Lucha contra el Cáncer
Extracto
La camptotecina medicamento contra el cáncer inhibe la replicación y transcripción al atrapar el ADN topoisomerasa I (Top1) covalentemente al ADN en un "escindible complejo". Para examinar los efectos de la camptotecina en la síntesis de ARN en todo el genoma se utilizó Bru-Sec y mostramos que el tratamiento camptotecina elongación de la transcripción principalmente afectada. También se observó que la camptotecina aumentó RNA lee sitios de terminación de transcripción pasado, así como en elementos potenciadores. Después de la eliminación de la camptotecina, la propagación de la transcripción como una onda desde el extremo 5 'de genes sin recuperación de la transcripción evidentes a partir de ARN polimerasas estancadas en el cuerpo de genes. Como resultado, camptotecina preferentemente inhibe la expresión de genes grandes, tales como los proto-oncogenes y genes anti-apoptóticos, mientras más pequeños proteína ribosomal genes, genes pro-apoptóticas y genes diana p53 mostraron relativa más alta expresión. Cockayne grupo síndrome de fibroblastos B (CS-B), que son defectuosos en la reparación de trascripción acoplada (TCR), mostraron un perfil de recuperación síntesis de ARN similares a los fibroblastos normales que sugieren que la TCR no está implicado en la reparación de la recuperación o la síntesis de ARN a partir de transcription- el bloqueo de las lesiones Top1. Estos resultados de los efectos de la camptotecina en la transcripción tienen implicaciones importantes para sus actividades contra el cáncer y pueden ayudar en el diseño de mejores tratamientos combinatorios que implican venenos Top1.
Visto: Veloso A, B Biewen, Paulsen MT, Berg N, Carmen de Andrade Lima L, Prasad J, et al. Efectos (2013) en todo el genoma transcripcional del Agente de camptotecina anticáncer. PLoS ONE 8 (10): e78190. doi: 10.1371 /journal.pone.0078190
Editor: Didier Auboeuf, INSERM, Francia |
Recibido: 5 de Junio, 2013; Aceptado: 2 Septiembre 2013; Publicado: 23 de octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Veloso et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por fondos del Instituto Nacional de Ciencias ambientales (1R21ES020946) y el Instituto Nacional de Investigación del Genoma humano (1R01HG006786). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
ADN topoisomerasa I (Top1) relaja la tensión torsional que se genera en la hélice de ADN como consecuencia de la replicación, la transcripción y la remodelación de la cromatina [1,2]. La reacción mediada por Top1 implica la unión al ADN, la escisión de una cadena de la hélice del ADN seguido por el paso de la otra hebra a través de la ruptura y finalmente el resellado de la ruptura cadena de ADN covalente. La camptotecina medicamento contra el cáncer inhibe específicamente Top1 [3] actuando antes de la etapa de resellado, atrapando eficazmente Top1 unido covalentemente al ADN en un "complejo escindible." La camptotecina y otros venenos Top1 se utilizan para el tratamiento de cáncer de ovario, cervical, de colon, de páncreas, de pulmón, mama, próstata y cerebro de cáncer [4]. La actividad anti-cáncer de la camptotecina está vinculada a la toxicidad de replicación mediada por [5]. El efecto inhibidor de la camptotecina en la transcripción también se ha reconocido a contribuir a la toxicidad en las células que no se dividen [6,7].
que anteriormente mostró que los complejos de ADN-Top1 camptotecina estabilizada retardan alargamiento pero no iniciación de la transcripción [8]. De hecho, se observó un aumento de la ocupación de la ARN polimerasa II en la región promotora de la
DHFR
gen se correlaciona con una mayor tasa de iniciación de la transcripción [8]. En respuesta a la obstrucción elongación de la transcripción, Top1 está destinada a la degradación de una manera dependiente de ubiquitina [9] y residuos de ácido posteriores residuales ADN-vinculados aminoácidos pueden requerir la acción de la fosfodiesterasa tirosil-ADN 1 (TDP1) para su extracción en orden para la transcripción elongación para reanudar [10]. La obstrucción de la maquinaria de transcripción por complejos Top1 atrapados en el ADN por la camptotecina se ha demostrado que conduce a la inducción de ADN doble filamento se rompe [6] y la formación de ADN-ARN estructuras híbridas (R-bucles) activar el estrés quinasa ATM [7 , 11]. Por otra parte, esta tensión de la transcripción resulta en la activación de la ruta de respuesta de p53 [12 a 15] y la inducción de procesamiento de daño del ADN 53BP1 mediada [16]. Top2 y PARP1 desempeñan papeles superpuestos a Top1 en las células que no se dividen lo que sugiere que la combinación de Top1, Top2 y las drogas de PARP-diana puede ser eficaz en las células tumorales en división no [15].
