Extracto
Por otra parte longitudinalmente variantes de varios oncogenes y supresores tumorales han demostrado ser importantes para su tumorigenicidad. En el presente estudio hemos probado si la proteína serina-arginina quinasa 1 (SRPK1), un importante regulador de los factores de empalme, está implicado en la progresión del cáncer de ovario y desempeña un papel en la quimio-sensibilidad. Por análisis de Western blot, se encontró que la proteína SRPK1 que se sobreexpresa en 4 de las 6 líneas celulares de cáncer de ovario en comparación con una línea celular epitelial de ovario inmortalizado superficie; y en 55% de las muestras de tumor de ovario en comparación con muestras de tejido de ovario no neoplásicas. Reducción de la expresión SRPK1 utilizando pequeños ARN de interferencia (siRNA) que codifica pequeña horquilla de ARN en las células de cáncer de ovario llevado a (i) la reducción de la tasa de proliferación celular, la progresión del ciclo celular más lento y su capacidad de crecimiento y la migración de anclaje independiente comprometida
in vitro
, (ii) disminución del nivel de fosforilación de múltiples proteínas serina-arginina, y P44 /42MAPK y proteínas AKT, y (iii) aumento de la sensibilidad a cisplatino. En conjunto, estos resultados sugieren que la expresión SRPK1 elevada puede jugar un papel en la tumorigénesis de ovario y SRPK1 puede ser un objetivo potencial para la terapia del cáncer de ovario
Visto:. Odunsi K, Mhawech-Fauceglia P, C Andrews, Beck A, Amuwo O, Lele S, et al. (2012) elevada expresión de la proteína serina-arginina quinasa 1 génica en el cáncer de ovario y su papel en cisplatino citotoxicidad
in vitro
. PLoS ONE 7 (12): e51030. doi: 10.1371 /journal.pone.0051030
Editor: Sandra Oršulić, el Cedars-Sinai Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: Septiembre 4, 2012; Aceptado: 23 de octubre de 2012; Publicado: December 7, 2012
Derechos de Autor © 2012 Odunsi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud Subvenciones CA 107303 (RH), Fundación del cáncer Ginecológico (RH), DK60632 (JDB), y CA16056 (RPCI Core subvención); Cancer Research Institute /Instituto Ludwig para la Investigación del Cáncer vacuna contra el cáncer de Colaboración Grant (KO); y Hilton-Ludwig metástasis del cáncer de subvención del Instituto Ludwig para la Investigación del Cáncer (KO). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
se ha estimado que 35 a 59% de los genes humanos están empalmados alternativamente, lo que contribuye en gran medida a la complejidad de las funciones celulares humanos [1], [2]. Por lo tanto, no es sorprendente que las actividades de algunos oncogenes y genes supresores de tumores son modulados por splicing alternativo [3], [4]. Por ejemplo, corte y empalme alternativo aberrante de ciertos supresores de tumores, como el cáncer de mama 1 y 2 (BRCA1 /2) [5], el tumor de Wilms 1 (WT1) [6], y la poliposis adenomatosa coli (APC) [3], da como resultado mutaciones que dan cuenta de susceptibilidad hereditaria y esporádica al cáncer. Además, se han encontrado ciertos factores de empalme que se sobreexpresa en los tumores y han sido implicados como onco-proteínas [7], [8].
SRPK1 (serina-arginina de la proteína quinasa 1) pertenece a la SR quinasa familia de proteínas y regula la familia SR de factores de empalme. Los factores de empalme SR son algunas de las proteínas auxiliares que se requieren para el empalme de pre-ARNm en células de mamífero. AR proteínas se caracterizan por uno o dos motivos de reconocimiento de ARN en el extremo N-terminal y un dominio SR-rico en el terminal C [9], [10], [11]. El dominio SR se piensa que la promoción de interacciones proteína-proteína durante el montaje [12]. AR proteínas son reguladas por fosforilación reversible mediado por SRPK1. Si bien se requieren proteínas SR fosforilados para iniciar el montaje spliceosome en la primera etapa, la desfosforilación es esencial para el empalme que tendrá lugar en el spliceosome [13], [14]. La evidencia ha demostrado que tanto la hipo e hiper-fosforilación de las proteínas SR van en detrimento de empalme [14], [15]. Por lo tanto, el nivel de SRPK1 es crucial para mantener el equilibrio adecuado entre la AR proteínas fosforiladas y desfosforilado. La sobreexpresión de la proteína SRPK1 se ha documentado en tipo aguda en adultos leucemia de células T [16], la leucemia mielógena crónica [17] de páncreas, mama y cánceres de colon [18], [19], [20]. Curiosamente, SRPK1 se expresa en células germinales masculinas de adultos, pero generalmente no en la mayoría de otros tejidos adultos normales, lo que sugiere a /testículo-como distribución del cáncer [16], [21]. En conjunto, estos estudios sugieren que SRPK1 es probable que desempeñe un papel importante en el desarrollo del cáncer.
