Extracto
El glioblastoma multiforme (GBM) es el glioma maligno más común de adultos con un mal pronóstico debido a la resistencia a la radioterapia y la quimioterapia, lo que podría ser críticamente involucradas en la repoblación de las células madre del cáncer (CSC) después del tratamiento. Habíamos investigado las características de las células cancerosas madre similares a lado la población (SP) ordenados a partir de células GBM, y estudiado el efecto de honokiol la orientación de los CAC. GBM8401 células SP poseían los marcadores de células madre, como nestina, CD133 y Oct4, y las expresiones de los genes relacionados con stemness auto-renovación, como
SMO
,
Notch3
y
IHH (Indian Hedgehog)
. Honokiol inhibió la proliferación tanto de GBM8401 células parentales y células SP de una manera dependiente de la dosis, la IC
50 fueron 5,3 ± 0,72 y 11 ± 1,1 M, respectivamente. Las proporciones de SP en células GBM8401 fueron disminuidos por Honokiol de 1,5 ± 0,22% a 0,3 ± 0,02% y 0,2 ± 0,01% a dosis de 2,5 M y 5 mM, respectivamente. Las células SP parecía tener mayor expresión de
O
metiltransferasa 6-metilguanina-ADN (MGMT) y ser más resistentes a la temozolomida (TMZ). La resistencia a TMZ podría ser sólo ligeramente revertido por inhibidor de MGMT
O
6-bencilguanina (
O
6-BG), pero notablemente mejorado aún más mediante la adición honokiol. Esta mejora significativa fue acompañada con la mayor inducción de la apoptosis, una mayor regulación a la baja de
Notch3
así como sus aguas abajo
Hes1
expresiones en células SP. Nuestros datos indican que honokiol podría tener beneficios clínicos para los pacientes con GBM que son refractarios al tratamiento TMZ
Visto:. Lai IC, PH Shih, Yao CJ, Yeh CT, Wang Peng-J, Lui TN, et al . (2015) eliminación de las células de vástago como el cáncer y la potenciación de la temozolomida Sensibilidad por honokiol en células de glioblastoma multiforme. PLoS ONE 10 (3): e0114830. doi: 10.1371 /journal.pone.0114830
Editor Académico: Waldemar Debinski, Wake Forest University, Facultad de Medicina, Estados Unidos |
Recibido: Abril 1, 2013; Aceptado: 14 Noviembre 2014; Publicado: 12 Marzo 2015
Derechos de Autor © 2015 Lai et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación: Este estudio fue apoyado por las subvenciones del Ministerio de Salud y Bienestar, Taiwán (MOHW103-TD-B-111-01), Institutos de Investigación Nacional de Salud, Taiwán (03a1 CAPP33-014) y el Ministerio de Ciencia y Tecnología, Taiwán (NSC 100 a 2632-B -038-001-MY3). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
tumor cerebral maligno es uno de los cánceres más letales en adultos. Sobre la base de clasificación de la OMS, los tumores de grado I son biológicamente "benigna", mientras que los tumores de grado II son neoplasias de bajo grado con cursos clínicos más largos [1]. Grado III y IV son los gliomas malignos que son letales dentro de pocos años y 9-12 meses, respectivamente [2]. De alto grado (glioblastoma multiforme, GBM) glioma, el tumor cerebral más frecuente y maligno en adultos son típicamente resistentes a la radioterapia y la quimioterapia. La supervivencia de GBM después de la cirugía y la radioterapia se limitó en un año. La quimioterapia, tales como temozolomida (TMZ), podría prolongar aún más la supervivencia hasta unos veinte meses [3], pero la mayoría de los pacientes murieron dentro de los dos años. Por lo tanto, la búsqueda de agentes terapéuticos innovadores y el desarrollo de nuevas estrategias para los pacientes con GBM refractarios son imprescindibles y urgentes.
