Extracto
Antecedentes
sistema de clasificación actual para el cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) clasifica a los pacientes en limitado- o extensa grupos de enfermedades de acuerdo con estadio en localizaciones anatómicas. Aun así, una amplia gama de tiempos de supervivencia se ha observado entre los pacientes en el mismo sistema de clasificación. Este estudio tuvo como objetivo identificar si la invasión mucosa endobronquial es un predictor independiente de mal supervivencia en pacientes con CPCP, y para comparar el tiempo de supervivencia entre los pacientes con y sin invasión de la mucosa endobronquial.
Métodos
estudiados 432 pacientes consecutivos con SCLC basados en el examen histológico de muestras de biopsia o en forma de aguja fina citología por aspiración, y recibió la tomografía computarizada y el hueso para la estadificación. Todos los pacientes incluidos fueron evaluados para la invasión de la mucosa endobronquial por broncoscopia y el examen histológico. días de supervivencia se compararon entre los pacientes con o sin invasión de la mucosa endobronquial y los predictores de la disminución de días de supervivencia fueron investigados.
Resultados
84% (364/432) de los pacientes con CPCP tenían la invasión de la mucosa por endobronquial las células del cáncer al momento del diagnóstico inicial. afectación de la mucosa endobronquial (hazard ratio [HR], 2,01; 95% intervalo de confianza [IC], 01.30 a 03.10), la edad (HR, 1,04; IC del 95%, 01/03 a 01/06), y la extensa etapa (HR, 1,39; 95% IC, 1,06-1,84) fueron factores que contribuyen independientes para la supervivencia más breve, mientras que la quimioterapia recibida (HR, 0,32; IC del 95%, desde 0,25 hasta 0,42) fue un factor que contribuye a un mejor resultado independiente. Los días de supervivencia de los pacientes de SCLC con afectación endobronquial se disminuyó notablemente en comparación con los pacientes sin (mediana 145 vs. 290, p & lt; 0,0001). Entre los pacientes con CPCP de cualquiera limitada (mediana 180 vs 460, p & lt; 0,0001) o extensa (mediana 125 vs 207, p & lt; 0,0001) etapas, la duración mediana de supervivencia para los pacientes con invasión de la mucosa endobronquial era más bajo que aquellos con mucosa endobronquial intacta ., respectivamente
Conclusión
afectación de la mucosa endobronquial es un factor pronóstico independiente para pacientes con SCLC y se asocia con la disminución de días de supervivencia
Visto:. Chou PC, Lin SM, Lo CY , Chen HC, Wang CW, Chou CL, et al. (2012) endobronquial mucosa invasión predice la supervivencia en pacientes con cáncer de pulmón de células pequeñas. PLoS ONE 7 (10): e47613. doi: 10.1371 /journal.pone.0047613
Editor: Pan-Chyr Yang, el Hospital de la Universidad Nacional de Taiwán, Taiwán
Recibido: 1 de mayo de 2012; Aceptado: 19 de septiembre de 2012; Publicado: 4 de octubre 2012
Copyright: © Chou et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC), lo que representa 20% de los tumores de pulmón, es sensible con respecto a la terapia de quimioterapia citotóxica y la radiación [1]. SCLC que se derive o se relacione con la célula neuroendocrina pulmonar posee características biológicas celulares y moleculares distintivas en relación con el cáncer no microcítico de pulmón de células [2], [3]. A pesar de una alta tasa de respuesta a la quimioterapia y la radioterapia, SCLC permanece asociado con una pobre supervivencia a largo plazo debido a su rápida recaída [4].
pacientes con CPCP se clasifican de acuerdo a un sistema de dos fases, que fue desarrollado por la Administración del cáncer de pulmón Grupo de Estudio de Veteranos [5], que tienen la enfermedad en estadio limitado o enfermedad en estadio. El estadio clínico en la presentación inicial es uno de los factores pronósticos más potentes identificados en la mayoría de los estudios [6], [7]. 60 a 65% de los pacientes tienen una amplia enfermedad en el diagnóstico con una supervivencia media de aproximadamente 9 meses, mientras que cerca de 18 meses de supervivencia media se informó en los pacientes con enfermedad en estadio limitado [5]. Debido a otros factores pronósticos independientes, sigue existiendo la heterogeneidad entre los estudios [8], [9]. La identificación de factores de riesgo podría explicar la variabilidad observada en la supervivencia y ser útil en la estratificación para el subgrupo de nuevas estrategias terapéuticas.