Tras reversión camptotecina, la reacción se completa la topoisomerasa y se cree complejos de transcripción para reanudar la elongación. Curiosamente, se observó previamente que la recuperación de la síntesis de ARN a partir de la
DHFR
gen en las células CHO después de la extracción de la camptotecina, se reanuda como una onda en una dirección 5 '-3 sin recuperación aparente aguas abajo en el gen [8] . Esto sugiere que los complejos de transcripción bloqueados por complejos Top1 atrapadas son incapaces de reanudar la elongación después de la reversión de camptotecina [8]. La proteína de Cockayne grupo de complementación B (CSB) defectuoso en la reparación de trascripción acoplada (TCR) se ha sugerido que participan en la reparación de Top1 ligada al ADN covalentemente [17]. Se sugirió que esto se acopló a una recuperación más lenta de la síntesis de ARN total en las células CS-B se correlaciona con una hipersensibilidad a la exposición de camptotecina [15,17,18]. Sin embargo, otros estudios no han encontrado ningún defecto en la recuperación después de la síntesis de ARN CSB caída [16].
Para analizar el efecto directo de la camptotecina en la transcripción del genoma en toda la transcripción y explorar la recuperación después de la eliminación del fármaco, se utilizó el recientemente desarrollado método Bru-Sec [19]. Esta técnica se basa en el etiquetado metabólico de ARN usando bromouridina (Bru), seguido por el aislamiento específico de ARN naciente marcado con Bru, la preparación de la biblioteca y profundo secuenciación [19]. Nuestros resultados muestran que la camptotecina inhibidor Top1 causa una inhibición preferencial de la expresión de genes grandes a través del bloqueo de la transcripción de elongación en combinación con la falta de recuperación de la síntesis de ARN polimerasas bloqueados en el cuerpo de los genes. Además, hemos encontrado ningún defecto en la recuperación de la síntesis de ARN en las células CS-B seguido de inversión camptotecina, lo que sugiere que el TCR puede no ser necesario para la recuperación después de la inhibición guía I reversión.
Materiales y Métodos
Cell líneas, tratamiento camptotecina y Bru-Sec
hTERT inmortalizado humanos diploides fibroblastos de prepucio (donación del Dr. Mary Davis, Departamento de Oncología de Radiación de la Universidad de Michigan) y CS-B fibroblastos (GM00739, Coriell Cell Repositorio) eran crecido como monocapas en MEM suministrados con 10% de suero fetal bovino y antibióticos (Invitrogen). Las células fueron tratadas durante 45 minutos con 20 mM camptotecina (Sigma) y se marcaron durante 15 minutos con 2 mM bromouridina ya sea durante los últimos 15 minutos de tratamiento camptotecina o después de lavado. Se llevaron a cabo los procedimientos Bru-seq y BruChase-Seq como se describe anteriormente [19]. En resumen, el ARN total fue aislado de las muestras de células usando el reactivo TRIzol (Invitrogen), seguido por el aislamiento específico de ARN marcado con Bru utilizando anticuerpos anti-BrdU (BD Biosciences) conjugados con perlas magnéticas (Dynabeads, de cabra anti-IgG de ratón, Invitrogen) . El ARN aislado se convirtió en una biblioteca de ADN específica de hebra usando el kit de Illumina TruSeq (Illumina) como se describe anteriormente [19].
Illumina Hi-Sec secuenciación y análisis de datos
La secuenciación de las bibliotecas de ADNc se llevó a cabo por el personal de la Universidad de Michigan Secuenciación Core utilizando el secuenciador Illumina HiSeq 2000. Base de llamada se ha realizado mediante Illumina Casava v1.8.2. y la cartografía de lectura se realizó a través TopHat, aceptando sólo lee que podría ser asignada de forma única al genoma. Se calcularon los valores de los datos RPKM Bru-seq y trazan los datos utilizando un navegador hecha a la medida como se describe anteriormente [19].
