Extracto
El cetuximab, un anticuerpo monoclonal quimérico desarrollado para la orientación del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), ha sido intensamente utilizado para tratar a pacientes con cáncer con cáncer colorrectal metastásico y el cáncer de cabeza y cuello. anticuerpo intacto inmunoglobulina G (IgG) como cetuximab, sin embargo, tiene algunas limitaciones tales como el alto costo de producción y la baja tasa de penetración de la vasculatura en la masa tumoral sólida debido a su gran tamaño. En un intento de superar estas limitaciones, hemos diseñado cetuximab para crear una sola cadena fragmentos variables (scFv-CH3; minicuerpo) que se expresaron en el sistema bacteriano. Entre tres minicuerpos ingeniería, encontramos que MI061 minicuerpo, que se compone de la región pesada variable (V
H) y ligera (V
L) unidos por un enlazador peptídico de 18 residuos, muestra una mayor solubilidad y una mejor extracción inmuebles de lisado bacteriano. Además, hemos validado que purificada MI061 interfiere significativamente la unión del ligando al EGFR y bloquea la fosforilación de EGFR. Mediante el uso de un microarray de proteína compuesta de 16.368 proteínas humanas únicas que cubren alrededor de las proteínas asociadas 2.400 membrana plasmática como receptores y canales, también hemos demostrado que MI061 sólo reconoce el EGFR pero no otras proteínas en comparación con cetuximab. Estos resultados indicaron que Engineered MI061 conserva tanto la especificidad de unión y afinidad de cetuximab para EGFR. Aunque tenía relativamente corta vida media en el suero, se demostró ser altamente significativo efecto anti-tumor mediante la inhibición de ERK en el modelo de xenoinjerto A431. Tomados en conjunto, nuestro estudio proporciona evidencia convincente de que Minianticuerpo ingeniería es más eficaz y agente prometedor para el
in vivo
dirección a tumores sólidos
Visto:. Kim YP, Parque D, Kim JJ, Choi WJ, Lee SH, Lee SY, et al. (2014) Enfoque terapéutico eficaz para el cáncer de cabeza y cuello por un Engineered Minianticuerpo dirigirse al receptor EGFR. PLoS ONE 9 (12): e113442. doi: 10.1371 /journal.pone.0113442
Editor: A. Shaida Andrabi, Johns Hopkins University, Estados Unidos de América
Recibido: July 9, 2014; Aceptado: 23 de octubre de 2014; Publicado: Diciembre 1, 2014
Derechos de Autor © 2014 Kim et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Esta investigación fue apoyada por el Programa Básico de Investigación de Ciencias a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), financiado por el Ministerio de Ciencia, ICT & amp; Planificación futura (Nº 2011-0.030.043 & amp; 2012-R1A1A1013558). Este trabajo también fue apoyado en parte por una subvención del Plan Nacional de I & amp; D Programa de Control del Cáncer, Ministerio de Salud y Bienestar, Corea (131.280). Sinil Pharmaceutical Company proporcionó apoyo en forma de salarios de los autores YPK, SHL, WC, y JL. YL también recibió el sueldo de Samsung Instituto de Tecnología Avanzada (SAIT). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores han leído la política de la revista. YPK, SHL, WC, y JL son empleados de la compañía farmacéutica Sinil y recibieron el sueldo de ellos. YL es empleado de Samsung Instituto de Tecnología Avanzada (SAIT) y también recibió el sueldo de SAIT. No hay productos en desarrollo o los productos comercializados que declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) es uno de la familia ErbB de receptores tirosina quinasa [1]. Mediados por ligandos de señalización tales como cualquiera de PI3K /AKT o vía RAS /ERK regula diversos procesos celulares incluyendo la supervivencia celular, la muerte, el crecimiento, la proliferación y motilidad de EGFR [2]. La desregulación de EGFR por su sobreexpresión o mutación conduce al desarrollo de una amplia gama de cánceres epiteliales, por ejemplo, de mama, colon, cabeza y cuello, riñón, pulmón, páncreas, y cáncer de próstata [3] - [5]. Esta es una razón fundamental para el desarrollo de interferente EGFR como agentes antitumorales en el tratamiento del cáncer [5]. Última década, dos clases principales de inhibidor de EGFR se han desarrollado para orientar el EGFR. La primera clase, incluyendo inhibidores de tirosina quinasa gefitinib y erlotinib, actúa mediante la unión competitiva al bolsillo ATP del EGFR. La segunda clase, los anticuerpos monoclonales tales como cetuximab y panitumumab, puede interferir la unión del ligando de EGFR [6], [7]. Ambas clases de agentes muestran una actividad antitumoral significativa en una gama de modelos de xenoinjerto de ratón de EGFR dependiente de [7], [8]. Especialmente, el cetuximab, un anticuerpo monoclonal dirigido EGFR, ha sido intensamente estudiado como un agente anti-cáncer aprobado por la FDA para el tratamiento de cáncer de cabeza y cuello [9].