SCLC menudo se produce inicialmente como un tumor endobronquial situado en el centro [10], unas características que hicieron este tipo de cáncer ideal para la broncoscopia. De hecho, el diagnóstico histológico inicial de SCLC se rinde a menudo a través de broncoscópica examen [10]. La evidencia sugiere que los hallazgos anormales en la broncoscopia se asocia con recaída temprana o SCLC [11]. Además, los pacientes de SCLC con invasión mucosa endobronquial por tumor son menos sensibles a la quimioterapia, en comparación con aquellos sin invasión mucosa endobronquial [11]. Sin embargo, la asociación entre la invasión mucosa endobronquial y los resultados de supervivencia en pacientes con CPCP no ha sido bien dirigida.
Este estudio está diseñado para determinar si la invasión mucosa endobronquial es un predictor independiente de supervivencia de los pobres en pacientes con CPCP, y para comparar el tiempo de supervivencia entre los pacientes con y sin invasión de la mucosa endobronquial en toda la cohorte y en subgrupos estratificados como etapas limitadas y extensas.
pacientes y métodos
sujetos de estudio
los registros médicos de de enero de 1998 hasta 2005 se han revisados de diciembre para todos los pacientes con diagnóstico de cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) en el hospital Memorial Chang Gung, Taiwán, un centro de transferencia de tercer nivel. El diagnóstico se basa en el examen histológico de muestras de biopsia o en forma de aguja fina citología por aspiración. Hubo 765 pacientes con CPCP durante este período de tiempo. Todos los pacientes habían sido explicados sobre las indicaciones de la broncoscopia, que es una parte de los procesos de diagnóstico. Entre ellos, 432 pacientes recibieron la broncoscopia para el tejido de la prueba y la puesta en escena de SCLC, y fueron incluidos en el análisis. Los pacientes sin la broncoscopia, o pacientes con enfermedades malignas previas o coexistentes distintos de SCLC fueron excluidos del análisis. No examen broncoscópico adicional se realizó para este estudio. La junta de revisión institucional de Chang Gung Memorial Hospital aprobó el estudio y dispensado el requisito de consentimiento informado. Un certificado de aprobación de IRB del estudio en la versión Inglés se ha unido junto con el permiso firmado del paciente representativo de la broncoscopia en Inglés y la versión china en los archivos de soporte.
Estudios y procedimientos diagnósticos
todos los pacientes tenían una historia clínica completa, examen físico, evaluación del estado funcional y las investigaciones para definir el grado de su enfermedad, que incluía la hematología de rutina y la bioquímica, la radiografía de tórax, broncoscopia, tomografía computarizada (TC) del tórax, incluido el parte superior del abdomen o el examen de ultrasonido del abdomen, y gammagrafía ósea. bioquímica de rutina incluye aspartato aminotransferasa (AST), alanina aminotransferasa (ALT), fosfatasa alcalina (AlkP), lactato deshidrogenasa (LDH) y la medición de los electrolitos séricos (sodio, potasio, y cloruro), creatinina sérica y el nitrógeno ureico en sangre. Una tomografía computarizada del cerebro no era obligatorio que los síntomas neurológicos estaban presentes. Los pacientes se clasificaron en estadio limitado o enfermedad en estadio según la Administración del cáncer de pulmón Grupo de Estudio de Veteranos [5]. enfermedad Limited (LD) se definió como que se limita a una tórax, incluyendo los ganglios mediastínicos y supraclaviculares bilaterales; cualquier implicación más allá de estos límites se definió como enfermedad extensa (ED). Los pacientes con derrame pleural se incluyeron en la categoría ED. El estado del Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) el rendimiento [12] y la localización del tumor en el diagnóstico inicial de SCLC se registraron. participación extra-pulmonar se define como CPCP con metástasis a distancia que no sea intratorácica metástasis en los ganglios linfáticos.