[22] y otros [23] han encontrado previamente que la inactivación de
SKY1
, el homólogo de levadura del factor de SRPK1 empalme, mejora la resistencia de las células de levadura para cisplatino (cDDP). Sin embargo, si la expresión SRPK1 juega un papel en la determinación de la sensibilidad o la resistencia de los tumores humanos a la quimioterapia sigue siendo poco claro por las siguientes razones. En primer lugar, el nivel inferior de expresión SRPK1 se ha demostrado que se correlaciona con la resistencia de ovario [23], testicular [20] y las líneas de células tumorales HT29 [24] para los regímenes de tratamiento que contienen platino. En segundo lugar, se ha demostrado recientemente que la interrupción de la expresión de siRNA SRPK1 aumenta la apoptosis provocada por CDDP en páncreas, colon y cáncer de mama líneas celulares [18], [19].
En el presente estudio se trató de examinar si la expresión SRPK1 se asocia con la progresión del cáncer de ovario, si el patrón de expresión de SRPK1 se correlaciona con las respuestas clínicas al tratamiento que implican cDDP y si la inhibición de SRPK1 altera la sensibilidad de células de cáncer de ovario a cDDP. En primer lugar, se encontró que el nivel de proteína SRPK1 elevada estaba presente en aproximadamente el 55% de las muestras de tumor de ovario en comparación con muestras de tejido de ovario no neoplásicas. En segundo lugar, la inhibición mediada por siRNA de SRPK1 condujo a una reducción de la tasa de proliferación celular Ovča,
in vitro
la migración celular, la progresión del ciclo en tumorigénicos potencial y más lento celular. Estos fenotipos se asociaron con alteraciones SRPK1 mediada de señalización /Akt vías de MAPK, ya que los niveles de proteína fosforilada (activada) MAPK /AKT se redujeron en las células SRPK1 desmontables. Finalmente, en contraste con el sistema de levadura, hicimos la observación sorprendente de que la inhibición de SRPK1 aumento de la sensibilidad al tratamiento cDDP, lo que sugiere que SRPK1 puede ser un objetivo para la terapia de cáncer de ovario.
Materiales y métodos
Declaración de Ética
el estudio en seres humanos se llevó a cabo bajo un protocolo aprobado por el Comité de Revisión Institucional RPCI (CIC0215). Todas las muestras de tejido se obtuvieron de pacientes que dieron su consentimiento informado por escrito.
Pacientes y muestras tumorales de ovario
muestras de tejido congelado
Flash (n = 47) fueron obtenidas de pacientes sometidos a cirugía de reducción de volumen para el cáncer de ovario epitelial en el Instituto del cáncer Roswell Park (RPCI), Buffalo, Nueva York entre 1995 y 2006. las muestras de ovario normal (n = 9) fueron obtenidas de pacientes sometidos a histerectomía por enfermedades benignas tales como leiomioma. la información clínico-patológico de toda la cohorte, incluyendo la respuesta a la quimioterapia, se mantiene en una base de datos en el Departamento de Oncología Ginecológica.
Cell Cultura y
líneas celulares de cáncer de ovario SKOV3 y OVCAR3 se obtuvieron de la American Colección de Cultivos Tipo (ATCC; Manassas, VA). A2780 y A2008 células y sus homólogos CDDP resistentes A2780 /CP [25] y A2008 /C13 [26] las células se obtuvieron del Dr. Steven Howell (Universidad de California, San Diego). Estas células se mantuvieron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS). Una línea no transformada superficial del ovario de células epiteliales (IOSE-385, denominado en adelante IOSE) fue inmortalizada con los genes tempranos de SV40 [27] y obtuvo del Dr. Nelly Auersperg (Universidad de British Columbia, Canadá). células IOSE se mantuvieron en M199 /MCDB 105 medio (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) suplementado con FBS al 5% y gentamicina (Invitrogen, Carlsbad, CA).