La terapia dirigida utilizando las IgG intactas como cetuximab tiene particular la mejora de mal pronóstico y la supervivencia global en pacientes con cáncer [10]. Sin embargo, a pesar de su alta eficacia antitumoral, el uso de IgG enteros intactos para la terapia del cáncer es limitado debido a los altos costos de producción, debido a la necesidad de un sistema de expresión de mamífero, y la mala tasa de penetración en los tejidos tumorales [11]. Por lo tanto, la necesidad imperiosa de anticuerpo manipulado producido a partir sistema bacteriano se ha incrementado y un puñado de estudios han establecido diversas estructuras de base de Minianticuerpo ingeniería en la diversidad de IgG intacta [11], [12].
Para superar temas de actualidad, se generan fragmentos variables de cadena sencilla (scFv) expresados en
E. coli
basado en el anticuerpo parental, cetuximab. Los scFv ingeniería no sólo tiene el fin del dominio de V
H y V
región de L, pero también polipéptido enlazador flexible compuesta de 18 restos de aminoácidos entre V
H y V
dominios L para la producción efectiva y la estabilidad. La región scFv (en lo sucesivo Minianticuerpo) estaba conectado con C
H3
a través de
región bisagra. En el presente estudio, la ingeniería Minianticuerpo (V
H-18Linker-V
L-bisagra-C
H3) se caracterizó
in vitro Opiniones y comparación con cetuximab por su
in vivo aplicación de Windows en el modelo de xenoinjerto.
Materiales y Métodos
Construcción de MI045, MI053 MI061 y vectores de expresión
Para construir el MI045 (VL-VH-Enlazador ), los fragmentos de ADN que codifican dominios VL y VH fueron sintetizados basados en las secuencias de aminoácidos (primera-107a aa) de la cadena a del fragmento Fab Cetuximab (GenBank adhesión no. 1YY8_A) y las secuencias de aminoácidos (aa primera-119a) de la cadena B del fragmento Fab Cetuximab (GenBank adhesión no. 1YY8_B), respectivamente. Los clásicos (G4S) 3 secuencias (GGGGSGGGGSGGGGS) se utilizaron como un enlazador [13]. La MI053 fue creado por un método similar excepto que la longitud y secuencias del enlazador, constaba de 18 aa (GSTSGSGKPGSGEGSTKG) derivado de M218 Whitlow enlazador [14]. La MI061 tiene la misma estructura en comparación con MI053 excepto fin dominio de VH y VL. El fragmento de ADN que codifica un dominio bisagra-CH3 también se sintetizó en base a las secuencias de aminoácidos de IgG-1 humana. La secuencia de la bisagra se modificó para 15 aa (EPKSPKSADKTHTAP). Los codones han sido optimizados para
E. coli
expresión. Cada fragmentos de ADN scFv fueron digeridos con
BamHI
y
HindIII
y la bisagra-C
H3 fragmento de ADN digerido con
HindIII
y
XhoI
se insertaron en pET26b. Estas construcciones contenían la secuencia líder pelB en el extremo N-terminal para la expresión periplásmica en BL21 (DE3), y contenían residuos de 6-histidina en el extremo C-terminal para la purificación por afinidad.
Expresión y purificación de Minianticuerpo
Cada constructo que codifica para MI045, MI053 MI061 y se transformó en
e. coli
BL21 (DE3). colonias crecidas se cultivaron a 37 ° C durante toda la noche con agitación vigorosa, y luego se inoculó en caldo L fresco 1 LB 1 ml de esta pre-cultivo. La expresión de proteínas se indujo por la adición de IPTG a una concentración final de 0,4 mM cuando la densidad óptica a 600 nm alcanzó 0,5 hasta 0,6. Los cultivos se recogieron y se resuspendieron con 100 ml de tampón de PBS que contenía PMSF 1 mM, 0,2 mg /ml de DNasa I, y 0,2 mg /ml de RNasa A, y luego interrumpidas por sonicación. Los extractos de proteínas solubles se obtuvieron por centrifugación a 20.000 rpm durante 20 min a 4 ° C y se incubaron con Ni
2 + NTA columna de resina (GE Healthcare Life Science, EE.UU.) de acuerdo con el manual del proveedor. La columna se lavó con 30 volúmenes de columna de PBS que contenía imidazol 50 mM, y las proteínas unidas se eluyeron luego con 10 volúmenes de columna de PBS que contenía imidazol 400 mM. Las proteínas purificadas se analizaron mediante 12% de SDS-PAGE. Las concentraciones de proteína se determinaron mediante el método del ácido bicinconínico (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.)
