Extracto
El cáncer de vejiga se diagnostica mediante cistoscopia, un procedimiento costoso e invasivo que se asocia con la incomodidad del paciente. Análisis de los marcadores específicos de tumor en el ADN a partir de sedimentos de orina evacuada tiene el potencial para la detección no invasiva del cáncer de vejiga; sin embargo, la sensibilidad está limitada por fracciones de bajo y un pequeño número de células tumorales exfoliadas en la orina a partir de tumores de bajo grado. El propósito de este estudio era mejorar la sensibilidad para la detección no invasiva del cáncer de vejiga por la captura y el enriquecimiento de las células tumorales en la orina basado en el tamaño. En una fracción de la muestra puesta a punto, la orina de una serie consecutiva de pacientes con tumores vesicales primarias o recurrentes (N = 189) fue procesado por microfiltración utilizando un filtro de membrana con un tamaño de poro definido, y la sedimentación por centrifugación, respectivamente. Se analizó el ADN de las muestras durante siete marcadores de metilación de la vejiga asociados a tumores utilizando MethyLight y pirosecuenciación ensayos. La fracción de ADN derivado del tumor fue mayor en las muestras de filtro que en los sedimentos correspondientes para todos los marcadores (
p
& lt; 0,000001). A través de todas las fases del tumor, el número de casos positivos para uno o más marcadores fue 87% en muestras de filtro en comparación con 80% en los sedimentos correspondientes. El mayor aumento de la sensibilidad se logró en tumores Ta bajo grado, con 82 de 98 casos positivos en las muestras de filtro (84%) frente a 74 de 98 en los sedimentos (75%). Nuestros resultados muestran que el procesamiento de pre-analítica de orina evacuada por filtración basada en el tamaño puede aumentar la sensibilidad para la detección basada en el ADN del cáncer de vejiga
Visto:. Andersson E, Steven K, P Guldberg (2014) Tamaño- Enriquecimiento con base de células tumorales exfoliadas en la orina aumenta la sensibilidad de ADN basada en detección de cáncer de vejiga. PLoS ONE 9 (4): e94023. doi: 10.1371 /journal.pone.0094023
Editor: Ludmila Prokunina-Olsson, Instituto Nacional del Cáncer, de los Institutos Nacionales de Salud, Estados Unidos de América
Recibido: 23 de octubre de 2013; Aceptado: March 12, 2014; Publicado: 14 de abril 2014
Derechos de Autor © 2014 Andersson et al. . Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación: Conceder una ayuda : La Fundación de caramelo. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de vejiga es el séptimo cáncer más común en todo el mundo y es responsable de más de 150.000 muertes cada año [1]. Más del 90% de los tumores de vejiga son carcinomas de células transicionales (también llamado carcinoma urotelial) que surgen de las células uroteliales que recubren la vejiga. Los síntomas típicos de cáncer de vejiga son hematuria microscópica y macroscópica, dolor al orinar y poliuria. Sin embargo, ninguno de estos síntomas es específico para la enfermedad y puede ser causada por una serie de otras condiciones incluyendo la cistitis, cálculos renales y enfermedades de la próstata. El estándar de oro para el diagnóstico de cáncer de vejiga es la resección transuretral del tumor vesical (RTU). La mayoría de los pacientes son diagnosticados con cáncer de vejiga no invasivo (estadio Ta), que tiene una tasa de supervivencia a los cinco años de 90%. Sin embargo, la tasa de recurrencia es alta (50-70%) y 10-25% de avance para el cáncer de vejiga invasivo, garantizando a largo plazo de seguimiento por cistoscopia en pacientes con tumores no invasivos [2] - [4]. La cistoscopia es un método invasivo que es incómodo para los pacientes y requiere grandes recursos técnicos y financieros. Está, por lo tanto, es importante desarrollar métodos no invasivos que son simples y rentables para el diagnóstico y seguimiento del cáncer de vejiga.
muestras de orina espontánea de pacientes con tumores vesicales suelen contener células tumorales exfoliadas que pueden ser detectados por análisis citológico. citología de orina es un método no invasivo que tiene una alta especificidad pero una baja sensibilidad (& lt; 40%), especialmente en pacientes con tumores de bajo grado [5], [6]. Un método no invasivo más sensible para la detección de cáncer de vejiga se basa en el análisis de las alteraciones específicas de tumor en el ADN aislado a partir de sedimentos de orina. las pérdidas cromosómicas y mutaciones somáticas en los genes específicos, tales como
FGFR3
y
TP53
se han utilizado con éxito como biomarcadores para la detección de varias etapas del cáncer de vejiga [7] - [9]. En los últimos años, la hipermetilación aberrante en promotor islas CpG se ha demostrado que se producen con frecuencia y temprano en el desarrollo del cáncer e incluso puede preceder a alteraciones genéticas, tales como mutaciones y reordenamiento genómico en la carcinogénesis [10]. Varios estudios han informado de la hipermetilación del promotor islas CpG en los tumores de vejiga (revisado en las referencias [11] - [13].) Y estos cambios pueden ser detectados en los sedimentos de orina de pacientes con cáncer de vejiga [14], [15]. No existe un marcador de ADN-metilación único que define todos los tipos de tumor de vejiga, y la mayoría de los estudios han utilizado un panel de marcadores para detectar el cáncer de vejiga en muestras clínicas. La sensibilidad y especificidad de la detección de tumores de vejiga basado en el ADN varían considerablemente entre los estudios, lo que puede atribuirse a la elección de los marcadores y métodos para la evaluación de estos marcadores, así como las diferencias en la representación de las distintas etapas tumorales en cohortes de pacientes [16] - [23].