shRNA y rescate-SRPK1 Constructos
shSRPK1-1 y shSRPK1-2, codificación shRNA orientación nucleótidos 288-308 (CAAGAAGATCCTAATGATTA) y 1423-1443 (GGTCAGTCATTCAGTGAACAA), respectivamente, del ARNm SRPK1, se compraron de Abrir Biosystems (Huntsville, aL). Para la transfección, SKOV3 y A2780 /células CP se sembraron en placas de 6 pocillos a 80% de confluencia y se transfectaron con 3-4 g de ADN plásmido utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). ARN y proteínas de control o células transfectadas con shSRPK1 se analizaron 3 días después de la transfección. clones shSRPK1 estables fueron seleccionados por medio de 2 mg /ml de puromycine durante 3 semanas. Para plásmido SRPK1-rescate, un cebador que contiene 3 mutaciones silenct (GCAAGAAGATCCTAATGATTA, subrayado nucleótidos se cambió a G, G, C, respectivamente) dentro de las secuencias diana shSRPK1-1 se introdujo en el plásmido p-CMV-bandera-SRPK1 (un regalo de El Dr. Xiang Dong-Fu, Universidad de California, San Diego) usando PCR asimétrica [28]. La transfección se realizó como se describió anteriormente y se seleccionaron los conos estables utilizando G418 (Invitrogen, Carlsbad, CA).
Productos químicos
El cisplatino (CDDP,
cis-dicloro
-diammine platino II) y MTT {3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio} se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). solución Stock cDDP se preparó en DMSO (330 mM), se almacena como alícuotas a -20 ° C, y se utiliza dentro de 2 semanas. cDDP se diluyó adicionalmente en un medio antes de añadir a las células.
análisis de transferencia Western
De veinte a treinta miligramos de tejido tumoral congelado se homogeneizó con un mortero y mano de mortero en tampón de muestra de tejido (10% SDS , 5% β-mercaptoetanol, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10% de glicerol) para la extracción de proteínas. Los lisados celulares se extrajeron utilizando tampón RIPA (NaCl 150 mM, 1% NP-40, ácido 0,5% desoxicólico, 0.1% de SDS, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0). Las proteínas se resolvieron por 10% SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana de PVDF (Millipore, Billerica, MA) y se bloquearon en TBS que contiene 0,05% de Tween-20 y 5% de leche seca durante la noche a 4 ° C. Las transferencias se incubaron con anticuerpo primario durante 1 a 2 horas, y luego con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, las membranas se lavaron varias veces y las proteínas se visualizaron usando el kit ECL (quimioluminiscencia mejorada) (Pierce, Rockford, IL). Señal era digital de fotografiado y se cuantifica mediante densitometría con un generador de imágenes de Alpha (Alpha Innotech, San Leandro, CA). Los anticuerpos utilizados para detectar la SRPK1 era de BD Biosciences (San Jose, CA), proteínas SR fosforilados fueron mAB104 [29] aislado de células de hibridoma (ATCC, Manassas, Virginia), p44 total /42 MAPK y AKT (AKT1 /2/3 , sc-8312) eran de Señalización celular (Danvers, MA) y Santa Cruz, respectivamente, MAPKp42 fosforilada /44 (Thr
202 /Tyr
204) y AKT (Ser
473 /Thr
308) eran de Señalización celular (Danvers, MA), anticuerpos contra Upf1 fue un regalo del Dr. Harry Dietz (Universidad Johns Hopkins). Anti-actina fue de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Los datos se expresaron como la expresión veces en relación sobre actina.
tinción inmunohistoquímica
Secciones (4 m de espesor) de, tejido de ovario y tumor normal, embebido en parafina fijado con formalina se procesaron para IHC como se describe anteriormente [30]. La peroxidasa endógena fue bloqueada con 0,3% de peroxidasa de hidrógeno durante 30 min. La recuperación del antígeno se llevó a cabo en tampón de pH alto en un vapor para el anticuerpo SRPK1 (BD Biosciences). Para el control negativo, se utilizó el ratón-IgG.