TMZ es un agente quimioterápico alquilante que se utiliza actualmente para el tratamiento del GBM. El beneficio terapéutico de TMZ depende de su capacidad de ácido nuclear alquilato /metilato, que más a menudo se produce en el extremo N-7 o O-6 posiciones de los residuos de guanina [4]. Esta metilación daña la replicación del ADN por mispairing
O
-6-alkylguanine con timina y provoca la muerte de las células tumorales. Se demuestra que las células de cáncer si expresa la mayor actividad de
O
metiltransferasa 6-metilguanina-ADN (MGMT), un ADN que la reparación de la enzima para eliminar aducto TMZ-DNA, puede disminuir la eficacia terapéutica de TMZ y parecen ser más resistente y refractario a la terapia TMZ. En combinación con un inhibidor de MGMT, O
6-bencilguanina (
O
6
-BG), puede aumentar la citotoxicidad de TMZ [3]. Sin embargo, el ensayo clínico de fase II de la
O
6-BG con TMZ no mostró beneficio de respuesta para GBM, excepto los pacientes con astrocitoma anaplásico (AA) [5]. Las razones para esta discrepancia puede ser debido a los diferentes comportamientos malignos incluyendo la presencia de mayor proporción de células madre de cáncer (CSC) en GBM [6]. Esta evidencia clínica dio origen a nuestra motivación para buscar cualquier terapéutica que es capaz de dirigir el CSC de GBM TMZ resistente.
La investigación para CSC o células iniciadoras de tumores (TIC) se convirtió en un campo interesante desde el año 2000. No importa qué tipo de los métodos que se utiliza para identificar el CSC, se había informado de varias líneas celulares de tumores sólidos que contienen CSC en el meduloblastoma, neuroblastoma, glioma, cáncer de mama, cáncer de colon y cáncer gástrico, etc. [7] también se ha demostrado que los pacientes con recurrencia y refractaria a TMZ correlacionados con la mayor proporción de CSC se mantuvo en la masa del tumor [6]. Por lo tanto, la búsqueda de nuevas terapias dirigidas en el CSC se convierte en una nueva estrategia para lograr un mejor resultado clínico de los pacientes con GBM refractarios.
células madre cancerosas poseen características de las capacidades de auto-renovación, la tumorigénesis y linaje diferenciación en células tumorales no madre así como la expresión de las proteínas de resistencia a múltiples fármacos. Además de utilizar marcadores CD para identificar células madre cancerosas, un método común para aislar el CSC es la técnica población lateral (SP), que se hizo más y más popular desde 2004. Esta técnica de clasificación para aislar células SP de doble longitud de onda citometría de flujo se basa en la capacidad de estas células para flujo de salida del fluorescente de unión a ADN de colorante Hoechst 33342 [8]. El fenotipo de células SP se caracteriza por una alta expresión de cáncer resistente a la proteína-1 (BCRP1 o ABCG2) de mama, una de las cassettes de transportadores de unión a ATP (ABC), que se asocia con la resistencia a múltiples fármacos en muchos tipos de cáncer mediante el bombeo de las drogas [ ,,,0],9]. Dado que la resistencia a múltiples fármacos es una característica importante de células madre cancerosas, también se ha demostrado que las células SP según se enriquecen de CSC [10]. Por lo tanto, la clasificación células SP se postula para ser una fuente rica de células madre cancerosas y representa una plataforma tecnológica para el cribado de la terapéutica que es capaz de apuntar en células madre cancerosas.
medicinas chinas tradicionales han sido ampliamente utilizados en el control de enfermedades desde hace miles de años .
Magnolia officinalis
, también llamado Houpo en chino o Salboku-tu en japonés, es un antiguo género distribuidas principalmente en el sur y el este de Asia, así como Oriente y Norte América. Varios compuestos activos derivados de sus ladridos habían sido identificados, tales como Magnolol, honokiol, 4 a
O
-methylhonokiol, Obovatol y otros compuestos neolignan, que poseía muchas diversas funciones biológicas, incluyendo la mejora de las reacciones alérgicas y asmáticas [11 ]. Honokiol, uno de los componentes bioactivos biphenolic, posee actividades multifuncionales, tales como antioxidante, anti-inflamatorio, quimiopreventivo y efectos neuroprotectores [12, 13, 14, 15]. Como informó la literatura, honokiol PI3K inhibido específicamente /mTOR señalización de activación en los gliomas [16]. Además, nuestros hallazgos recientes sugieren que honokiol podría viajar a través de la barrera sangre-cerebro-barrera (BBB), lo que indica el potencial para el tratamiento de los gliomas malignos [17]. Sin embargo, existe poca información sobre su efecto anti-cáncer contra las células GBM, en especial el efecto de los CAC.