Proteína humana microarrays
El Proteoma Humano Microarray HuProt fue adquirido de los laboratorios CDI (http:. //www.cdi-lab.com). El chip incluye 16.368 proteínas únicas de longitud completa humana recombinante por duplicado junto con varias proteínas de control, tales como IgG, GST, BSA-biotina, y las histonas tal como se describe anteriormente [15]. Antígeno especificidad tanto minicuerpo y cetuximab unión (Erbitux, Merck, Darmstadt, Alemania) se midieron mediante el uso de Alexa-Fluor 546 o 647 de anticuerpo IgG anti-humano conjugado (Invitrogen, Carlsbad, CA). anticuerpo monoclonal anti-GST de ratón (Invitrogen) se utilizó como control. En pocas palabras, el chip de proteína se incubó primero con tampón de bloqueo (BSA al 5% en PBS con 0,05% (v /v) de Tween 20) durante 30 min a RT y luego minicuerpo (32 nM), cetuximab (32 nM) o anti-ratón anticuerpo monoclonal GST se incubaron adicionalmente bajo la LifterSlip (Thermo Scientific, EE.UU.) durante 1 hora a RT. Después de lavar tres veces con 1x PBS que contenía 0,05% de Tween 20 por agitación suave durante 10 min cada uno, el microarray se incubó con Alexa-Fluor anticuerpo conjugado. Posteriormente, el microarray se lavó tres veces y luego se obtuvieron los valores de la señal de la sonda utilizando un software GenePix Pro 6.0 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
Cultivo de células y reactivos
El A431 células (KCLB, Seoul, Corea) se cultivaron en medio RPMI 1640 (Gibco, Karlsruhe, Alemania) suplementado con 10% de suero bovino fetal (Hyclone, Logan, UT, EE.UU.), 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina ( Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.). Las células fueron cultivadas a 37 ° C, 5% de CO
2 en un ambiente humidificado.
Análisis de citometría de flujo para la unión del anticuerpo de ensayo
Para confirmar cetuximab, MI053 MI061 y unión a EGFR , citometría de flujo se realizó usando la línea celular A431, que expresa altos niveles de EGFR. Un total de 1 × 10
5 células se incubaron con cetuximab, MI053 o MI061 en 2 ug /ml durante 30 min en hielo y se lavaron dos veces con tampón de tinción (1% BSA /PBS), seguido de una incubación de 30 min con 4 ug /ml de una cabra marcado con FITC contra Fc mAb humano (Sigma). Las células fueron analizadas por un flujo Accuri C6 citómetro (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.).
El ensayo de unión competitiva
Las células A431 se ajustó a 1 × 10
5 células /tubo y se incubaron con 6 marcado con FITC nM ligando EGF (Molecular Probes, Leiden, Países Bajos), además de los competidores fríos pertinentes, que son cetuximab y MI061 (2 ug /ml) durante 30 min a 4 ° C. A continuación se lavaron tres veces para eliminar los materiales no unidos, las células fueron analizadas por un flujo Accuri C6 citómetro (BD Biosciences) para determinar la cantidad relativa de EGF marcado con FITC unido.