transcripción inversa cadena de la polimerasa La reacción (RT-PCR) Análisis
ARN total fue extraído a partir de diez millones de células usando el reactivo Trizol (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. cDNA fue sintetizado a partir de 2 g de ARN total en el tampón de reacción de 20 l utilizando M-MuLV la transcriptasa inversa, Ribolock ribonucleasa inhibidor (Fermentas Ciencias de la Vida, Glen Burnie, MD) y cebadores hexámeros al azar después de la digestión DNasa. Los productos de ADNc se utilizaron para la PCR semi-cuantitativa utilizando Taq ADN polimerasa (Fermentas Life Science, Glen Burnie, MD) Los cebadores para SRPK1 (SRPK1-R, 5'-TGTTGTCCAGTGGTCCGTTA, y SRPK1-exon10, 5'-CAAGAAAAACTTGAAGAGTC) fueron diseñados de acuerdo con las secuencias de referencia NCBI. GAPDH (gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa) se utilizó como referencia la secuencia diana (cebadores: 5'-5 'y GAAGGTGAAGGTCGGAGTC GAAGATGGTGATGGGATTTC).
Clonigénicas Ensayo de Supervivencia
Las células (3 × 10
2) se sembraron en placas de 6 pocillos durante la noche y se trataron con cDDP durante 24 horas. Después de retirar el fármaco, las células se lavaron con PBS y re-alimentaron con medio libre de drogas y se incubaron durante 10-14 días. Las colonias se tiñeron con 0,1% de cristal violeta y se cuentan. la supervivencia celular Porcentaje se expresa en relación con el control sin tratar.
MTT Ensayo
Las células (5 × 10
3) se sembraron en placas de 96 pocillos por triplicado durante la noche y se trató con cDDP para 72 h, se añadió MTT durante 4 horas, y el colorante formazán se disolvió con DMSO y se leyó a 540 nm en un lector de microplacas FL6000- (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT). porcentaje de supervivencia celular se expresa en relación con el control sin tratar.
independiente de anclaje ensayo de crecimiento
Las células (5 × 10
3) se sembraron por triplicado en placas de 6 pocillos que contienen una capa superior de 0,3% de agar blando y una base de agar 0,5%. Veinticuatro hora más tarde, se determinó el número medio de células sembradas por campo contando las células en 5 campos diferentes bajo el microscopio de luz. Las colonias formadas (& gt; 0,1 mm de diámetro) después de 3 semanas de crecimiento en agar blando se contaron; 10 campos diferentes se cuantificaron por pocillo y se calculó el número medio de colonias por campo. El (crecimiento independiente de anclaje) de índice de AIG se expresó en relación al número de células sembradas.
Curación de heridas (raspadura) Ensayo
Las células fueron sembradas en placas de 60 mm hasta la confluencia y la célula monocapa se raspó en tres líneas rectas con una punta de pipeta de 200 l para crear "arañazos". Los escombros se retiró con PBS y después el cultivo se realimenta con medio fresco. Photohgraphs de la zona de la herida se tomaron a 0 y 28 h después de los arañazos para el cálculo de la tasa de migración celular. Se tomaron veinte mediciones aleatorias para cada punto de tiempo. Las distancias de migración de las áreas relativas de las heridas se midieron en las imágenes.
Ciclo Celular Análisis
Las células se sincronizan en fase G2 /M por tratamiento con nocodazol (600 ng /ml) durante 12 hr , se lavó dos veces con PBS y luego se libera en medio sin fármaco. Las células también se sincronizaron en G0 /G1 mediante la colocación en un medio libre de suero durante 48 hr. Se estimularon las células en reposo como para volver a entrar en el ciclo celular mediante la adición de 10% de FBS. En cada punto de tiempo indicado, se recogieron las células y se lavaron con PBS frío (solución salina tamponada con fosfato y se fijaron en etanol al 70% durante más de 15 min). Las células se trataron entonces con RNasa (50 mg /ml) en citrato de sodio 1,0% a 37 ° C durante 30 min y luego se tiñeron con yoduro de propidio (50 mg /ml) durante 15 min. contenido de ADN se midió con un analizador de células activadas por fluorescencia (FACScan citómetro de flujo, Becton Dickson, San Jose, CA). El porcentaje de células en cada fase del ciclo celular se determinó a través de los programas y Winlist Modfit (Verity Software House, Topsham, ME).
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó utilizando GraphPad Prism V4.03 Software y el estadístico Computing Environment R V2.7.0. Un
p-valor
inferior a 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Estudiante de
t-test
se utilizó para la mayoría de las comparaciones de SRPK1 ARN y la expresión de proteínas vs parámetros clínico. Los métodos de Kaplan y Meier y de Cox se utilizaron para estimar las razones de la mediana de tiempo de supervivencia y de peligro.