Tratamiento
El estudio también registró terapias administradas en todos los pacientes, incluyendo la radioterapia, la quimioterapia, concurrente quimio-radioterapia (CCRT) y mejor tratamiento de soporte. La quimioterapia etopósido denotado (60 mg /m
2) dada en el día 1 y cisplatino (60 mg /m
2) dada en el día 1-3 sobre una base mensual durante 4-6 ciclos como la quimioterapia de primera línea. En los pacientes que no responden a la quimioterapia de primera línea o intolerantes a la toxicidad, topotecan (1,2 mg /m
2) dada en el día 1-5 mensualmente se prescribe en su lugar. En este estudio, 161 pacientes (51,2%) recibieron menos de 3 ciclos de quimioterapia, 99 (31,5%) recibieron 3 a 5 ciclos de quimioterapia, y 54 (17,2%) recibieron 6 ciclos de quimioterapia. Hubo 30 pacientes que recibieron 2
ª línea de quimioterapia topotecan. CCRT incluye la administración de la radioterapia torácica concurrente con etopósido y cisplatino en las primeras 6 semanas de quimioterapia.
Estudio broncoscopia
La ubicación probable de la lesión se determinó inicialmente por el posterior convencional anterior radiografía de tórax con o sin TC de tórax. A continuación, se inserta un broncoscopio de fibra óptica flexible (BF-P240 o BF-40, Olympus, Tokio, Japón) a través de las fosas nasales después de aerosol local de la xilocaína al 2% para la anestesia. La saturación de la frecuencia cardíaca y el oxígeno de cada paciente se controló mediante un oxímetro de pulso durante el procedimiento. En todos los pacientes, se realizó una inspección visual de la laringe, cuerdas vocales, tráquea, carina, y todos los orificios segmentarias de ambos pulmones. La solución salina normal fue inculcado a través del broncoscopio, con la aspiración de los lavajes para su examen citológico. Las biopsias bronquiales se realizaron con fórceps, y se tomaron un mínimo de tres biopsias. Las biopsias bronquiales se realizaron en las lesiones sospechosas, incluyendo nódulos endobronquiales y el estrechamiento o la obliteración de la luz bronquial por la mucosa inflamada. la participación de la mucosa fue confirmado por el examen histológico (Figura 1). La invasión de la mucosa endobronquial se definió como tumor se extiende por encima de la lámina propia de la mucosa. Cada paciente recibió al menos 3 piezas de muestras (4,5 quiere decir, entre 3 y 6) desde el sitio involucrado. Todas las muestras fueron embebidas en parafina y se cortaron al mismo engrosamiento a una distancia fija en 4 diapositivas. El paciente será clasificado si alguna de las diapositivas presentadas por el tumor se extiende por encima de la lámina propia.
(A) inicial radiografía de tórax mostró lesiones hiliares derechas. (B) La broncoscopia reveló bronquio estrechado debido a la compresión externa (figura superior), y la invasión de la mucosa (figura inferior). (C) En el examen histológico del tejido de biopsia, la invasión de la mucosa endobronquial (EMI) se ha identificado con el tumor (flecha fina) se extiende por encima de la lámina propia (flecha gruesa) bajo examen campo de alta potencia (400X).
Métodos estadísticos
se emplearon estadísticas descriptivas para examinar las características demográficas de la población de estudio. El tiempo de supervivencia se expresó como mediana y rango intercuartil (IQR). Las variables entre los dos grupos se compararon mediante la prueba t de Student para variables continuas y el chi-cuadrado o la prueba exacta de Fisher para las variables categóricas. El análisis univariado fueron utilizados principalmente para la selección de variables, sobre la base de un valor de p inferior a 0,1. Las variables seleccionadas se introdujeron en un análisis multivariable de regresión por pasos que identifica los efectos netos de cada factor individual. Se utilizaron los odds ratios (OR) y su 95% intervalo de confianza (IC) para evaluar la contribución independiente de los factores importantes. Las variables seleccionadas fueron analizados con el modelo de riesgos proporcionales de Cox para ajustar por posibles efectos de confusión entre unos y otros factores. Se utilizó razón de riesgo (HR) con un intervalo de confianza del 95% (IC) para informar del resultado. Las curvas de supervivencia se estimaron mediante el método de Kaplan y Meier, y las curvas se compararon de acuerdo con uno de los factores por la prueba de log rank. Los análisis se realizaron utilizando el software SPSS versión 12.0 (Chicago, IL, EE.UU.).