Disponibilidad de datos
Los datos primarios utilizados en los análisis se ha depositado en el NCBI Gene Expression Omnibus y está disponible gratuitamente. Hemos subido los archivos de mapeo del genoma BAM originales y las listas de síntesis de derivados como archivos de cama. El número de acceso es GSE48678 y el enlace completo es http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE48678.
Resultados
camptotecina inhibe preferentemente la síntesis de ARN de genes grandes
desafiamos fibroblastos humanos durante 45 minutos con 20 mM camptotecina y ARN marcado con Bru 2 mM durante los últimos 15 min en presencia de camptotecina. La secuenciación lee desde la naciente Bru-que contiene ARN asignada a lo largo de genes que cubren ambos exones e intrones y las tasas relativas de la transcripción se determinaron para todos los genes sumando el número de lecturas a lo largo de los genes y dividiéndolo por la longitud del gen. Se expresó la densidad de lectura como "lecturas por mil millones de pares de bases por lee" (RPKM). estadísticas de la muestra se pueden encontrar en la Tabla S1. tratamiento camptotecina inhibe las tasas de transcripción de 1142 genes en más de 2 veces, mientras que el aumento de la transcripción de 919 genes en más de 2 veces (Figuras 1 A y B, Figura S1, S2 en File S1 y la Tabla S2). Ya sea que los genes que se encuentran haber aumentado las tasas relativas de la transcripción realmente se están sintetizados a una tasa más alta absoluta no se determina ya que los datos generados a partir de Bru-Seq representa la distribución de lecturas en lugar de los valores de expresión absolutos. Por lo tanto, cuando la síntesis se reduce en el cuerpo de grandes genes, secuenciación lee deben acumular en otro lugar (es decir, en pequeñas genes y en el comienzo de grandes genes).
fibroblastos humanos se trataron con 20 mM de camptotecina, por 45 min con mM Bru 2 añadido durante los últimos 15 minutos de tratamiento camptotecina para etiquetar ARN naciente seguido de Bru-Seq. (A), los genes largas, como
iniciación TRIO
, defectos de elongación de exposiciones, pero no la transcripción, después del tratamiento camptotecina. (B), los genes cortos, como
BAMBI
, muestran un aumento relativo de la síntesis de ARN después del tratamiento con camptotecina. (C), Efecto de la camptotecina en la transcripción relativa como una función del tamaño de genes. Ratio de señal Bru-Seq de genes individuales en camptotecina-tratado sobre las células de control como una función del tamaño de genes. genes más largos se inhiben preferentemente sobre genes más cortos. (D), la mediana de duración de los genes inducidos & gt; 2 veces por camptotecina (919 genes) es 8,927 pb, mientras que los genes regulados por & gt; 2 veces (1.145 genes) tienen una longitud media de 136.355 pares de bases. Los mapas genéticos son de genes RefSeq (UCSC genoma navegador).
Los datos muestran una correlación negativa entre la intensidad obvia lectura y las dimensiones de genes después del tratamiento con camptotecina (Figura 1C). El tamaño medio de los genes con más de un 2 veces disminución de las tasas de transcripción relativa fue de 107.089 pares de bases. (Figura 1D). El tamaño genómico mediana de los 919 genes que muestran un aumento de las tasas de transcripción respecto después del tratamiento camptotecina era 7.748 pb. Estos resultados son consistentes con un mecanismo de acción mediante el cual camptotecina inhibe la elongación de la transcripción sin inhibir iniciación de la transcripción [8].