Resultados
Expresión SRPK1 es elevada en ciertas líneas celulares de carcinoma de ovario y tumores de ovario
Hemos encontrado previamente que la inactivación de la proteína quinasa de levadura SR Sky1p confiere resistencia al cisplatino [22]. Sin embargo, el nivel del gen SRPK1 humana ha sido positiva y negativamente correlacionada con la resistencia de las células tumorales a los regímenes de tratamiento que contienen platino [18], [19], [20], [23]. Hemos establecido para examinar más a fondo la relación entre el nivel de expresión del gen SRPK1 y resistencia CDDP en el cáncer de ovario humano (Ovča). Se utilizó por primera vez un semi-cuantitativos de RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa) el análisis de la expresión del ARN SRPK1 en 6 líneas celulares Ovča con sensibilidad diferencial CDDP (Figura 1, panel inferior). Algunos de los cuales eran al menos 6 veces más resistencia a CDDP que una línea de células epiteliales de la superficie del ovario no transformada (IOSE) que había sido inmortalizada con los genes tempranos de SV40 [27]. Los datos muestran que no hay una clara correlación entre el fenotipo de resistencia cDDP y los niveles de ARN de estos genes entre estas líneas celulares. Sin embargo, el nivel de mRNA SRPK1 fue elevado en 4 de cada 6 líneas de células, en comparación con la de las células IOSE (Figura 1A). A continuación se evaluó la expresión de la proteína SRPK1 en las líneas celulares antes mencionados utilizando el análisis de transferencia Western. El nivel relativo de proteína SRPK1 se determinó mediante la normalización con el de la actina limpieza de genes. La Figura 1B muestra que la proteína SRPK1 también es elevada en 4 de cada 6 líneas celulares de carcinoma de ovario (definidas como & gt; 2 veces por encima de la media de la muestra IOSE), aunque con un poco diferente patrón de la del ARN. Nos dimos cuenta de que las células inmortalizadas IOSE también expresan cierto nivel de SRPK1. Esto no es sorprendente ya que otros han demostrado también que la inmortalización de las células epiteliales de ovario, en comparación con las células de OSE humanos normales no inmortalizadas, aumenta la expresión de un factor de empalme, polypyrimidine proteína de unión del tracto-[8]. Al igual que en la expresión de ARNm, hemos encontrado ninguna correlación clara entre el fenotipo de resistencia a CDDP y el nivel de proteína SRPK1 entre estas líneas celulares. Dado que los niveles de genes en líneas celulares cultivadas a largo plazo pueden ser alterados, se analizó la expresión siguiente en SRPK1 archivados muestras tumorales de pacientes Ovča Ovča que fueron tratados con regímenes de platino después de la cirugía. Para evaluar la expresión específica de la proteína SRPK1 en el epitelio tumoral a nivel celular, se realizó tinción inmunohistoquímica (IHC) en secciones de tejido incluidas en parafina. La figura 2A muestra que la tinción SRPK1 era casi inexistente en el epitelio ovárico normal. Por el contrario, la tinción SRPK1 se detectó fácilmente en los tumores de ovario, con intensidad de tinción que van de débil a fuerte, y presente predominantemente en el citoplasma de las células epiteliales. La localización citoplásmica de SRPK1 en muestras de tumores OVC es similar a los hallazgos en las células de cultivo de tejido [15]. Dado que los tumores de ovario se componen en su mayoría de las células epiteliales, el nivel de SRPK1 en homogeneizados de proteínas de 47 tumor congelado y 9 muestras de tejidos no neoplásicos se investigó mediante análisis de transferencia Western. La Figura 2B muestra los resultados de inmunotransferencia 21 tumor y 9 muestras de tejidos no neoplásicos. Se realizó un análisis densitométrico de SRPK1 y los niveles de actina y el nivel de expresión relativa de SRPK1 se normalizó con el nivel de actina. Se encontró que 26 de los 47 (55%) casos SRPK1 sobreexpresado (definido como mayor que dos veces-por encima del promedio de las nueve muestras normales).