Resultados
Características de los pacientes
La Tabla 1 enumera las características de los pacientes, incluyendo el sexo, la edad, el tabaquismo el estado, el estado funcional, la estadificación clínica, quimioterapia recibida y la localización del tumor. Hubo 364 (84%) de los pacientes encontró que tenían la invasión de la mucosa endobronquial por las células cancerosas en la broncoscopia. Las características de los pacientes con o sin invasión de la mucosa endobronquial son similares (Tabla 1), aunque los pacientes con invasión mucosa endobronquial tendían a tener menos ciclos de quimioterapia debido a una mala respuesta a la quimioterapia y la progresión de la enfermedad más rápida.
La duración de la supervivencia
La mediana de supervivencia de todos los pacientes con CPCP fue de 161 (RIC), 46-348 días; 206 (IQR, 79-403) días para los pacientes en etapa limitada, y 137 (IQR, 40-314) días para los pacientes en etapa extensa (Tabla 2). Utilizando el análisis de Kaplan-Meier, el tiempo de supervivencia se midió a partir de la fecha de diagnóstico, y la muerte por todas las causas durante el período de seguimiento fue tomada como el resultado. Los pacientes con invasión de la mucosa tenían una peor supervivencia que los pacientes sin (hazard ratio [HR] 2,03; IC del 95%: 1,55 a 2,42, p & lt; 0,0001) (Figura 2). La mediana de supervivencia para los pacientes con invasión de la mucosa endobronquial fue de 145 (IQR, 39-322) días, mientras que la mediana de supervivencia para aquellos sin invasión de la mucosa fue de 290 (IQR, 129-626) días. En los pacientes en etapa extensa, los pacientes con invasión de la mucosa endobronquial tenían una peor supervivencia que los que no tienen (HR 1,8; IC del 95%: 1,27 a 2,33; p = 0,0005) (Figura 3) con una supervivencia media más corta de 125 días (IQR, 31-277 días , P & lt; 0,001) en comparación con la de los pacientes con mucosa intacta (207 días, IQR, 123-449 días). En los pacientes en etapa limitada, los pacientes con invasión de la mucosa endobronquial también tenían una peor supervivencia que los que no tienen (HR 2,27, IC del 95%: 1,57 a 3,04, p & lt; 0,0001) (Figura 4) con una supervivencia media más corta de 180 días (IQR, 60-353 días; p & lt;. 0,001) en comparación con la de los pacientes con mucosa intacta (460 días, IQR, 215-742 días) guía empresas
La línea discontinua representa pacientes con mucosa intacta; la línea continua representa los pacientes con invasión de la mucosa
La línea discontinua representa pacientes con mucosa intacta.; la línea continua representa los pacientes con invasión de la mucosa
La línea discontinua representa pacientes con mucosa intacta.; la línea continua representa los pacientes con invasión de la mucosa.
Análisis univariante
El análisis univariante (Tabla 3) nos permitió identificar los posibles factores potencialmente asociados con el tiempo de supervivencia menor que la mediana de supervivencia ( 161 días) en pacientes con CPCP de toda la cohorte. Se analizó la asociación entre la disminución de días de supervivencia y variables como la edad, el género, el estado funcional, la estadificación clínica, la invasión de la mucosa y la administración de la terapia de los pacientes. Los resultados revelaron que la edad (OR, 1,04; IC del 95%, 1.2 a 1.5), extensa etapa (OR, 1,61; IC del 95%, 1,10-2,36), y la invasión de la mucosa endobronquial (OR, 2,21; IC del 95%, 1.28- 3,80) se asociaron significativamente con una disminución en la supervivencia, mientras que un buen estado funcional con la escala ECOG ≤2 (OR, 0,19; IC del 95%, 0,12 a 0,30) y la quimioterapia que recibe más de 4 ciclos (OR, 0,41; IC del 95%, 0,30 -0,56) están asociados con una mejor supervivencia. En los pacientes con el tamaño del tumor medible, el análisis univariado reveló ninguna diferencia en tamaño entre los pacientes con una supervivencia más larga y los que tienen una menor supervivencia (5,70 ± 3,74 vs 5,61 ± 2,22, p = 0,432; respectivamente).