En el presente trabajo, hemos investigado los efectos de honokiol en la eliminación de las células madre cancerosas y la inversión de la resistencia en TMZ GBM8401 células SP, y estudiado lo que los mecanismos subyacentes son responsables.
material y Métodos
células y Materiales
honokiol (5,3 'dialil-2,4' dihidroxibifenilo), sulfordamina B (SRB), Hoechst 33342, verapamilo, reserpina,
O
6
bencilguanina (
O
6
-
BG) y temozolomida (TMZ) fueron adquiridos de Sigma Aldrich (Shanghai, china). reactivo Trizol extracción de RNA se obtuvo de MdBio Co (Frederick, MD, EE.UU.). glioblastoma multiforme humana (GBM8401, BCRC Nº 60163) y glioblastoma humano /astrocitoma anaplásico (U-87 MG, BCRC Nº 60360) líneas celulares se obtuvieron de la Colección del Centro de Investigación y bio-(CRCB) de Taiwán Industria Alimentaria Instituto de Investigación y Desarrollo . Otros reactivos de alto grado fueron adquiridos de las empresas comerciales.
se mantuvieron Cell Cultura y
glioblastoma multiforme humano células GBM8401 con de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y glioblastoma /U87 astrocitoma anaplásico humano se mantuvieron las células MG en de Eagle medio esencial mínimo (MEM). Las células se mantuvieron en medio completo que contenía 10% de suero bovino fetal (FBS), 1 x aminoácidos no esenciales y 100 unidades /ml de penicilina /estreptomicina /
L-glutamina (Gibco, Invitrogen Corporation, Grand Island, NY, EE.UU. ) a 37 ° C en una atmósfera húmeda.
SRB se determinó la viabilidad celular ensayo
efecto de citotoxicidad de honokiol utilizando un SRB modificado colorimétrico ensayo de cribado contra el cáncer de drogas [18]. En pocas palabras, cantidades apropiadas de células fueron sembradas en placas de 96 pocillos de fondo plano en 200 l de medio. Después de un 24 h de incubación, las células se trataron con diferentes concentraciones de Honokiol (disuelto en DMSO, la concentración final se ajustó a menos de 0,05%), seguido de incubación durante 3 días más a 37 ° C, 5% de CO
2. a continuación, se aspiró el medio, y las células se fija sobre la subestructura de plástico por la adición de 100 l de ácido tricloroacético al 10% (TCA) e incubación durante 2 horas a 4 ° C. Las placas se lavaron cinco veces con agua para eliminar el TCA y durante al menos 1 h se secó al aire. Esto fue seguido por tinción con 200 l de 0,065% SRB (sulforrodamina B) durante 30 min a temperatura ambiente, se lava cinco veces con ácido acético al 1% para eliminar tinte no unido, y posteriormente secado al aire. colorante unido se disolvió con 200 l de Tris base 10 mM (pH 10,5). Se leyó la absorbancia en un espectrofotómetro a 570 nm.
aislamiento de la población lateral (SP) y No-SP (NSP) Las células
Identificación de lado la población se llevó a cabo con una ligera modificación como se describe anteriormente [19]. células MG GBM8401 o U-87 (10
6 /ml) se incubaron en medio que contiene Hoechst 33342 (5 mg /ml) con o sin control positivo (ABC inhibidor del transportador, verapamilo o reserpina) durante 3 horas a 37 ° C . Después de la incubación, las células se analizaron utilizando un sistema de clasificación de células fluorescentes activado con un software DIVA (FACSAria III, Becton Dickinson). Las células vivas fueron cerrada usando yoduro de propidio y se analizaron usando una combinación de un nm 450 (Hoechst Azul) y un 675 nm (Hoechst Red) filtrado después de la excitación con un láser NUV 350 nm. Las células SP fueron definitivamente identificados en el tratamiento de inhibidores específicos contra los transportadores de casete de unión a ATP. La población de células mayor, llamado células no-SP (NSP), se tiñó de manera significativa con Hoechst 33342. Ambas células SP-SP y no se clasificaron y se recogieron, respectivamente, para su posterior estudio. células SP se mantuvieron con medio HEscGro (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.) que contienen factor de crecimiento epidérmico (EGF, 10 ng /ml) más el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF, 8 ng /ml), pero sin ningún tipo de suero, y no SP las células se incubaron con medio DMEM completo.