(A) reacción cuantitativa en tiempo real de transcripción inversa en cadena de polimerasa (RT-PCR), análisis de nivel de ARN SRPK1 de 6 células y células Ovča IOSE. GAPDH se utilizó para los controles de carga y la normalización. El cincuenta por ciento de concentración de inhibición del crecimiento (IC
50, M) de CDDP para las células Ovča se indicó panel inferior). (B) Análisis de transferencia Western de proteínas SRPK1 de 6 células y células Ovča IOSE. La banda inferior en la transferencia sondada con anticuerpo anti-SRPK1 es probablemente fragmento proteolítico de SRPK1. Las transferencias se volvieron a sondar con la actina, que se utilizó como control de carga y para la normalización. Gráfico representa la expresión relativa determinada por la medición densitométrica de las bandas y se expresa en relación a la actina. Gráfico de barras que se muestra es la media de 4 experimentos. La sobreexpresión de SRPK1 en Ovča se definió como más de 2 veces más de la media de las muestras IOSE y se marca con asteriscos.
(A) Tinción inmunohistoquímica para la expresión de proteínas SRPK1 en las secciones normales y tumorales de tejido de ovario . Las células con tinción positiva para el anticuerpo SRPK1 son de color marrón. Para el control negativo, se utilizó el host-IgG (no mostrado). E, epitelio; S, estroma. (B) Análisis de transferencia Western de la proteína SRPK1 en 21 muestras de ovario tumor (T), y 9 muestras de tejido de ovario no neoplásicas (N). Las muestras normales y tumorales en el panel más bajo fueron cosechadas a partir de dos manchas diferentes para el propósito de presentación. Las bandas más bajas en el blot se sondeó con anticuerpo anti-SRPK1 son probablemente fragmentos proteolíticos de SRPK1. plot (C) Box-Whisker con SRPK1 /actina doblez expresión deriva de análisis densitométrico de las bandas de Western blot. Barbas abarcan todos los tumores (n = 47) o las muestras normales (n = 9), cajas contienen 50% de los datos, y las líneas centrales de las cajas muestran las medianas. La media de la expresión fue comparada por el estudiante de
t-test
(p = 0,03).
La mayoría de los 47 pacientes evaluados presentó con tumores de grado 3 (91%), en el estadio IIIC (76%), y con la histología serosa (85%). La mediana de supervivencia para todos los pacientes fue de 39,7 meses {intervalo de confianza (IC), 26,5 meses-∞}, mientras que la mediana de la supervivencia libre de enfermedad, con exclusión de los pacientes con enfermedad persistente /progresiva después de la terapia inicial, fue de 17,5 meses (IC, 14,4-35,9 meses). El uso de un modelo de regresión de Cox no observamos una clara correlación entre el nivel de SRPK1 y global (p = 0,26) o la supervivencia libre (p = 0,62) en los pacientes con cáncer de ovario enfermedad. niveles SRPK1 no se correlacionaron con la histología, grado, o la respuesta clínica al régimen de quimioterapia CDDP que contiene. Sin embargo, la expresión pliegue relativa media de la proteína SRPK1 fue significativamente diferente entre muestras de tumor y las muestras normales (Figura 2C; muestras independientes t-test, p-valor = 0,03). Por lo tanto, nuestros datos indican que el nivel elevado de expresión de la proteína SRPK1 es un acontecimiento frecuente en las neoplasias epiteliales de ovario.
reducir el nivel de SRPK1 por Short horquilla de ARN Mejora cDDP citotoxicidad
Se ha demostrado que interrupción de la expresión SRPK1 por pequeños ARN de interferencia aumenta la apoptosis causada por cDDP en líneas de células pancreáticas, colon y cáncer de mama [18], [19]. Para probar si la precipitación del gen en las células SRPK1 Ovča afecta a su sensibilidad a cDDP, nos centramos en este gen en dos posiciones en el dominio quinasa con dos construcciones diferentes de ARN de horquilla corta (sh-SRPK1-1 y sh-SRPK1-2) en células SKOV3 y A2780 /CP, ambos de los cuales son relativamente más resistentes a la cDDP que las células IOSE y algunas otras líneas celulares Ovča (Figura 1A). Como controles, el vector pSM2-EV también se transfectó en ambas líneas celulares. La transfección transitoria (48 hr) de cualquiera de construir reduce específicamente el ARNm SRPK1 (datos no mostrados) y el nivel de proteína como se confirma por reprobing las transferencias de Western con anticuerpo contra una proteína no relacionada, Upf1, y la actina se utilizó como control de carga (figura 3A). El efecto inhibidor de la construcción shSRPK1-2 es más significativa que la de la shSRPK1-1. Usando el ensayo de color de formazán (MTT), la Figura 3B muestra que la reducción de la proteína en las células SKOV3 SRPK1 resultó en una mayor sensibilidad al tratamiento cDDP (prueba t pareada y * indica P & lt; 0,05). Para estudiar más a fondo el efecto quimio-sensibilizantes de la inhibición de SRPK1, generamos clones estables con diferentes potencias shRNA en células SKOV3. Se obtuvieron varios clones con reducido mRNA SRPK1 y proteínas tal como se evaluó mediante RT-PCR y análisis de transferencia Western, respectivamente. Dos de ellos se muestra en la Figura 3C, donde el nivel de proteína SRPK1 se redujo a aproximadamente el 60% (pshSRPK1-C4, dirigida por SH-SRPK1-2) o 20% (pshSRPK1-c5, dirigida por SH-SRPK1-1) del control células pSM2-EV. niveles SRPK1 en estos clones se correlacionan inversamente con su sensibilidad cDDP como se determina por el ensayo de formación de colonias (Figura 3D). Estos datos indican que SRPK1 juega un papel en la modulación de cDDP citotoxicidad
in vitro
y que la orientación nucleótidos 288-308 del ARNm SRPK1 resultó en un efecto de silenciamiento más fuerte.