camptotecina afecta terminación de la transcripción y expresión de ARN NcRNA y potenciador (ERNA)
Para muchos genes cortos donde no hay inhibición de la elongación fue evidente después del tratamiento con camptotecina, la transcripción de lectura a través del pasado anotado 3 ' poli (a) sitio era prominente (Figura 2A, Figura S3 en S1 File). Estos datos apoyan un papel para la topoisomerasa I en la terminación de la transcripción de estos genes [20]. Alternativamente, el aumento del número de lecturas más allá de los sitios de terminación anotada puede resultar de la inducción de sitios de poli alternativa (A) después del tratamiento camptotecina o la estabilización del ARN pasado el sitio 3 'de escisión. Muchos de los genes en células de mamíferos se ha demostrado para generar promotor divergente transcripciones aguas arriba (introducciones) [19,21]. La expresión de algunos mensajes se ha mejorado de manera espectacular por el tratamiento camptotecina (Figura 2B, Figura S4 A-C en el Archivo S1). Por otra parte, muchos genes transcritos de forma divergente mostraron coordinar la mejora de la iniciación, lo que sugiere que la superhelicity negativo esperado se acumule en la estela de la transcripción en ausencia de la actividad de la topoisomerasa I puede mejorar la iniciación de la transcripción (Figura S4 D-F). Finalmente, el tratamiento de camptotecina conducen a la producción de más promotor de ARN (erna) de muchos elementos potenciadores conocidos y putativo, como el 5 '
FOS
potenciador (Figura 2C, Figura S5 en S1 File). La consecuencia funcional de la generación mejorada de Erna después del tratamiento con camptotecina no está claro ya que la tasa de transcripción relativa de los
FOS
gen no fue elevado a pesar del incremento en la generación de Erna. Además de inhibir el alargamiento de los genes codificantes de proteínas, camptotecina inhibe la elongación de la transcripción de las transcripciones de microARN primaria (Figura 2D) y largos ARNs no codificantes mejoradas o reprimidos (lncRNAs) (Figura 2 E & amp; F).
en la Figura 1, los fibroblastos humanos fueron tratadas con camptotecina 20 M durante 45 min con mM Bru añadió 2 durante el último 15 min de tratamiento camptotecina para etiquetar ARN naciente seguido de Bru-Seq. (A), la lectura a través de la transcripción del sitio de terminación de la
RHOB
génica inducida por camptotecina. (B), la iniciación mejorada de la
ASCC3
génica y la regulación positiva coincidente de ARN divergentes PUNTUAL aguas arriba. (C), mayor expresión de erna desde el potenciador 5 'aguas arriba de
FOS
por camptotecina. (D), camptotecina inhibe la transcripción del transcrito primario de miRNA138-1. (E), camptotecina induce la transcripción de la ncRNA MALAT1. (F), camptotecina inhibe la transcripción de un tiempo muy largo sin anotaciones NcRNA en el cromosoma 2. Los mapas genéticos son de genes RefSeq (UCSC genoma navegador).
Transcripción y se recupera como una onda desde el extremo 5 ' después de la eliminación de camptotecina
La captura de la topoisomerasa I en el ADN por la camptotecina se piensa que es un evento parcialmente reversible [2]. Para explorar si la eliminación de la camptotecina invierte sus efectos sobre la transcripción, hemos utilizado Bru-Sec para examinar el transcriptoma ARN naciente en las células después de lavado del fármaco. Para obtener una visión global del efecto de la camptotecina en la síntesis de ARN naciente de múltiples genes, se seleccionaron los genes altamente expresados (RPKM mayor que 1) y más de 100 kb y los alineó por sus sitios de inicio de transcripción. Hemos encontrado que la camptotecina induce una fuerte señal por encima de control dentro de los primeros 10 kb de genes seguido de una caída severa en la señal por debajo de control más aguas abajo (Figura 3A). Estos resultados sugieren que la inhibición y la captura de la topoisomerasa I por la camptotecina no inhibe iniciación de la transcripción, pero inhibe fuertemente la elongación. Cuando camptotecina se lavó y las células se marcaron con bromouridina por 15 min en ausencia del fármaco, la recuperación de la transcripción se extendió desde el extremo 5 'en el gen, mientras que se observó más no recuperación de la señal aguas abajo en el gen. Después de lavado de la droga y la incubación durante 15 minutos en medio libre de drogas y luego el etiquetado de ARN naciente para los siguientes 15 minutos, la onda de la transcripción se movió más lejos en el gen en la dirección 3 '. Una vez más, se observó más aguas abajo en el gen sin recuperación de la señal. Curiosamente, la velocidad a la que la onda de transcripción se extiende desde el extremo 5 'y en el cuerpo de los genes fue de aproximadamente 1.1 a 1.3 kb /min (Figura 3, Figura S6 en S1 File). Esto es más lenta que la tasa de elongación estimada de alrededor de 2 kb /min en las células en condiciones normales [22]. Si alargándose RNA polimerasas chocan con las topoisomerasas atrapados, el daño del ADN irreversible se puede inducir que requeriría su posterior procesamiento [6]. Es posible que esta tasa de elongación reducida observó después del tratamiento camptotecina y el lavado se debe a la necesidad de una reparación Top1 /camptotecina inducida por daño en el ADN que tenga lugar antes de la elongación puede reanudarse.