inmunoensayo
Los 96 pozos inmunoplaca (SPL, Seúl, Corea) se recubrieron con sEGFR (fitzgerlad Industries International, MA, EE.UU.) se reconstituyó en 200 mM de Na
2CO
3 (pH 9,6). La placa se bloqueó con 200 ul /pocillo de 1X solución de bloqueo (Sigma), sellado y almacenado 4 ° C hasta su uso. Las diluciones de cetuximab (de 2 mg /ml) se prepararon en una gama de 1:10-1:4096000 mediante dilución en serie con PBS para la curva estándar. Para el inmunoensayo de la actividad minicuerpo, se añadió el plasma diluido (1:50) en cada pocillo y la incuba a temperatura ambiente durante 1 hr. A continuación, cada pocillo se lavó tres veces con PBS-T (solución salina tamponada con fosfato con 0,05% de Tween 20) y 100 l /pocillo de anticuerpo 1:100 ratón anti-humano IgG (C
dominio H3) (Thermo Scientific, Rockford , se añadió IL, EE.UU.). La cada pocillo se incubó durante 1 hr y después se añadió IgG anti-ratón HRP (Sigma) anticuerpo secundario. Para evaluar la concentración minicuerpo en plasma, la cada pocillo se lavó tres veces con PBS-T y anticuerpo de conejo IgG específica anti-Fab humano (Sigma) se incubó durante 1 hr, junto con anti-conejo HRP IgG (Sigma) secundario. Después de lavar con PBS-T, se añadieron 100 l /pocillo de sustrato TMB (Sigma) a cada pocillo y se incubó durante 10 min a TA. La reacción se detuvo por 1 MH
2SO
4 y la placa fue luego leer en un lector de placas a 450 nm.
Para determinar la vida media de MI061, se recogieron las muestras de sangre a 1 , 3, 6, 24 y 48 horas después de la inyección inicial (ip, 0,3 mg /ratón) y las muestras de plasma heparinizado se separaron inmediatamente mediante centrifugación (13.000 rpm durante 5 min a 4 ° C). La concentración de Minianticuerpo se estimó usando métodos no compartimentales con BA calc 2007 (KFDA, Seúl, Corea).
ensayo de fosforilación
ensayos de fosforilación se realizaron en células A431 en presencia de cualquiera de cetuximab Fab (30 g /ml) o minicuerpo (30 mg /ml). Después de cultivar durante 8 horas, las células se estimularon con 10 ng /ml EGF durante 20 min a 37 ° C. Las células se lisaron y los niveles de proteína EGFR fosforilados se midieron usando el PathScan fosfo-EGF Receptor (Tyr845) Sandwich ELISA Kit (señalización de la célula) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
modelo de xenoinjerto
Seis a atímicos macho de siete semanas de edad, los ratones (nu /nu) fueron adquiridos de Nara biotech (Seúl, Corea). Los animales fueron alojados en condiciones libres de patógenos en jaulas microisolator con comida de laboratorio y agua disponible
ad libitum
. xenoinjertos A431 fueron establecidos por s.c. la inyección de entre 5 × 10
6 células /100 l de PBS en el flanco izquierdo de los ratones sin timo. El volumen del tumor se calculó cada 2-3 días con un calibrador digital y utilizando la siguiente fórmula: Volumen = longitud x anchura x altura. Los tumores se dejaron crecer hasta un volumen de 100 mm
3, y los ratones se asignaron al azar en grupos de seis animales cada uno. Los ratones se trataron con solución salina Q3D, cetuximab a 0,25 mg /ratón (Q3D), cetuximab Fab a 0,25 mg /ratón (Q3D), y MI061 a 0,25 mg /ratón (q7d). Todos los fármacos se administraron por vía i.p. inyección. El tratamiento de animales se continuó durante la duración del estudio. Al final de cada punto de tiempo, los ratones fueron sacrificados con CO
2 asfixia. El análisis estadístico del crecimiento del tumor para cada uno de los estudios se determinó mediante un
Estudiante de búsqueda: '
s prueba t
utilizando el programa informático SigmaStat (Jandel, San Rafael, CA, EE.UU.). Los ratones fueron mantenidos de acuerdo con las políticas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Konkuk (IACUC). El estudio llevado a cabo en el presente documento fue aprobado por el IACUC Universidad de Konkuk (Número de Registro .: KU14024).
Immunohistochemisry (IHC)
tejidos tumorales extirpados fueron preservados en formalina al 10% tamponada neutra para la tinción IHC. procedimientos de tinción IHC para EGFR total fueron como sigue: parafina se agota de un portaobjetos y se incubó con solución de pepsina durante 15 min a 37 ° C. Las secciones de tejido se cubrieron con 3% de H
2O
2 para bloquear la peroxidasa endógena durante 10 min a temperatura ambiente. Las láminas fueron incubadas con el anticuerpo anti-EGFR en 1:100 (Cell Signaling Technology, IL, EE.UU.) durante 18 horas a 4 ° C. Después de lavar con TBS, los portaobjetos se incubaron con un anticuerpo secundario (DAKO Japón, Kyoto, Japón) durante 30 min a temperatura ambiente. tinción de tejidos se visualizó utilizando una solución de sustrato cromógeno DAB (3,3 'Diaminobencidina). IHC tinción para la proteína EGFR fosforilado se llevó a cabo como sigue: Después de que el mismo pre-procesamiento del anticuerpo anti-EGFR como se describió anteriormente, las secciones de tejido fueron bloqueadas con el bloque de la proteína para prevenir reacciones no específicas por 10 min a temperatura ambiente libre de suero. Las láminas fueron incubadas con el anticuerpo primario p-EGFR (Tyr845) a las 1:50 (La señalización celular) durante 18 horas a 4 ° C. Los portaobjetos se incubaron después con el anticuerpo secundario (DAKO Japón) durante 15 min a temperatura ambiente. tinción de tejidos se visualizó usando una solución de DAB sustrato cromógeno. Las diapositivas se counterstained con hematoxilina, se deshidrataron y se montaron.