en los estudios en los pares de muestras tumorales y sedimentos de orina han sido analizadas en paralelo para el mismo panel de marcadores de ADN, la sensibilidad de detección es consistentemente más baja en la orina [15], [17], [20]. La exfoliación de las células tumorales en la orina depende de las características del tumor, tales como el tamaño, el estadio y grado y también muestra una gran variación intra-individual [24]. Especialmente pequeños tumores no invasivos son menos propensos a derramar suficientes células en la orina para ser detectado en el análisis posterior. Además, la orina de pacientes con cáncer de vejiga puede contener un mayor número de otros tipos de células, incluyendo las células blancas de la sangre, que pueden afectar la sensibilidad del análisis de sedimentos. Por lo tanto, un método que permite un enriquecimiento de las células tumorales en muestras de orina puede aumentar la robustez y sensibilidad para la detección no invasiva de cáncer de vejiga.
Las células tumorales derivadas de células epiteliales son generalmente más grandes que las células blancas de la sangre, y esta diferencia de tamaño potencialmente podría ser explotada para enriquecer en células tumorales en muestras biológicas heterogéneos tales como la orina. Estudios anteriores han utilizado filtros para el aislamiento a base de tamaño de las células tumorales circulantes (CTC) raros en la sangre periférica [25], [26]. La idea de la captura de células en la orina en un filtro se introdujo hace más de treinta años [27], y más tarde estudios han utilizado filtros de membrana para la preparación de las células epiteliales de la orina para la detección de carcinoma urotelial mediante citología o hibridación in situ fluorescente (FISH) análisis [28] - [30]. En este estudio, hemos probado un procedimiento simple y rentable para la filtración de orina pre-analítica para aumentar la fracción de células tumorales y por lo tanto la sensibilidad para la detección basada en ADN sobre sedimentos sin filtrar. En una fracción de la muestra puesta a punto, se evaluaron muestras de orina de pacientes con cáncer de vejiga para detectar la presencia de ADN del tumor con un panel de marcadores de metilación detectado con frecuencia en el cáncer de vejiga. Las fracciones de alelos metilados se cuantificaron en muestras sedimentadas y filtrados por MethyLight ensayos y pirosecuenciación. Encontramos que este método de filtrado aumentó la fracción de ADN derivado del tumor y también mejoró la sensibilidad y robustez de la detección de tumores de vejiga a partir de muestras de orina.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
El estudio fue aprobado por el Comité ético de Copenhague, y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los pacientes y los controles en la inclusión.
Colección de muestras de orina
anulados muestras de orina de la mañana se obtuvieron de la vejiga pacientes con cáncer ingresados por TURBT en el hospital Universitario de Copenhague, Herlev, Dinamarca, entre junio de 2010 y octubre de 2011, y de voluntarios sanos sin neoplasias urológicas conocidos. Las muestras fueron enviadas a la Sociedad Danesa del Cáncer y procesados dentro de las 4-6 horas después de la micción.
Tratamiento de las muestras de orina
Cincuenta mililitros de cada muestra de orina se sedimentaron por centrifugación a 2.000 g durante 10 minutos . El sedimento se lavó en solución salina tamponada con fosfato (PBS), seguido de otros 10 minutos de centrifugación. El sobrenadante se desecha y el sedimento se resuspendió en aproximadamente 200 l de PBS. En paralelo, la orina de la misma muestra se extrajo en una jeringa desechable y se pasó a través de un filtro Whatman Nuclepore pista grabada de policarbonato hidrófilo de membrana (diámetro 25 mm) montado en el soporte de filtro correspondiente (Whatman, Maidstone, UK). La muestra de orina se pasó a través del filtro por la fuerza positiva hasta una resistencia se consideró (saturación), con un máximo de 125 ml. Todos los filtros se lavaron con PBS antes de la retirada del soporte del filtro. sedimentos de orina y filtros de contenido de filtro se almacenaron a -80 ° C hasta su posterior procesamiento.