análisis citométrico de flujo de la diferenciación y de la superficie celular marcadores
se seleccionaron las suspensiones de células individuales utilizando un FACScalibur 4-láser (BD Science) y se tiñeron con una variedad de anticuerpos contra marcadores CD que son altamente expresado en las células madre de cáncer: anti-humano CD24-FITC, anti-humano CD26-FITC, anti-humano CD29-FITC, anti-humano CD90-FITC, anti-humano CD133-PE, anti humana- CD44-PE. células parentales, SP y no SP se incubaron con anticuerpos específicos mencionados anteriormente durante 1 h, y luego se analizaron con citometría de flujo después del lavado. En el caso de estudio de la capacidad de diferenciación de células SP, se obtuvieron células de la SP diferenciado (d-SP) después del cultivo en medio completo durante una semana. La d-SP, SP y células parentales fueron incubadas con anticuerpos de tinte conjugado fluorescentes tales como anti-GFAP-PE y anti-MAP2B-Alexa Fluor488, respectivamente, por 1 h. Las intensidades de fluorescencia celular se analizaron después con citometría de flujo después del lavado. Todos los anticuerpos fluorescentes se compraron de BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU., excepto la antihumano CD24-FITC (eBioscience, San Diego, CA, EE.UU.).
análisis de PCR con transcripción inversa
las células fueron tratadas con honokiol o temozolomida durante 48 h, el ARN celular total se aisló utilizando MasterPure ARN kit de purificación (Epicentro biotecnologías, Madison, WI, EE.UU.) de acuerdo con los protocolos del fabricante, y luego cuantificados por absorbancia a 260 nm. La pureza del RNA se determinó usando la relación A260 /A280 (media ≥ 1,8). El ARN total de cada muestra fue primero transcrito de forma inversa en ADNc usando un equipo de MMLV Reverse Transcriptase primero-Strand cDNA Synthesis (Epicentre Biotecnologías), y luego los genes diana se amplificó utilizando Taq ADN polimerasa Master Mix (Ampliqon, Lars Quist, Dinamarca). Las muestras se sometieron a 30 ciclos de amplificación (la síntesis de ADNc a 37 ° C durante 1 h seguido de pre-desnaturalización a 94-C por 2 min, y la amplificación por PCR se realizó con desnaturalización a 94 C durante 30 s, hibridación a 58- 60 ° C durante 30 segundos, extensión a 72 ° C durante 1 min, y la extensión final a 72 ° C durante 10 min). Los productos de PCR se mezclaron con EZ-Vision DNA Dye (Amresco, Solon, OH, EE.UU.) y luego a electroforesis en un gel de agarosa al 1,8% y, finalmente visualizado por el Sistema de Transiluminadores UV-Visible. Los datos fueron cuantificados con el software Image J.
Western Blot
Después del tratamiento, los lisados celulares se prepararon utilizando ReadyPrep Kit de Extracción de proteínas (Bio-Rad) según las instrucciones proporcionadas. Los lisados de células totales (20 g) fueron separados por electroforesis por un gel de poliacrilamida SDS-PAGE 10% y se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno con el sistema de transferencia de Bio-Rad Mini-Protean. La membrana se recorta y se incubó durante la noche a 4 ° C con anticuerpos específicos frente a CD133 (Laboratorio Ltd de San Juan, Londres, Reino Unido), MGMT (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EE.UU.) y tubulina (Abcam, Cambridge, MA, EE.UU. ), respectivamente. Después de la incubación con anticuerpos primarios, las membranas recortadas se lavaron con TBST 3 veces y después se incubaron con anticuerpo secundario marcado con peroxidasa de rábano picante durante 90 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar con TBST 3 veces, la detección final se realizó con un aumento de quimioluminiscencia (ECL) reactivos de transferencia de Western (Minipore) y el sistema de imágenes BioSpectrum (UVP, Upland, CA, EE.UU.).
Evaluación de Ciclo Celular
Las células se trataron con Honokiol o temozolomida durante 48 h. Al final de la incubación, se recogieron y se fijaron con etanol al 70% durante la noche y después se incubaron con un IP 25 mg /ml células, 0,5% de Triton X-100, y 0,2 g /ml una de las ribonucleasas solución durante 30 minutos después de lavar con PBS frío . Finalmente, las células se resuspendieron en 500 l de PBS y después se analizaron por citometría de flujo (FC500 Cytomics, Beckman Coulter). Se recogieron datos de 10.000 células y evaluados por los softwares CXP.
