un rendimiento AUC = 0.8337.This fue validado en 1000 bootstrap muestras. En el 95% de las 1000 muestras bootstrap, AUC son superiores a 0.8205 para LC, PC, BC combinado frente al segundo conjunto de controles sanos.
Las fórmulas de predicción y las curvas ROC para la LC separada, BC, y cajas de la PC de sujetos sanos en el segundo grupo de estudio se enumeran a continuación y las figuras. 8C a 8E, con AUC & gt; 0,811, lo que indica un buen rendimiento de clasificación de las pruebas. Para el LC en comparación con controles sanos, el AUC = 0,8119 (Fig. 8C). En 95% de la muestra 1000 bootstrap, AUC son más altos que 0.7923.For BC versus control sano, el AUC = 0,8624 (Fig. 8D). En el 95% de la muestra bootstrap 1000, las AUC son más altos que 0.8161.For PC versus control sanos, el AUC = 0,8671. En el 95% de la muestra bootstrap 1000, las AUC son superiores a 0.8426.
Por último, ya que hemos encontrado que el PLA
2 actividades fueron esencialmente ninguna diferencia en los dos conjuntos de controles sanos, que combina todos controles sanos y todos los casos de cáncer en ambos grupos de estudios y generan una fórmula combinada, con una AUC = 0,8011 (Fig. 8F). En el 95% de las 1000 muestras bootstrapped, AUC son más altos que 0.7907.The sensibilidades y especificidades se pueden obtener de las curvas ROC mostradas en la Fig. 8. Para el conjunto de CRC de estudio, la sensibilidad del 60,5% y 77,9% de especificidad se obtuvieron (Tabla 7). Para el 2
nd conjunto de estudio y los datos combinados para ambos conjuntos, sensibilidades & gt; 80% y las especificidades & gt;. Se obtuvieron 66% de todos los casos (Tabla 7) guía empresas
El posibles contribuciones de otros factores
a pesar de que la mayoría de los otros factores demográficos y /o ambientales analizadas no fueron significativamente diferentes en los grupos de cáncer y de control (figuras 3-7), probamos sus posibles contribuciones al rendimiento cuando se evalúan en los niveles individuales. Hemos mantenido los cuatro PLA
2 mediciones en los modelos, pero vamos a otros predictores sujetos a modelar selecciones a nivel significativo de 0,05.
La fórmula de predicción y la curva ROC para separar CRC de sujetos sanos en la primera conjunto de estudio son los siguientes y se muestra en la Fig. 9A, con un AUC = 0,8162. En el 95% de la muestra bootstrap 1000, las AUC son más altos que 0.7589.The fórmula de predicción y la curva ROC para separar los casos de cáncer de sujetos sanos en el segundo grupo de estudio son los siguientes y se muestra en la Fig. 9B, con un rendimiento AUC = 0.9728.This fue validado en 1000 bootstrap muestras. En el 95% de las 1000 muestras bootstrap, AUC son superiores a 0.9625 para LC, PC, y BC combinado frente al segundo conjunto de controles sanos.
casos de CCR en comparación con sujetos sanos. A. Todos los casos de cáncer en comparación con sujetos sanos en el segundo set. cáncer de pulmón vs B. sujetos sanos. cáncer de vejiga C. vs sujetos sanos. cáncer pancreático D. vs. sujetos sanos. E. Todos los tipos de cáncer en comparación con todos los sujetos sanos con combinados dos conjuntos.
Las fórmulas de predicción y las curvas ROC para la LC por separado, antes de Cristo, y los casos de PC de sujetos sanos en el segundo grupo de estudio son se enumeran a continuación y las figuras. 9C a 9E, con AUC & gt; 0,968, lo que indica altas sensibilidades y especifica de las pruebas. Para el LC en comparación con controles sanos, el AUC = 0,9742. En el 95% de la muestra bootstrap 1000, las AUC son más altos que 0.9598.For BC versus control sanos, el AUC = 0,9682. En el 95% de la muestra bootstrap 1000, las AUC son más altos que 0.9398.For PC versus control sanos, el AUC = 0,9907. En el 95% de la muestra bootstrap 1000, las AUC son superiores a 0.9740.
Por último, ya que encontramos que el PLA
2 actividades fueron esencialmente ninguna diferencia en los dos conjuntos de controles sanos, que combina todos sanos controles y todos los casos de cáncer en ambos grupos de estudios y generan una fórmula combinada, con una AUC = 0,9140 (Fig. 9F). En el 95% de las 1000 muestras bootstrap, AUC son más altos que 0.9018.The sensibilidad y especificidad obtenidos con estas curvas ROC con parámetros adicionales se incrementan a & gt; 85% (excepto CRC vs casos sanos, Tabla 7).
Discusión
En este trabajo, hemos presentado las primeras mediciones de plasma natural y subtipo PLA
2 actividades y sus actuaciones como marcadores potenciales para cuatro tipos de cáncer diferentes, CRC, LC, aC y PC. Hemos medido las PLA
2 actividades en más de 20 muestras de sangre con o sin la adición de calcio 1,2 mM (la concentración de calcio ionizado natural en la sangre) para las mezclas de ensayo finales y no detectó diferencias significativas. Por lo tanto, definimos los PLA
2 actividades obtenidos sin ningún tipo de aditivos como el "natural" PLA
2 la actividad. Hemos seleccionado las condiciones óptimas para medir cada sub-familia de PLA
2 actividades. Estas condiciones modificadas no coexisten en la sangre. Por lo tanto, no es sorprendente que la suma de la subfamilia de PLA
2 actividades es mayor que el PLA
2 la actividad "natural". Sin embargo, es importante señalar que aunque se utilizaron condiciones modificadas para obtener las actividades para las subfamilias de PLA
2s, los resultados finales son de los naturales PLA
2s presentes en las muestras de sangre.
Aunque las ventajas de la utilización de marcadores serológicos convenientes son obvias, no hay marcadores de la sangre fiables para cualquiera de estos tipos de cáncer están actualmente disponibles. Por CRC, el desarrollo /validación de métodos de detección no invasivos o mínimamente invasivos es un foco importante en el campo. Los métodos actuales incluyen heces y de sangre, tales como pruebas de inmunoquímica fecal (FIT) y la prueba de sangre oculta en heces basada en guayaco (GOT). Aunque la especificidad es alta (& gt; 85%), estas pruebas tienen una sensibilidad baja (& lt; 23%) para adenomas colorrectales y son por lo tanto poco probable que sea capaz de aumentar la detección temprana de CRC [20], [21]. análisis de materia fecal detectan mutaciones genéticas en las heces que se pueden encontrar en el CCR. Se encontró una prueba de 21 cambio genético que es superior a prueba de guayaco sangre oculta en heces (gFOBT) para la detección de CCR [20].