El aislamiento de ADN y bisulfito de conversión
Se aisló el ADN a partir de muestras de sedimento de la orina y del filtro utilizando el kit Qiagen Mini Prep (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. muestras de filtro y los sedimentos se incubaron con tampón ATL y proteinasa K a 56 ° C durante al menos una 1 hora o durante la noche. El tratamiento posterior se realizó de acuerdo con el protocolo para la purificación de ADN a partir de tejidos. ADN de los filtros y los sedimentos se eluyó en 50 l y 100 l de tampón AE, respectivamente, y se almacenó a -80 ° C. La concentración de ADN se midió utilizando un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Scientific, Wilmington, DE, EE.UU.).
conversión de bisulfito se realizó utilizando el kit EZ-metilación del ADN Oro (Zymo Research Corp, Orange, CA, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ADN con bisulfito convertido se eluyó en 2 x 10 l de M-tampón de elución y se almacenó a -80 ° C. Para muestras pareadas (sedimento y filtro), se utilizó la misma cantidad de ADN, con un máximo de 500 ng. En los casos en que la concentración de ADN era demasiado baja para ser determinada con precisión usando el espectrofotómetro NanoDrop, se utilizó el volumen de muestra máximo (20 l). El epitelio normal de la vejiga humana derivado de un varón de 66 años fue adquirido de capital Biosciences (Rockville, MD, EE.UU.).
Cell Cultura y
La línea celular T24 (DSMZ, Braunschweig, Alemania) fue cultivaron en medio DMEM suplementado con suero bovino fetal 10%. Los linfocitos se aislaron de sangre de un donante sano esencialmente como se describe [31] y se almacenaron a -80 ° C hasta su uso. Las células en suspensión de una sola célula se contaron y se midieron utilizando un contador celular condesa automatizada (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Los dos tipos de células se mezclaron en las proporciones indicadas y se procesan mediante centrifugación y filtración como se ha descrito anteriormente para las muestras de orina.
desnaturalización Gradient Gel Electroforesis
análisis de la mutación de
HRAS
exón 2 por electroforesis en gel desnaturalizante en gradiente (DGGE) se realizó esencialmente como se describe [32]. Primer secuencias y condiciones de PCR se enumeran en la Tabla S1. Los productos de PCR se cargaron en un 0% desnaturalizante /6% de poliacrilamida-90% desnaturalizante /9% de poliacrilamida gel de doble gradiente [33]. Los geles se corrieron a 170 V durante 4,5 horas en tampón TAE se mantiene a una temperatura constante de 58 ° C, se tiñeron con bromuro de etidio y se fotografió con transiluminación UV.
MethyLight
cuantitativa en tiempo real -PCR específica de metilación (MethyLight; Ref. [34]) se realizó esencialmente como se describe [20]. secuencias de cebadores y sondas se enumeran en la Tabla S1. Las reacciones se realizaron en la plataforma 480 LightCycler usando el LightCycler 480 Sondas Maestro Kit (Roche, Mannheim, Alemania) y 1 l de ADN tratado con bisulfito por reacción. La especificidad de cada ensayo se estableció utilizando
vitro
ADN metilado en (IVM; universal metilado ADN CpGenomeTM, Chemicon /Millipore, Billerica, MA) y de ADN de líneas celulares de cáncer seleccionados como controles positivos y negativos para la metilación, respectivamente , y el agua y no tratados con bisulfito de ADN genómico como controles negativos para la amplificación. Un ensayo de MethyLight para
ALUC4
y se utilizaron una serie de dilución de IVM para determinar la concentración de ADN de la muestra después del tratamiento con bisulfito [20], [35]. Los casos fueron descartados si alguna de las muestras de sedimentos o filtros emparejados tenían una concentración inferior al equivalente de ADN de 0,25 ng /l no tratado con bisulfito. los niveles de metilación se calcularon como porcentaje de referencia metilado (PMR; Ref. [35]) mediante la normalización de los valores de reacción-marcador específico de
ALUC4
valores relativos a los mismos valores para el control totalmente metilado (IVM). Las pequeñas cantidades de ADN de partida para muchas de las muestras limitan el número de marcadores que podrían ser probados, y todos los análisis se realizaron como reacciones individuales. El nivel de metilación de fondo para cada marcador se determinó usando el ADN de muestras de orina sedimentadas y filtrados de 11 controles sanos, así como ADN genómico humano (Roche, Mannheim, Alemania). Los valores de corte PMR eran 3 por
Hoxa9
, 2
POU4F2
, 0,5 para
SALL3
y 2 para
VIM2.