(A), Agregado de vista la síntesis de ARN de los genes de más de 100 kb de fibroblastos humanos normales con los genes alineados por los sitios de inicio de transcripción (TSS). la síntesis de ARN se recupera como una onda en una dirección 5 'a 3' después de la extracción de camptotecina sin recuperación aparente de ARN polimerasas estancadas en el cuerpo de los genes. tasa de elongación de la transcripción de la onda de recuperación se estimó en ~ 1,2 kb /min. (B), la onda de recuperación de la síntesis de ARN se puede ver avanzando desde el extremo 5 'de la
CD44
gen sin recuperación aparente en el cuerpo del gen. El frente de la onda de la transcripción extiende unos 35 kb durante la primera recuperación de 30 min que resulta en una velocidad de alargamiento de alrededor de 1,2 kb /min. (C) se encontraron tasas de elongación similares después de la eliminación de camptotecina para el gen
MEISE1
. clave de color:
Blue
, de control (30 min etiquetado Bru);
amarillo
, etiquetado Bru durante los últimos 15 min de un tratamiento camptotecina 45 min;
Verde
, 45 camptotecina tratamiento min seguido de un lavado del fármaco y 15 minutos de etiquetado Bru;
Red
, 45 min de tratamiento camptotecina seguido de un lavado del fármaco, 15 min de incubación, y finalmente 15 min etiquetado Bru.
No defecto aparente en la recuperación de la síntesis de ARN en CS- células B siguientes camptotecina de reversión
Las células derivadas de pacientes con síndrome de Cockayne son hipersensibles a la camptotecina [18]. Esta hipersensibilidad se vincula a una inducción mejorada de doble filamento se rompe en la fase S como horquillas de replicación "chocan" con complejos Top1 atrapadas [18]. Algunos estudios también han demostrado que la recuperación de la síntesis de ARN es más lento en las células CS [15,17,18], mientras que otros estudios han encontrado ningún defecto en la recuperación de la síntesis de ARN [16]. El uso de Bru-Sec hemos probado si la recuperación de la síntesis de ARN naciente en los fibroblastos CS-B tras el tratamiento camptotecina y reversión difería de la recuperación en los fibroblastos humanos normales. Análisis de la señal de la transcripción de genes agregado al menos 100 kb o más mostró que las células CS-B recuperaron la síntesis de ARN en una onda de el extremo 5 'de estos genes de una manera similar como los fibroblastos normales (Figura 4A). Esto también fue evidente para los genes individuales (Figura 4B & amp; C, Figura S7 en File S1). Además, no hay recuperación de la transcripción se produjo dentro de los cuerpos de los genes que sugieren que las ARN polimerasas bloqueados no son capaces de reanudar la elongación después de la eliminación de la camptotecina. La recuperación de la normalidad aparente de la síntesis de ARN en estas células CS-B estaba en marcado contraste con la recuperación defectuosa de la síntesis de ARN naciente en estas células tras la irradiación UV (datos no publicados)
.
(A), Agregado de vista la síntesis de ARN de genes de más de 100 kb en las células CS-B con los genes alineados por los sitios de inicio de transcripción (TSS) como en la figura 3. las tasas de elongación de la transcripción de la onda de recuperación se estimó en ~ 1,0 a 1,3 kb /min. los genes individuales en los fibroblastos de un individuo CS-B muestran las tasas de recuperación similares a los fibroblastos de un individuo normal para (B),
CD44
y (C)
MEIS1
. tecla de color como en la Figura 3.