Análisis estadístico
Se realizaron todos los experimentos al menos tres veces y los datos se presentan como la media ± desviación estándar. Las diferencias estadísticamente significativas se basaron en la comparación con los grupos no tratados, y se calcularon mediante un análisis de una o de dos vías de la varianza (ANOVA) y
t
software estadístico-test de Student. Los valores de p & lt; 0,05 se consideró significativo
Resultados
Aislamiento de células secundarios Población (SP) de GBM8401 y Líneas Celulares MG-87 U
La proporción de Verapamil-. células SP sensibles de GBM8401 o u-87 MG se analizó por citometría de flujo basado en la exclusión de la unión Hoechst 33342 tinte de ADN. Como se muestra en la Fig. 1, hay 1,3 ± 0,2% y 1,7 ± 0,3% de células SP detectados en U-87 células MG y GBM8401, respectivamente. Esas células SP se cultivaron a continuación en un sistema de suspensión con medio de cultivo de células madre. Las esferas aparecieron en la suspensión se observaron claramente en el día 7-10, lo que podría ser cosechados para los ensayos moleculares posteriores
.
(A) El porcentaje SP se analizó en GBM8401 y U-87 MG células mediante tinción con Hoechst y citometría de flujo. Las células se incubaron con la ausencia o presencia de inhibidor específico verapamil (100 mM) durante 3 h. ensayo de SP se realizó seguido por tinción de las células con Hoechst33342 (5 mg /ml) durante 90 min. La morfología de GBM8401 (B) y U-87 MG (C) fueron monitoreados y fotografiados después de la actuación de la SP citometría de flujo células de los padres y SP. Las células SP se incubaron en medio condicionado libre de suero durante 1 semana y se observó la morfología esferoidal. Las células SP se diferenciaron en células no-SP (PNA) para el cultivo a largo plazo en el medio completo que contenía suero.
Capacidad de diferenciación de las células SP
En el caso de estudio de la diferenciación la capacidad de las células SP, se obtuvieron las células SP diferenciada (d-SP) después del cultivo en medio completo durante una semana. Como se muestra en la Fig. 2 (A), las células SP GBM8401 poseía mucho más baja expresión de MAP2B marcador neuronal (2 ± 0,4%), lo que indica su estado indiferenciado. Cuando las células GBM8401 SP se diferenciaron a células d-SP, la expresión de MAP2B marcador neuronal se hizo tan alta como la de las células parentales (50 ± 1,9% en los padres y 55 ± 2,7% en las células d-SP). Del mismo modo, la expresión de GFAP marcador específico de astrocitos (glial fibrilar ácida de la proteína) en células U-87 MG SP (1,7 ± 0,2%) era mucho menor que en las células parentales (30 ± 1,8%). Cuando estas células U-87 MG SP se diferenciaron a células SP-D, la expresión de GFAP se incrementó notablemente a 8 ± 1,1% (Fig. 2 (B)).
Padres, SP y SP diferenciada ( d-SP) se recogieron las células para analizar la expresión de la proteína marcador específico tal como la proteína asociada a microtúbulos 2B (MAP2B) en GBM8401 (a) y la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) en células U-87 MG (B). Las señales se ajustaron restando el fondo del respectivo control de isotipo.
Caracterización de Células GBM8401 SP con cáncer de vástago marcadores de superficie celular
CD24, CD26, CD29, CD44, CD90 y CD133 tienen sido ampliamente utilizado para identificar células madre cancerosas de tumores sólidos [20]. La expresión de estos marcadores CD en las células SP y no SP frescas a partir de células según GBM8401 se muestra en la Fig. 3. Las expresiones de CD24, CD26, CD44 y CD133 en las células SP fueron significativamente (p & lt; 0,05) superiores a los de las células no-SP, el grado de pliegues fueron 1,8 ± 0,2, 2,5 ± 0,3, 1,7 ± 0,1 y 1.8 ± 0.2, respectivamente. No hubo diferencias significativas en la expresión de los otros dos marcadores, CD29 y CD90 (datos no mostrados).