Análisis de transferencia Western
Para el análisis de transferencia Western de MI045 purificado (0,23 g /carril), MI53 (0,55 g /carril) y MI061 (1,30 g /carril), las muestras de proteína se separaron inicialmente en 12% de geles de SDS-PAGE y transferidos a una membrana de nitrocelulosa (Thermo Scientific, EE.UU.). La membrana se inmunotransferencia con primario anti-C
A567H anticuerpo de dominio H3 (Thermo Scientific, EE.UU.) y cada proteína se visualizó mediante incubación con anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado con HRP secundario. Para comprobar los niveles de expresión de EGFR, p-EGFR, p-AKT, ERK y p-ERK en las células tumorales mediante análisis de transferencia Western, las masas tumorales se retiraron del flanco de los ratones y se homogeneizó. Las muestras de proteínas que contienen la misma cantidad de proteínas totales (40 g /pocillo) se extrajeron y separaron sobre 12% de geles de SDS-PAGE y después se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Los anticuerpos primarios, receptor de EGF (Señalización celular), el receptor de fosfo-EGF (Tyr1068) (Señalización celular), AKT pS473 (Rockland), p44 /42 MAPK (/2 Erk1) (Señalización celular), y fosfo-p44 /42 MAPK (Erk1 /2) anticuerpo (Thr202 /Tyr204) se utilizaron para inmunotransferencia según la proporción recomendada del fabricante (1:1000). La membrana se desarrolló y se visualizó usando Pierce ECL Plus Western Blot sustrato (Thermo Scientific, EE.UU.).
Resultados
Expresión y caracterización de minicuerpos ingeniería
Esta Minianticuerpo básicamente consiste en el V
H y V
L dominios unidos por un enlazador peptídico flexible, que puede afectar a la estabilidad y solubilidad del anticuerpo, y que estaban conectados con C
H3
a través de
región bisagra. A continuación, se generaron tres minicuerpos que comprenden diferentes longitudes de enlazador o inversamente pedimos V
H y V
dominios L (figura 1A). La primera minicuerpo que tiene relativamente corto enlazador fue nombrado MI045 y otro minicuerpo fue nombrado MI053 que tienen 15 o 18 residuos como un enlazador, respectivamente. El último consiste en intercambiado V
H y V
L de dominio, y nombrado MI061. Para explorar la naturaleza de tres minicuerpos ingeniería, la expresión de cada Minianticuerpo se probó en
E. coli
como se describe por Hu et al. [dieciséis]. fracción soluble de
E. coli
lisado aplicó a cromatografía de afinidad y resultó en la recuperación de minicuerpos altamente purificados sin ningún fragmentaciones en la transferencia Western (Fig 1B). Cada Minianticuerpo mostró el peso molecular estimado, y la tasa de recuperación de MI053 MI061 y mostró 3.4 o 4.4 veces más altas que MI045, respectivamente. Estos datos indican que 18 restos de enlazador son de hecho estructuralmente modelo adecuado de 15 residuos para retener la solubilidad. Curiosamente, se encontró que la eficiencia de recuperación de MI061 es mayor que MI053 (Fig 1B). Estos datos sugieren que la longitud del enlazador y el orden de dominio de las cadenas variables, que a su vez afectan a la solubilidad del anticuerpo, están asociadas con la naturaleza de minicuerpo.
(A) Ilustración esquemática de los constructos que codifican cada minicuerpo. (B) La purificación de Su-etiquetados Minianticuerpo de
E. coli
células. BL21 (DE3) las células se transformaron con cada construcción y minicuerpo producción fue inducida por la adición de IPTG. Su-etiquetados minicuerpos se purificaron usando una columna Ni-NTA. Las proteínas eluidas se resolvieron en 12% SDS-PAGE y se visualizaron por cualquiera de Coomassie Brilliant Blue (CBB) o análisis de inmunotransferencia con un anticuerpo anti-dominio CH3. Los números indican la tasa de recuperación en comparación con MI045. METRO; marcador de tamaño molecular, 1; extracto crudo, 2; proteínas solubles, 3; pellet, 4; fluir a través de, 5; lavado con imidazol 50 mM, 6; elución con imidazol 400 mM, BM; Western blot.