camptotecina la expresión génica del cáncer relevantes afectada
Realización de análisis de genes de enriquecimiento DAVID encontramos que los genes inducida por camptotecina que codifica para elementos de los ribosomas, mitocondrias y las vías de señalización de p53 y la apoptosis fueron altamente representadas (Figura 5, Tablas S2-4). El conjunto de genes que se encuentran inhibidos poco después del tratamiento camptotecina se enriqueció para fosfoproteínas, proto-oncogenes y genes implicados en el ciclo celular mitótico, la conjugación de la ubiquitina y anti-apoptosis. Algunas grandes proto-oncogenes representativos inhibidas por camptotecina se muestran en la Figura 6A. Se ha demostrado que el bloqueo de elongación de la transcripción por camptotecina desencadena una respuesta de estrés que conduce a la rápida acumulación de p53 acompañado por la fosforilación de Ser15 el sitio y la acetilación del sitio Lys382 [12]. En apoyo de camptotecina inducir una respuesta de p53 en fibroblastos humanos, se encontró que la camptotecina inducida por genes en la vía de señalización de p53, incluyendo
CDKN1A
(p21),
MDM2, BTG2
y
FAS gratis (Figura 6B). Algunos de estos genes ya fueron inducidos durante el tratamiento camptotecina mientras que la expresión de algunos genes, como CDKN1A y MDM2, mostraron inducida sólo después de la inversión de tratamiento de drogas. La camptotecina redujo las tasas de transcripción relativas de grandes genes anti-apoptóticos y una mayor expresión de un conjunto de genes pro-apoptóticos de tamaño más pequeño (Figura 6C). genes pro-apoptóticos son generalmente más compacto en comparación con los genes anti-apoptóticos [23], por lo tanto, agentes reductores preferentemente expresión de grandes genes mediante el bloqueo de elongación de la transcripción se espera que cambiar el equilibrio de la expresión génica en favor de la apoptosis. No se han encontrado patrones similares de expresión génica relativa aumenta y disminuye después del tratamiento camptotecina y la reversión de las células CS-B (Figura S8 en S1 Archivo). Hubo, sin embargo, se observaron algunas diferencias entre los fibroblastos humanos normales y las células CS-B tales como la falta de reducción de
GLI2
expresión y la no inducción de los genes regulados por p53
DUSP5
,
FAS
,
MDM2
y
TRIM22 Hoteles en células CS-B
.
Rutas (a) representados por los genes arriba regulado al menos 2 veces, y (B) regulados hacia abajo al menos de 2 veces después del tratamiento de la camptotecina y la recuperación. Los fibroblastos humanos se trataron con 20 mM de camptotecina durante 45 minutos y se incubaron durante la última 15 min con Bru mM 2 ( "0 min"), se incubaron durante 15 min con Bru después de la eliminación de la camptotecina ( "15 min") o se incubaron durante 15 min con Bru después de un tratamiento 45 min, un lavado y una recuperación 15 min ( "30 min"). de enriquecimiento de análisis se realizó utilizando DAVID (david.abcc.ncifcrf.gov) y los números mostrados representan los valores de p para el enriquecimiento.
(A), ejemplos de grandes proto-oncogenes inhibidas por camptotecina y sin mostrar la recuperación (o lenta recuperación) después de la retirada del fármaco. (B), los ejemplos de genes diana de p53 inducida después de tratamiento camptotecina. (C), los ejemplos de grandes genes anti-apoptóticos que muestra reduce la transcripción relativa (izquierda) y ejemplos de pequeños genes pro-apoptóticos que muestran la transcripción relativa mejorado después del tratamiento camptotecina (derecha). (D), Modelo de mecanismos por los que la camptotecina puede inducir la muerte celular o inhibir el crecimiento celular. Camptotecina desencadena una respuesta transcripcional de p53 inhibe selectivamente y gran proto-oncogenes y genes de supervivencia. Los datos son codificados por colores donde azul representa control (C), amarillo representa 15 min Bru-etiquetado al final de un tratamiento de camptotecina 45 min sin recuperación ( "0 min"), verde representa lavado del fármaco y 15 min Bru-etiquetado inmediatamente después de lavado ( "15 minutos") y, finalmente, el rojo representa etiquetado 15-30 minutos después de lavado ( "30 minutos").