GBM8401 SP y no SP células fueron ordenados y luego incubadas con anticuerpos de marcadores anti-CD específicos o con control de isotipo para 1 h, respectivamente. Después del lavado con PBS y centrifugación, las células se resuspendieron con PBS y se analizaron por citometría de flujo. Los histogramas de citometría de flujo análisis de CD133 (A), se muestran CD24 (B), CD26 (C), y CD44 (D). Las expresiones de los marcadores stemness anteriores en células SP fueron significativamente mayores que los de las células no-SP. Sin embargo, las expresiones de otros marcadores, tales como CD29, CD90, y SSEA-4, no eran aparentemente diferente (datos no mostrados).
La expresión de stemness gen es diferente en SP y no SP (NSP) las células
Para investigar más a fondo la expresión diferencial de genes en células SP stemness y no SP, hemos examinado la expresión de ARNm de
Oct-4
,
CD133
,
La nestina
,
β-tubulina III
,
Notch3
,
IHH
y
SMO Hoteles en GBM8401 padres, SP y las células no sp. Excepto la
β-tubulina-III
, las expresiones de los ARNm antes mencionados fueron significativamente (p & lt; 0,05). Más alto en las células SP en comparación con la de los padres y las células no-SP (Fig 4 (A ) y 4 (B)). Por otra parte, el nivel de mRNA de la proteína resistente a múltiples fármacos, como
MDR1
y
ABCG2
, y el
MGMT
expresión en las células SP también fueron más altos que los del células de los padres y no SP (Fig. 4 (A) y 4 (b)). Consistente con los datos de mRNA, los niveles de proteína de GBM CSC marcador CD133 y TMZ asociada a la resistencia MGMT proteína eran obviamente mucho más alto en las células SP en comparación con las células parentales y no SP (Fig. 4 (C)).
análisis (a) RT-PCR para la expresión de marcadores stemness (
CD113
,
Oct-4
), marcadores de diferenciación neuronal (
nestina
,
β-tubulina III
), la enzima de reparación del ADN (
MGMT
), vía de señalización stemness (
Notch3
,
IHH
,
SMO
) y los genes de resistencia a fármacos (
ABCG2
,
MDR1
,
MGMT
). Excepto el marcador de diferenciación neuronal
β-tubulina III
, todas las expresiones genes stemness en células SP fueron significativamente mayores que los de las células de los padres y no SP (NSP). El
β-actina
y
GAPDH
fueron utilizados como control de carga. (B) los datos El análisis cuantitativo y estadístico de (A) y dos experimentos similares independientes. *, P & lt; 0,05 en comparación con células parentales. (C) Análisis de transferencia Western de los niveles de proteína de GBM CSC marcador CD133 y TMZ asociada a la resistencia MGMT proteínas. Ambos niveles de proteína CD133 y MGMT eran obviamente mucho más alto en las células SP en comparación con las células parentales y no sp. La tubulina se utilizó como control de carga.
honokiol Elimina SP e inhibe la proliferación de las células GBM8401
Las células de los padres y SP GBM8401 fueron tratados con diferentes dosis de honokiol. La viabilidad celular se determinó por el ensayo de SRB y la proporción de células SP se analizó por citometría de flujo. El resultado mostró que Honokiol inhibió la proliferación de las células de los padres y SP GBM8401 de una manera dependiente de la dosis (Fig. 5A). Las células GBM8401 SP eran más resistentes a Honokiol en comparación con las células parentales, el IC
50 fueron 11,2 ± 1,1 y 5,3 ± 0,7 M, respectivamente. La sensibilidad de las células no-SP (NSP) para Honokiol fue similar a la de las células parentales (S1 Fig.). Por otro lado, la proporción de la población SP en células parentales fue disminuida por Honokiol de 1,5 ± 0,23% a 0,3 ± 0,02% y 0,2 ± 0,02% a dosis de 2,5 mM y 5 mM, respectivamente, como se muestra en la Fig. 5B.
(A) GBM8401 células parentales o SP se incubaron con las concentraciones de la serie de Honokiol durante 48 h y la viabilidad celular se examinó por el ensayo de SRB. (B) células GBM8401 se incubaron con la ausencia o presencia de inhibidor específico Verapamilo (50 M) y Honokiol (2,5 y 5 mM) durante 48 h, respectivamente. Después de lavado con PBS y centrifugación, ensayo de SP se realizó seguido por la tinción de las células con Hoechst33342 (5 mg /ml) durante 90 min.