El proporcionales de Cox de Análisis de Peligros
La prueba de Chi-cuadrado reveló altas correlaciones entre buen estado general con la escala ECOG ≤2 y la quimioterapia recibieron (p & lt; 0,0001). Sin embargo, no hubo correlación significativa entre la edad identificada, extensa etapa, la invasión de la mucosa endobronquial, y la quimioterapia recibida. Por lo tanto, la edad, la etapa extensa, la invasión de la mucosa endobronquial, y la quimioterapia recibida se introdujeron en el modelo de riesgos proporcionales de Cox. Los resultados (Tabla 4) mostraron que la edad (HR, 1,04; IC del 95%, 1.3 a 1.6), extensa etapa (HR, 1,39; IC del 95%, 1,06-1,84), y la invasión de la mucosa endobronquial (HR, 2,01; 95% CI, 1.30 a 3.10) fueron factores que contribuyen independientes para la supervivencia más corta, mientras que la quimioterapia recibida (HR, 0,32; IC del 95%, 0,25-0,42) fue un factor que contribuyó independiente para un mejor resultado
Discusión
Este estudio demostró que el 84% (364/432) de los pacientes con SCLC tenía la invasión de la mucosa endobronquial por las células cancerosas mientras que el cáncer fue diagnosticado inicialmente. A pesar de las características basales fueron similares entre los pacientes con y sin participación endobronquial, los pacientes con CPCP con afectación de la mucosa endobronquial estaban en riesgo significativamente mayor de la disminución de los tiempos de supervivencia incluso después de ajustar la edad de los sujetos, el sexo, la estadificación clínica y la terapia administrada. Entre los pacientes con CPCP de cualquiera de las etapas limitadas o extensas, la mediana de supervivencia para los pacientes con invasión de la mucosa endobronquial era más baja que los que no tienen, respectivamente.
Muchos estudios han tratado de identificar los parámetros clínicos y de laboratorio para predecir la supervivencia a largo plazo en el cáncer de pulmón de células pequeñas [6], [7], [13], [14]. Compatible con los informes anteriores, nuestros resultados también indicaron que la edad [6] y la extensa etapa [7] fueron factores contribuyentes independientes para la supervivencia más breve, al recibir quimioterapia [7] no menos de 4 cursos fue un factor que contribuyó independiente para un mejor resultado. Recientemente, otros factores pronósticos como línea de base tanto el número de células tumorales circulantes y el cambio en el número de células tumorales circulantes después de la quimioterapia se han reportado como un factor pronóstico independiente para el CPCP [15]. Un estudio informó de una tasa mucho más alta de recaída del tumor y una peor respuesta a la quimioterapia en pacientes con CPCP con hallazgos anormales en el examen broncoscópico [11]. Sin embargo, su estudio no utilizó un análisis multivariado para evaluar el poder predictivo independiente de la afectación de la mucosa endobronquial en la supervivencia. Por medio de riesgos proporcionales de Cox modelo, nuestro estudio revela que la invasión de la mucosa endobronquial es un factor pronóstico independiente de mal pronóstico en pacientes con CPCP incluso bajo el control de otras variables asociadas. El poder predictivo de mala supervivencia de afectación de la mucosa endobronquial es tan fuerte como la de la etapa extensa. Por lo tanto, aparte de los pronosticadores reconocidas en la actualidad, circulan número de células tumorales y la invasión de la mucosa endobronquial puede ser tomado en consideración para la estratificación del riesgo de los pacientes en la práctica clínica y ayudando a los médicos a tomar decisiones adecuadas de tratamiento para los pacientes individuales
.