Discusión
La camptotecina y sus derivados están aprobados por la FDA contra medicamentos: cáncer utilizados para tratar una variedad de tumores [4]. Actúan atrapando complejos de la topoisomerasa I en el ADN en lugar de la inhibición de la función enzimática, ya que RNAi desmontables de Top1 no reduce la supervivencia celular en el mismo grado como tratamiento de camptotecina [4,24]. En este estudio, hemos utilizado Bru-Sec para explorar los efectos agudos de la camptotecina en varios aspectos de la transcripción y encontramos que la camptotecina (i) inhibió la elongación de la transcripción, (ii) estimuló la transcripción de lectura a través allá del extremo 3 'de genes pequeños , (iii) una mayor expresión de erna de ciertos elementos potenciadores (iv) indujo la respuesta de p53 y (v) desplaza el equilibrio de la expresión de genes de apoptosis regulador en favor de la apoptosis. Es importante destacar que la transcripción se recuperó con una tasa de alargamiento reducido como una onda desde el extremo 5 'del gen sin recuperación aparente de la síntesis de ARN polimerasas bloqueados en el cuerpo de los genes. No se encontraron pruebas de que la recuperación de la síntesis de ARN fue diferente en los fibroblastos CS-B, que está en agudo contraste con la recuperación de la síntesis de ARN en estas células después de la luz UV (datos no publicados). Por lo tanto, los mecanismos responsables de la recuperación de la síntesis de ARN después de la extracción de camptotecina son fundamentalmente diferentes de las requeridas tras la irradiación UV lo que sugiere que la reparación de la transcripción de acoplamiento no tiene un papel importante en el reinicio de la transcripción después de la eliminación de la camptotecina. Por tanto, es concebible que la hipersensibilidad observada de las células CS-B de la camptotecina está relacionada con algún papel de la proteína CSB durante la recuperación de la replicación en lugar que en la recuperación de la transcripción [18].
La incapacidad de las células para transcripción reinicio desde dentro del cuerpo de genes sugiere que las ARN polimerasas bloqueados se desechan en vez de reciclarse. Esto preferentemente situado detrás de la expresión de genes grandes, incluso después de una exposición limitada de las células de la camptotecina. Curiosamente, muchos proto-oncogenes y genes anti-apoptóticos pertenecen a la clase de genes preferentemente inhibida por camptotecina. El modelo que surge es que el envenenamiento de Top1 por los resultados de la camptotecina en la inhibición de grandes proto-oncogenes, una mayor expresión de pequeñas genes pro-apoptóticos y la activación de la vía de p53 (Figura 6D). El conocimiento del tamaño de los oncogenes que impulsan la carcinogénesis y son importantes para la supervivencia de las células cancerosas en un tumor dado se puede utilizar para seleccionar a los pacientes que se beneficiarían del tratamiento específicamente camptotecina y para combinar racionalmente camptotecina con otras modalidades de tratamiento. Por ejemplo, la expresión de la proteína grande dominio RING BRCA1 asociada 1 gen (BARD1) se redujo por camptotecina. Cabe esperar que dicha supresión para suprimir la recombinación homóloga y por lo tanto debería conducir a una mayor susceptibilidad a los inhibidores de PARP o radioterapia. De hecho, se ha demostrado que la combinación de camptotecina con inhibidores de PARP o la radioterapia mejora el control de tumor [4,25-27].
Información de Apoyo
archivo S1.
Imágenes de apoyo.
figura S1. Grandes genes inhibidos por camptotecina. (A),
SULF1
, (B),
NAV2
, (C),
SH3BP4
, (D),
KCNN2
, (E ),
plcb4
y (F),
TLE4
genes están mostrando la inhibición de la elongación de la transcripción después de un tratamiento de 45 minutos de 20 M camptotecina. células de fibroblastos humanos se incubaron con Bru 2 mM durante los últimos 15 min de tratamiento camptotecina para etiquetar ARN naciente seguido de Bru-Seq. Los mapas genéticos son de genes RefSeq (UCSC genoma navegador). Figura S2. Los ejemplos de genes que muestran pequeñas relativa más alta de transcripción lee después del tratamiento con camptotecina. (A),
RGS2
, (B),
HSPB3
, (C),
FUS
, (D),
TSPYL2
, (E ),
CHCHD7
y (F),
TP53