Honokiol mejora aún más la citotoxicidad y la apoptosis inducida por la combinación de temozolomida y MGMT inhibidor
O
6
-BG en GBM8401 SP células
Como la Fig. 6A muestra, las células SP GBM8401 eran extremadamente alto resistente a TMZ que las células de los padres, el IC
50 fue 490 ± 5,3 M y 15 ± 0,4 M, respectivamente. Similar resultado se observó también en los U-87 células de los padres y SP MG. Como las células GBM8401 eran relativamente resistentes a TMZ que U-87 MG células, entonces elegimos las células GBM8401 para investigar los efectos de Honokiol en esta resistencia de las células SP para TMZ. A la dosis de 50 mM, TMZ disminuyó sólo ligeramente sobre 20% de la viabilidad de las células SP. Co-tratamiento con
O
6
-
BG (10 M) o honokiol (5 M), la viabilidad celular de 50 M TMZ tratos grupo fue ligeramente disminuyó de aproximadamente 80% a 60% y 40%, respectivamente (Fig. 6B). El efecto de co-tratamiento de 50 M TMZ más 10 M
O
6
-BG no podía ser mejorado aún más mediante el aumento de la dosis de
O
6
-BG a 20 M (Fig. 6B). Sin embargo, podría ser mejorada significativamente por Honokiol de una manera dependiente de la dosis. La viabilidad celular era aún más significativamente redujo a 23% (p & lt; 0,05) y 10% (p & lt; 0,01) por Honokiol en dosis de 2,5 mM y 5 mM, respectivamente, en comparación con 50 mM TMZ más 10 M
O
grupo 6
-BG tratada (Fig. 6C). En línea con esto, sólo se observaron mínimos efectos apoptóticos inducidos por un único agente se observaron y ningún aumento sustancial de los porcentajes de sub-G1 si TMZ se combina con cualquiera de
O
6
-
BG o honokiol. Sin embargo, los aumentos de la apoptosis en huelga (alrededor del 30% de células sub-G1, p & lt; 0.05) mientras que las células fueron tratados con TMZ (10 mM),
O
6
-
BG (10 mM) y honokiol (5 M) juntos (Fig. 7). Las proporciones sub-G1 de las células tratadas con SP GBM8401 honokiol y TMZ con o sin
O
6
-
BG se muestra en la Tabla 1.
(A) U-87 MG y GBM8401 células parentales y las células SP se trataron con varias concentraciones de TMZ. Tanto las células GBM8401 y U87 MG SP eran más resistentes a TMZ que sus células parentales. (B) Los efectos de
O
6
-BG (M) o honokiol (M) en TMZ (M) -suppressed viabilidad celular GBM8401 SP. *, P & lt; 0,05 en comparación con blanco; #, P & lt; 0,05 en comparación con el grupo tratado con TMZ 50 mM. No hubo diferencias significativas entre los dos grupos cada signo libra. (C) Los efectos de la combinación de honokiol y TMZ más
O
6
-BG sobre la viabilidad celular de las células GBM8401. *, P & lt; 0,05; **, P & lt; 0,01 en comparación con otro grupo se indica en el gráfico de barras. La viabilidad celular se determinó por el ensayo de SRB con muestras por triplicado. H, honokiol; T, TMZ; B,
O
6
-BG.
GBM8401 células SP fueron tratados con DMSO al 0,05% (A), 5 mM honokiol (B) , 10 mM TMZ (C), 5 mM honokiol combinada con TMZ 10 M (D), 10 mM TMZ más 10 M
O
6
-BG (e) y 5 M honokiol combina con 10 mM TMZ más 10 M
O
6
-BG (F) durante 72 h, respectivamente. Después de la cosecha, las células se fijaron y se tiñeron con PI para 30 min y el ciclo celular se examinó por citometría de flujo. Honokiol mejorada
O
6
-BG combinado con la citotoxicidad mediada por TMZ través de la promoción de la muerte celular por apoptosis. H, honokiol; T, TMZ; B,
O
6
-BG.
honokiol en combinación con
O
6
-
BG inhibe además el temozolomida inducida Notch3 /Hes1 Cascade en células GBM8401 SP
Como se muestra en la Fig. 8 (A) y 8 (B), los niveles de mRNA de
MGMT
, así como
Notch3
y su corriente abajo
Hes1
fueron significativamente (p & lt; 0,05) aumentó en TMZ (100 mM) de tratamiento en comparación con el grupo control. Honokiol (5 M) abolió las expresiones inducidas por TMZ de
Hes1
y
MGMT
. En presencia de
O
6
-
BG (20 M), el nivel de proteína de MGMT disminuye de forma marcada (Fig. 8 (C)) . Cuando se combina con
O
6
-
BG (20 mM), honokiol mayor (p & lt; 0,05) disminuyó la expresión inducida por TMZ de
notch3
y
Hes1
ARNm, lo que indica el papel potencial de honokiol en combinación con
O
6
-
BG para invertir la resistencia a TMZ en las células GBM SP.