Actividad y especificidad de minicuerpos ingeniería
Con base en el rendimiento de recuperación de cada Minianticuerpo de lisado bacteriano, se seleccionaron dos MI053 MI061 y para el estudio adicional. Para medir su actividad en función de la orientación de dominio de regiones variables, que inicialmente se evaluó su actividad de unión a EGFR. células A431 que expresan alto nivel de EGFR se incubaron con anticuerpos, y el cambio posterior en la señal de fluorescencia se midió por un análisis de citometría de flujo basado láser. En consecuencia, todos los anticuerpos tratados provocaron un cambio en la señal de fluorescencia mayor que la de los controles no tratados (Fig 2A). Entre ellos, cetuximab mostró la mayor actividad de unión a EGFR. En particular, se confirmó que MI061 MI053 y también conservan una alta afinidad y eran capaces de fuerte unión a EGFR. La afinidad entre MI061and EGFR era más fuerte que la afinidad entre MI053 y EGFR. Estos datos indicaron que el orden de dominio de cadenas variables se asocia con afinidad de minicuerpo. Un enfoque alternativo para obtener la especificidad, el ensayo de competición se realizó usando un ligando de EGF marcado con FITC con el concepto de que la interferencia de la interacción entre el EGF y EGFR podría inhibir la activación del EGFR y su vía de señalización corriente abajo. Como resultado, cetuximab se compitió por completo con EGF, mientras que el tratamiento de MI061 inhibió parcialmente la unión con EGFR (Figura 2B). Para confirmar la capacidad inhibitoria de MI061 hemos analizado la densidad relativa de la fosforilación de EGFR (Figura 2C). tasa de fosforilación de EGFR inducida por EGF se analizó en las células A431 en presencia de cualquiera de los fragmentos Fab cetuximab (CT Fab), EGFR regiones de cetuximab, o MI061 de unión. El tratamiento de EGF con CT Fab suprimió la fosforilación relativa a alrededor de 50%. Del mismo modo, el tratamiento de EGF con MI061 también mostró mismo efecto en comparación con CT Fab. Aunque su afinidad de unión y especificidad fueron relativamente más bajo en comparación con cetuximab, MI061 fue capaz de reconocer fuertemente EGFR y suprimir la fosforilación de EGFR en el sistema celular. Para validar la especificidad de unión a antígeno de MI061, se utilizó el chip micromatriz proteína humana, que contiene 16.368 proteínas únicas marcada con GST de longitud completa humano (Fig 3A). El chip de proteína se trató en paralelo con cualquiera MI061 o cetuximab en relación molar igual durante 1 hora a RT. Las proteínas de unión con el anticuerpo se detectaron mediante el uso de Alexa Fluor-anticuerpo secundario conjugado. A continuación, el chip se escanea con un escáner GenePix 4100A. Para normalizar la señal de Alexa-Fluor, el chip de proteínas fue entonces sondeó con un anticuerpo anti-GST, seguido de la exploración. En el chip de micromatriz cada proteína, tanto MI061 y cetuximab mostró patrón de unión similar por duplicado con la misma intensidad, respectivamente (Fig 3B). Además, en una visión de alta potencia, que sólo unidos proteína EGFR, excepto para las proteínas de control tales como GST (Figura 3B, panel inferior).
(A) EGFR ensayo de unión. Cada anticuerpo se incubó con A431cells EGFR sobreexpresado y afinidad a continuación, la unión a EGFR fue analizado por la intensidad de FL1-H utilizando citometría de flujo (FACS) ensayo de competición (B) EGFR. marcado con FITC EGF se incubó con células A431 y su actividad de unión a EGFR se controló por FACS. Para el ensayo de competición, EGF se incubó a lo largo de las células, ya sea con cetuximab (panel izquierdo) o MI061 (panel derecho). ensayo de fosforilación (C) EGFR. La tasa de fosforilación relativa de EGFR inducida por cada anticuerpo se evaluó por ELISA usando un anticuerpo fosfo-anti-EGFR. El EGF se utilizó como control para la fosforilación de EGFR como se indica. datos cuantificados se expresan como media ± s. mi. metro.