representan genes que están regulados al alza después de un tratamiento de 45 minutos con 20 mM de camptotecina. células de fibroblastos humanos se incubaron con Bru 2 mM durante los últimos 15 min de tratamiento camptotecina para etiquetar ARN naciente seguido de Bru-Seq. Los mapas genéticos son de genes RefSeq (UCSC genoma navegador). Figura S3. Aumento de la lectura completa de la transcripción más allá del extremo 3 'de genes cortos. (A),
FZD7
, (B),
MYC
, (C),
CYR61
, (D),
DKK1
, (E ),
SSTR1
y (F),
IER5
. células de fibroblastos humanos fueron tratadas con camptotecina 20 M durante 45 min y se incubaron con Bru 2 mM durante el último 15 min de tratamiento camptotecina para etiquetar ARN naciente seguido de Bru-Seq. Los mapas genéticos son de genes RefSeq (UCSC genoma navegador). Figura S4. Efecto de la camptotecina en la transcripción aguas arriba divergentes. La camptotecina induce la transcripción divergente promotor aguas arriba en el (A),
CEP78
, (B),
FER
y (C),
RAB33B
genes y aumenta la transcripción de genes divergentes de (D),
PLAG1
y
CHCHD7
, (e),
CCDC58
y
FAM162A
y (F),
IMMP1L
y
ELP4
genes. células de fibroblastos humanos fueron tratadas con camptotecina 20 M durante 45 min y se incubaron con Bru 2 mM durante el último 15 min de tratamiento camptotecina para etiquetar ARN naciente seguido de Bru-Seq. Los mapas genéticos son de genes RefSeq (UCSC genoma navegador). Figura S5. Efecto de la camptotecina en potenciadores putativos define como regiones con alta H3K4m1 y H3K27ac mientras que la baja H3K4m3 modificaciones de las histonas. células de fibroblastos humanos fueron tratadas con camptotecina 20 M durante 45 min y se incubaron con Bru 2 mM durante el último 15 min de tratamiento camptotecina para etiquetar ARN naciente seguido de Bru-Seq. Las pistas de hipersensibilidad mapas de genes, marca de histonas y DNasa son de codificar y RefSeq genes (UCSC genoma navegador). Figura S6. Efecto de la inversión de la camptotecina en la síntesis de ARN en los fibroblastos humanos normales. La recuperación de la síntesis de ARN se observa como una onda en un 5 'a 3' después de la extracción de camptotecina sin recuperación aparente de ARN polimerasas estancado en el cuerpo de los genes para la (A)
TOP1
, (B)
SMAD3
y (C)
TLE4
genes. clave de color:
Blue
, la transcripción en células de control lee;
amarillo
, la transcripción se lee a partir de células marcadas con Bru durante los últimos 15 min de un tratamiento de 45 minutos con camptotecina;
Verde
, transcripción lee de células marcadas durante 15 minutos con Bru tras un lavado de camptotecina después de un tratamiento de 45 minutos;
Red
, la transcripción se lee a partir de células marcadas con Bru 15 minutos después de lavado del fármaco después de un tratamiento de 45 minutos. Figura S7. Efecto de la reversión de la camptotecina en la síntesis de ARN en fibroblastos CS-B. La recuperación de la síntesis de ARN se observa como una onda en un 5 'a 3' después de la extracción de camptotecina sin recuperación aparente de ARN polimerasas estancado en el cuerpo de los genes para la (A)
TOP1
, (B)
SMAD3
y (C)
TLE4
genes. clave de color:
Blue
, la transcripción en células de control lee;
amarillo
, la transcripción se lee a partir de células marcadas con Bru durante los últimos 15 min de un tratamiento de 45 minutos con camptotecina;
Verde
, transcripción lee de células marcadas durante 15 minutos con Bru tras un lavado de camptotecina después de un tratamiento de 45 minutos;
Red
, la transcripción se lee a partir de células marcadas con Bru 15 minutos después de lavado del fármaco después de un tratamiento de 45 minutos. Figura S8. Efecto de la camptotecina en la expresión de genes mostrados en la Figura 7 en las células CS-B. (A), grandes proto-oncogenes inhibidas por camptotecina y sin mostrar /lenta recuperación tras la retirada del fármaco. El
GLI2
gen fue afectada por el tratamiento de la camptotecina en células CS-B. (B), los genes diana de p53 en el que sólo algunos fueron inducidos en las células CS-B después del tratamiento de camptotecina. (C), los ejemplos de grandes genes anti-apoptóticos que muestran reducción de la transcripción relativa (leftt) y ejemplos de pequeñas genes pro-apoptóticos que muestra mejorados de transcripción relativa en las células CS-B después del tratamiento de camptotecina (derecha). recuperación.