células de cáncer de ovario fueron transitoriamente ( A) o de manera estable (C) transfectadas con o bien el plásmido shSRPK1 siRNA que codifica o el vector vacío (pSM2-EV). Los niveles de proteína de SRPK1, UPF1 y actina se determinaron por análisis de transferencia Western. se muestran transferencias representativos de tres experimentos independientes. (B) y (D) SRPK1 knockdown potencia la citotoxicidad del cisplatino. (B) Las células (5 × 10
4) se sembraron de nuevo 24 h después de la transfección, se trataron con varias concentraciones de cisplatino durante 48 horas y el número de células supervivientes se analizó mediante el ensayo de MTT. Supervivencia (%) se expresa en relación a las células pSM2-EV no tratados. (D) Los transfectantes estables (3 × 10
2) se sembraron por triplicado, tratados con cisplatino para la formación de 24 hr y la colonia se evaluó después de 10-14 días. Los datos se analizaron con un ANOVA camino y * indica P & lt; 0,05; bares, Dakota del Sur.
Desmontables de Expresión SRPK1 disminución de la proliferación celular y
in vitro
potencial tumorigénico de las células SKOV3
Los datos mostrados en la figura 3D también indican que las células con la reducción de expresión SRPK1 por shRNA creció más lento que las células de control pSM2-EV. Se formaron menos colonias que los del grupo de control no tratado, en ausencia de tratamiento CDDP. A fin de probar si la reducción de la expresión SRPK1 inhibe la proliferación celular de cáncer de ovario, el tiempo de duplicación de pSM2-EV y las células pshSRPK1-c5 fue comparado. tasa de proliferación celular se determinó en las células en crecimiento exponencial por tripsinización y de tripano de exclusión del colorante azul a las 24, 48, 72, y 96 horas después de chapado. La Figura 4A muestra que el tiempo de duplicación de pshSRPK1-c5 es aproximadamente 1,4 veces de las células de control pSM2-EV (31 hr vs. 22 hr). Esto fue confirmado por el ensayo de MTT (datos no mostrados). A continuación se investigó el potencial tumorigénico de SRPK1 utilizando el ensayo de anclaje independiente de crecimiento (AIG). desmontables células y de control SRPK1 se sembraron en agar blando y se dejaron crecer durante 3 semanas. La Figura 4B muestra que ambos clones shSRPK1 producen menos y más pequeñas colonias en agar blando, lo que sugiere una reducción de los
in vitro
tumorigenicidad. motilidad celular es uno de los factores que contribuyen a la invasión de células tumorales. Para probar si la capacidad de migración de las células se ve comprometida en las células SRPK1 desmontables, se realizó un
vitro
la migración de células en (cicatrización de heridas) de ensayo. La figura 4C muestra que la tasa promedio para la migración de células shSRPK1-c5 (5,8 ± 0,81 unidad) fue de aproximadamente 60% de los que por las células de control pSM2-EV (9,9 ± 1,5 unidad). En conjunto, nuestros datos indican que SRPK1 contribuye a la proliferación celular,
in vitro
la migración celular y el potencial tumorigénico de las células SKOV.