A pesar de que se cree que SCLC surge de o está relacionado con las células neuroendocrinas pulmonares [2], [3], la evidencia emergente también indica la posibilidad de que una célula no neuroendocrino, tales como células de adulto pulmonares madre y células progenitoras [16], pueden adoptar características neuroendocrinas a través de la mutación de genes [17]. El paso clave de la invasión mucosa endobronquial es la interrupción de la membrana basal por las células cancerosas. Los estudios previos [18], [19] han propuesto un modelo de invasión y metástasis por células de cáncer en el que la membrana basal (BM) desempeña un papel importante como una barrera contra la invasión de células tumorales [20]. Ha habido varios informes que afirman que la interrupción de la BM en diversos tumores significativamente correlacionado con la progresión del tumor y por lo tanto, con reducción de la supervivencia de los pacientes [21] - [24]. La asociación entre la invasión mucosa endobronquial y pobre supervivencia en pacientes con CPCP podría atribuirse a una mayor invasividad tumoral con liberación de enzimas proteolíticas que resulta en la degradación del BM. La expresión de E-cadherina, una célula-célula receptor de adhesión dependiente de calcio que restringe la invasión de células y reduce la metástasis, en las células tumorales ofrece una supervivencia global favorable en pacientes de SCLC [25]. Por otro lado, la activación o la alternancia de la vía de c-Met conduce a la proliferación celular más alta y la capacidad de invasión se asocia con un mal pronóstico en SCLC [25] - [27]. Aunque se propusieron miRNAs estar implicado en la alternancia del comportamiento biológico del tumor SCLC, tales como la invasividad tumoral o quimio-resistencia [28], [29], un estudio reciente no encontró ninguna miARN reportado fue de pronóstico o relacionada con el comportamiento maligno en pacientes con CPCP [30 ]. La interrupción en el control epigenético de la proliferación celular, incluyendo la metilación del ADN [31], [32] se ha demostrado que contribuyen a la supervivencia celular prolongada y descontrolada. Nuevos estudios se requieren para investigar si existen perfiles aberrantes miARN o alteración epigenética, o la expresión de E-cadherina o la activación de c-Met en SCLC con un alto potencial para la invasión de la mucosa endobronquial.
Incluso estratificada como la etapa limitada o extensa , la presencia de invasión mucosa endobronquial entre los pacientes con CPCP también predice una disminución de la supervivencia en cada subgrupo. Curiosamente, el tiempo medio de supervivencia (207 días) para los pacientes con extensa escena SCLC y la invasión mucosa endobronquial es similar a la mediana de supervivencia para los pacientes con SCLC limitado por etapas en toda la cohorte (206 días). La presencia de invasión mucosa endobronquial puede ser utilizado para identificar a los pacientes en mayor riesgo de mala evolución. A partir de entonces, la broncoscopia de rutina para la invasión endobronquial y monitoreo frecuente durante el tratamiento puede ser considerado para todos los pacientes con CPCP. Para los pacientes con invasión de la mucosa endobronquial, incluso en etapa limitada, la intervención terapéutica intensiva puede ser considerado. Sin embargo, el impacto de la invasión endobronquial en los resultados de SCLC deben ser confirmadas por otros estudios prospectivos. Además, la combinación de un sistema de estadificación Administración de Veteranos Affair pulmón Cancer Study Group y la presencia de invasión mucosa endobronquial puede proporcionar un mejor poder predictivo para el pronóstico en pacientes con CPCP.
En conclusión, el presente estudio mostraron que los pacientes con CPCP con la participación de la mucosa endobronquial tenido un menor tiempo de supervivencia que los pacientes sin afectación mucosa endobronquial. La participación de la mucosa endobronquial es un predictor independiente de supervivencia disminuye en pacientes con CPCP, incluso después de tener la edad, el sexo, la estadificación clínica, y el tratamiento administrado en cuenta. Nuestro estudio avanza la idea de que la detección de la invasión de la mucosa mediante broncoscopia es obligatoria en pacientes con CPCP. La presencia de afectación mucosa endobronquial puede ofrecer un nuevo predictor de resultados y ser utilizado en la estratificación del riesgo en pacientes con CPCP.
Apoyo a la Información
documento S1.
Un certificado de IRB de la aprobación del estudio en la versión Inglés.
doi: 10.1371 /journal.pone.0047613.s001 gratis (PDF) Documento
S2.
permiso firmado del paciente Representante para la broncoscopia en la versión Inglés.
doi: 10.1371 /journal.pone.0047613.s002 gratis (PDF) Documento
S3.
permiso firmado del paciente Representante para la broncoscopia en la versión china.
doi: 10.1371 /journal.pone.0047613.s003 gratis (PDF)