* P & lt; 0,05. n.s, no significativo.
(A) Representación esquemática del proceso de microarrays de proteínas. (B) Los chips de proteínas se incubaron con MI061 o cetuximab, y las interacciones antígeno-anticuerpo se detectaron mediante el uso de Alexa-Fluor anticuerpo secundario conjugado. Después del lavado, cada chip fue escaneado por GenePix escáner a 532 nm (Cy3) y 635 nm (Cy5). Cada valor de señales de la sonda se obtuvo mediante el uso de software GenePix Pro 6.0. señal roja indica la intensidad de unión al antígeno de ambos MI061 y cetuximab. Todas las proteínas de fusión GST fueron detectados por el anticuerpo anti-GST y visualizados por fluorescencia verde como se indica. rectángulos blancos indican zona de ampliación para el panel inferior.
Efecto antitumoral de Minianticuerpo ingeniería
Para evaluar y caracterizar la farmacocinética (PK) de plasma de MI061, los parámetros farmacocinéticos fueron examinados en animales de xenoinjerto. Después de la inyección intraperitoneral (ip) de MI061 con 0,3 mg /inj, el C (max), T (max), el área bajo la curva (AUC) y t
1/2 se midieron como 14,4 mg /L, 1 hr , 24,8 mg • h /L y 4,3 horas, respectivamente (figura 4A). Según los datos de PK de MI061, el efecto antitumoral de MI061 se controló en el modelo de xenoinjertos A431. Cada uno de los ratones fue tratado durante 22 días a partir del 13
º día post-trasplante, por vía intraperitoneal inyección con cetuximab, CT Fab por cada 3 días, o MI061 por la base diaria en la actividad de las PK. La inyección de anticuerpos no afectó a la ganancia de peso corporal de los ratones xenoinjertados tumorales A431 (Fig S1c). El tamaño del tumor se midió con calibres de enfoque superficie. El tamaño del tumor en el grupo de vehículo exhibió un aumento lineal a lo largo del período de 22 días y el tamaño alcanzado por 1.200 mm
3 (Fig 4B). La inyección de cetuximab o MI061 suprime el crecimiento tumoral a 300 mm
3. Aunque MI061 se inyectó más veces de otros anticuerpos, se mostró un efecto antitumoral significativo como cetuximab. Cada masa tumoral levantado de xenoinjerto se extrajo de los ratones para medir el volumen relativo del tumor (Fig 4C). Curiosamente, la inyección de MI061 en ratones xenoinjertados notablemente suprimida el volumen del tumor a 25% en comparación con el grupo tratado con vehículo (Fig 4D). Por lo tanto, MI061 mostró un efecto antitumoral similar en comparación con el grupo de cetuximab tratar
in vivo
. En general, estos datos apoyaron que MI061 purificado de sistema bacteriano se puede utilizar para la aplicación clínica como un agente anti-tumor.
(A) Farmacocinética de MI061 minicuerpo. Las muestras de sangre para la farmacocinética de MI061 se recogieron a 1, 3, 6, 24 y 48 horas después de la inyección intraperitoneal inicial (i.p., 0,3 mg /ratón) y su concentración se estimó usando métodos no compartimiento. (B) de tiempo de curso de la variación de tamaño del tumor. ratones desnudos atímicos se trataron con vehículo o con cetuximab o con cetuximab Fab cada 3 días, o con minicuerpo al día durante 10 días mediante inyección i.p. (0,25 mg /ratón). El tratamiento se inició cuando el tamaño de tumor llegó a 100 mm
3 después de xenoinjerto. El tamaño del tumor se midió con calibres durante días del experimento. (C) Los resultados representativos de las masas tumorales A431. (RE). volumen relativo del tumor. El tamaño de las masas tumorales A431 retirados de ratones atímicos tratados cada anticuerpo se midió con calibres y se indicó como volumen relativo en comparación con el grupo tratado con cetuximab. datos cuantificados se expresan como media ± s. mi. metro.