(A) Ensayo de proliferación celular. Las células (1 × 10
4) se sembraron por triplicado en una placa de 24 pocillos, se trataron con tripsina y se contaron en presencia de azul de tripano en los tiempos indicados. (B) ensayo de crecimiento independiente de anclaje. Las células (5 × 10
3) se sembraron en agar blando y se determinó el número de colonias 21 días después. También se muestran campos representativos de las colonias en placas de agar blando. Los datos mostrados son la media de tres experimentos independientes y se analizaron con la prueba t pareada; * Indica P & lt; 0,05, bares, Dakota del Sur. células SKOV3 se sembraron como control positivo. (C)
in vitro
ensayo de cicatrización de la herida. Las células confluentes se rayan con una punta de l-200 para generar alineaciones rectas lagunas. Las imágenes de las brechas se tomaron a 0 y 28 h y la anchura de los huecos (blanco-líneas de trazos) se midió con un microscopio de luz para calcular la tasa de migración de células. Imágenes representativas se muestran en las distancias migratorias izquierda y relativos (cierre de la herida) que se muestra a la derecha se calcularon a partir de 20 zonas de cada placa. Los datos mostrados son de tres experimentos independientes.
Los asteriscos
muestran diferencias significativas en comparación con el control (P
Hotel & lt; 0,05).
Desmontables de Expresión SRPK1 reducido de fosforilación de ciertas proteínas SR y MAPK /Akt Proteínas
AR proteínas son el blanco directo de SRPK1 [15]. Se espera que el patrón de fosforilación de estos factores de empalme SR a ser afectados en las células SRPK1 desmontables. Para probar esta predicción, análisis de transferencia Western utilizando un anticuerpo que reconoce un epítopo sartén fosfo-específico común a múltiples proteínas SR [29] se llevó a cabo. Como era de esperar, la expresión SRPK1 reducida dio como resultado niveles disminuidos de la fosforilación de ciertas proteínas SR en las células SKOV3 (Figura 5, panel central). Es interesante observar que las diferentes proteínas SR se ven afectadas entre clones shSRPK1-C4 y shSRPK1-C5. Por ejemplo, el nivel de SRp55 se redujo mucho más en shSRPK1c5 de que en las células shSRPK1-C4. Lo contrario es cierto para el SRp40 y SRp20. La caída diferencial de SRPK1 observó en estos dos clones (Figura 5, panel superior) puede dar cuenta de las diferencias en la fosforilación del sustrato. El nivel de la enzima SRPK1 puede determinar su reconocimiento de sustrato y la actividad catalítica. Las diferencias de nivel entre los clones SRPK1 shSRPK1-c4 y c5-shSRPK1 se reflejan también en la proliferación celular y la sensibilidad al cisplatino (ver más abajo) afectados por SRPK1 regulación a la baja.
Western blot se realizó en lisados preparados a partir de SKOV3 -derivado células pSM2-EV y dos clones SRPK1-desmontables estables. Los anticuerpos se utilizan para detectar las proteínas SR fosforilada (mAB104), MAPK42 /44 (Thr
202 /Tyr
204), y AKT (Ser
473 /Thr
308), así como las proteínas totales niveles de MAPK42 /44, y AKT.
es bien sabido que la activación, es decir, elevado nivel de fosforilación de MAPK (mitogen-activated proteína quinasa) y las vías de señalización AKT está involucrado en muchos tumores malignos ( 29, 30) y que estas vías regulan el procesamiento de pre-ARNm [31], [32]. El patrón de fosforilación de los dos transductores clave de señales de proliferación, p44 /42-MAPK (ERK1 y ERK2) y AKT se analizó en las células SRPK1 desmontables. La figura 5 muestra que las células pshSRPK1-C4 y pshSRPK1-C5 habían reducido los niveles de /42-MAPK (p-MAPK) y Akt proteínas p44 fosforilada (p-AKT). Por el contrario, la cantidad total de proteínas MAPK y Akt no se vio afectada por la inhibición de la expresión SRPK1. Los niveles reducidos de p44 fosforilada /42-MAPK y AKT correlacionadas con un crecimiento más lento de las células SRPK1 desmontables (Figura 4). Estos datos sugieren que SRPK1 juega un papel en la regulación del nivel de las formas activadas de MAPK y /o proteínas AKT.
Las células SRPK1-desmontables Exponer lenta progresión del ciclo celular
Los datos descrito anteriormente indican que la inhibición