(a) análisis de RT-PCR para la expresión de
Notch3
,
Hes1
y
MGMT
ARNm en células SP. células GBM8401 SP fueron tratados con 2,5 y 5 M Honokiol (carril 2 y 3, respectivamente), 100 M TMZ (carril 4), 100 M TMZ plus 5 M Honokiol (carril 5), 100 M TMZ más 20 M
O
6
-BG (carril 6), y 2,5 y 5 M honokiol combinado con 100 mM TMZ más 20 M
O
6
-BG (carril 7 y 8, respectivamente) durante 48 h. Los
18S
se utilizó como control de carga. Honokiol en combinación con
O
6
-
BG Además suprimido elevación temozolomida inducida por
Notch3
y
Hes1
mRNAs. (B) los datos El análisis cuantitativo y estadístico de (A) y dos experimentos similares independientes. (C) Análisis de transferencia Western para el nivel de proteína de MGMT en las células GBM8401 SP tratados con agentes como se describe en (A). La tubulina se utilizó como control de carga. Ctl, DMSO control de simulacro; H, honokiol; T, TMZ; B,
O
6
-BG. *, P & lt; 0,05 en comparación con DMSO grupo de control simulado. #, P & lt; 0,05 en comparación con 100 mM grupo tratado con TMZ
Discusión
El "lado la población" (SP) técnica es un método bien establecido para aislar stem- cáncer. como las células. Recientemente, Fukaya y sus colegas habían publicado un artículo utilizando la técnica de SP para aislar las células del cáncer de tallo como de diversas líneas celulares de glioblastoma humano [21]. Su estudio demostró que las células SP tenían mayor capacidad de eflujo de fármaco, más stemness genes expresión y mayor tumorigenesity en comparación con las células no-SP. Del mismo modo en este estudio, la SP aislado de GBM8401 células parecían tener propiedades CSC. Además de
La nestina
,
Notch-1 | y
ABCG2
, también habíamos mostrado otros genes stemness, como
CD133
,
Oct4
,
MGMT
y
MDR1
, fueron más expresa en células SP en comparación con las células no-SP. Además, las células SP podrían diferenciarse en diferente fenotipo de células con marcadores de diferenciación tales como GFAP y MAP2B. Los obviamente mucho más altos niveles de CD133 y proteína MGMT de células SP caracterizan además sus propiedades de células madre similares a, y por lo tanto la GBM8401 SP representaban una población enriquecida CSC.
Glioma células madre cancerosas podría ser aislado e identificado por los marcadores de superficie celular, tales como nestina y CD133, que también se expresa altamente en nuestras células SP. CD133 es los marcadores de superficie celular más comunes para la identificación de células madre del tumor cerebral y el aislamiento; sin embargo, los porcentajes de células positivas CD133 aislados a partir de tejidos tumorales de cerebro humano no eran consistentes, variaron de 3% a 45% [22]. Por lo tanto, no es convincible para caracterizar las células madre de cáncer mediante el uso de sólo un marcador de superficie celular específico [23]. En base a los hallazgos, otros marcadores tales como CD24, CD26 y CD44 también más se expresaron en células GBM8401 SP en comparación con las células no-SP, variaron de 1,7 a 2,5 pliegues. Las propiedades de CSC de células SP se confirmaron adicionalmente por la evidencia de las expresiones más altas de múltiples marcadores stemness descritos anteriormente.
Se demostró que las células CD133-altamente expresados situados en la parte central del tumor mostraron más resistentes a TMZ en contraste con los situados en la capa periférica [6]. En consecuencia, el GBM resistente TMZ se había demostrado que contienen mayor proporción de CD133
+ células y las células SP resistente a TMZ en este estudio también poseen un mayor nivel de CD133.