* P & lt; 0,05
El efecto de Minianticuerpo ingeniería en la vía de señalización corriente abajo del EGFR
Los niveles de expresión de EGFR y fosforilada-EGFR (p-EGFR) se analizaron desde A431 secciones de tumor, como se muestra en la figura 5A. En comparación con el grupo de vehículo, las intensidades de tinción de EGFR y p-EGFR se redujeron notablemente en el anticuerpo tratado todos los grupos. Para obtener el efecto MI061 en la vía de señalización corriente abajo EGFR, se lisaron cada masas tumorales. Ellos se analizaron para el estado de activación de moléculas de señalización corriente abajo, seguido de la activación del EGFR. Similar a la inmunohistoquímica datos contra EGFR y p-EGFR, se encontró que el nivel de expresión de EGFR se redujo significativamente en el grupo tratado o bien CT Fab o MI061 (Fig 5B). Además, los niveles tanto de p-EGFR y p-ERK sólo fueron completamente suprimidos en el grupo tratado con MI061 pero no en el otro grupo (figura 5B). En contraste, CT Fab solamente phophorylation inhibido de AKT (Fig 5B). Estos datos sugieren que la CT Fab y MI061 podrían estar involucrados en diferentes vía de señalización corriente abajo, a pesar de un efecto inhibidor similar sobre la fosforilación de EGFR
in vivo
. Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que el aumento de la eficacia antitumoral de MI061 comparación con cetuximab en el modelo de xenoinjerto A431, el apoyo a la relevancia de estudios adicionales para el uso de MI061 para entregar agente anticancerígeno
in vivo
.
(A) La fosforilación de EGFR. El EGFR fosforilado de la sección congelada de tejido tumoral A431 se analizó por tinción inmunohistoquímica utilizando p-EGFR (Tyr 845) de anticuerpos. Escala de la barra = 200 mm (B) EFGR vía de señalización corriente abajo en lisado de tumor se analizó mediante Western blot utilizando cada anticuerpo como se indica. β-actina se utilizó como control de carga.
Discusión
Tumor-terapias diana utilizando intacta toda la IgG se han estudiado intensamente para los pacientes con cáncer en numerosas investigaciones y dio lugar a una ola de anticuerpos aprobados por la FDA [6] - [10]. Por lo tanto, los resultados notables se han logrado en el tratamiento del cáncer, pero todavía hay algunas limitaciones en el uso de la IgG completa al tratamiento en pacientes con cáncer. Estos incluyen extremadamente altos costes de producción y la farmacocinética frente a la penetración del tejido [17], [18]. Con el fin de superar estas desventajas, los investigadores se han tratado de reducir el tamaño de anticuerpo para la producción eficaz en el sistema bacteriano y mejorar la tasa de penetración de los anticuerpos para la terapia eficaz [16], [19]. En este estudio, también generó tres minicuerpos derivados de Cetuximab y examinamos las características y el efecto antitumoral de ellos
in vitro
y
in vivo
.
Muchos intentos se han llevado a cabo para generar anticuerpos para uso terapéutico humano en células de mamífero. Sin embargo, las células de mamífero transfectadas no se prefieren como sistema de expresión debido a los bajos niveles de expresión, de crecimiento lento y caro medios de cultivo [20]. Estos problemas pueden resolverse mediante el uso de un
E. coli
sistema de expresión para producir grandes cantidades de proteína recombinante. Aunque hay algunas limitaciones, tales como la acumulación intracelular, el potencial para la degradación del producto y la producción de endotoxina, se ha ampliamente ha utilizado para la producción de proteína recombinante debido a su capacidad de crecer rápidamente, a alta densidad sobre sustratos de bajo costo y la manipulación relativamente simple [20] . Además producción, las diversas técnicas recombinantes han permitido de fragmentos de anticuerpos con diferentes tamaños [11], [16], [19], [21]. Minicuerpo (scFv-C
H3), uno de ellos, puede ser expresada en el sistema bacteriano y su pequeño tamaño y bajo peso molecular permite la penetración de tejido rápido y fácil [22]. A pesar de la mejora de la tecnología y de la investigación pesada, sin embargo, todavía hay limitaciones en cuanto a la productividad y la estabilidad térmica de minicuerpo [22]. En general, los scFv muestran una baja estabilidad térmica y tienden a desnaturalizar o agregar en las condiciones de uso clínico debido a la relativamente débil V
H-V
L interacción [22]. A la conquista de baja estabilidad, algunos investigadores se centraron en la longitud del enlazador, el alargamiento de los residuos en el enlazador ligeramente la estabilidad de los scFv [23] mejorada. También probamos la estabilidad térmica de ambos MI045 y MI053 y encontramos que MI053, que tiene 18 residuos como un enlazador, es más estable en lugar de MI045 durante 48 horas (Fig. S1D y Materiales y Métodos S1). Algunos estudios han informado de que la orientación de dominio de V
L-V
H región de scFv es estructuralmente importante a una mayor tasa de recuperación de proteína soluble [24]. (UN).