pirosecuenciación
Pyrosequencing ensayos para la
HRAS
p.G12V (c.35G & gt; T) mutación y
BCL2
metilación del promotor fueron diseñados utilizando el software de diseño de ensayo PyroMark (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania). Primer secuencias y condiciones de PCR se enumeran en la Tabla S1. PCR se llevó a cabo en un volumen final de 25 l que contenía tampón de PCR (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania), 200 mM de cada dNTP, 0,4 mM de cada cebador y 1 U de Taq HotStarTaq ADN polimerasa (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania). La pirosecuenciación se realizó en una plataforma PyroMark Q24, utilizando PyroMark oro Q24 Reactivos (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania). El análisis de los resultados se llevó a cabo con el software PyroMark Q24 (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania). los niveles de metilación promedio de
BCL2
se calcularon para los siete sitios CpG incluidos en el ensayo. La señal de fondo para el
BCL2
metilación de ensayo se fijó en 5% basado en el análisis de ADN tratado con bisulfito Humana Genómica (Roche, Mannheim, Alemania). Para el
BCL2
análisis de metilación, sólo las muestras clínicas con una concentración equivalente a 5 ng /l de ADN no tratado con bisulfito o más fueron incluidos.
Resultados
Captura y enriquecimiento de vejiga células tumorales en una membrana de filtro para probar la capacidad de filtros de membrana para capturar células tumorales de vejiga
, se utilizó primero un sistema modelo diseñado para parecerse a las muestras de orina que contienen bajas fracciones de células tumorales. Un experimento se muestra en la Figura 1. Los linfocitos purificadas cultivadas de sangre periférica (diámetro 7-8 micras) se enriquecieron con células de cáncer de vejiga T24 0,5% (diámetro 16 a 17 micras). Parte de esta mezcla de células se sedimentaron por centrifugación, mientras que el resto se hizo pasar a través de un filtro de membrana con un tamaño de poro de 8 mm (Figura 1A). El flujo a través del filtro también se recogió y se sedimentó por centrifugación. Para evaluar si la filtración aumenta la fracción de células tumorales en la muestra, el ADN fue aislado y analizado por dos alteraciones específicas de tumor presentes en las células T24;
HRAS
p.G12V mutación y la hipermetilación del
BCL2
promotor. La Figura 1B muestra la resolución física de tipo salvaje y mutante
HRAS
alelos utilizando DGGE, que tiene un nivel de detección de aproximadamente 2% [36]. El mutante
HRAS
alelo era claramente detectable como homo y heterodúplex en la muestra de filtro, pero no en las muestras de sedimento o flujo a través (Figura 1B). El análisis cuantitativo de las mismas muestras usando pirosecuenciación mostró un aumento en la proporción de mutante (T) a través de tipo salvaje (G)
HRAS
alelos de 3-4% en el sedimento y las muestras de flujo a través de 19% en la muestra de filtro (Figura 1C y los datos no presentados). pirosecuenciación bisulfito mostró un aumento similar en la fracción de
BCL2
hypermethylated alelos, específico para las células T24, tras la filtración (Figura 1D)
.
(A) Dibujo esquemático del montaje experimental de muestra dividida -arriba. Muestra de orina o suspensión de células se divide en dos y se sometieron a centrifugación y filtración, respectivamente. a continuación, se aísla ADN de las células en el sedimento o capturado en el filtro y se analizaron para los marcadores específicos de tumor. (B) Detección de la
HRAS
p.G12V mutación mediante DGGE. El T24 línea celular es homocigotos para el alelo mutante. Sedimentos y muestras de flujo a través muestran sólo el alelo de tipo salvaje, mientras que la muestra filtro muestra dos alelos mutantes y de tipo salvaje. Heterodúplex son moléculas híbridas compuestas por una cadena mutante y una hebra de tipo salvaje. (C) Pyrographs que muestra la distribución entre tipo salvaje (G) y mutante (T)
HRAS
alelos en las muestras de sedimento y de filtro. (D) Pyrographs de
BCL2
análisis de la metilación del promotor isla CpG en las muestras de sedimentos y filtro. Los sitios CpG en la región diana se indican mediante el sombreado gris oscuro, y el porcentaje de alelos metilados (C) está indicado en cada sitio.
Para probar el método de filtración en un entorno clínico, la orina muestras se obtuvieron de 15 pacientes con cáncer de vejiga ingresados por TURBT. En esta serie de muestras, también se evaluó si el tamaño de poro podría afectar la relación de células tumorales con las células normales. De cada muestra de orina, se prepararon 50 ml por centrifugación, mientras que el volumen restante se divide en partes iguales y se pasó a través de dos filtros con tamaños de poro de 8 micras y 10 micras, respectivamente. ADN fue aislado de todos los sedimentos de orina y muestras de filtro y se examinó para
BCL2
metilación usando un ensayo de MethyLight altamente específico y sensible. Siete de las 15 muestras de orina fueron positivos para este marcador, de acuerdo con informes anteriores que muestran
BCL2
hipermetilación en un gran porcentaje de los tumores de vejiga [16], [22]. Para estimar la fracción de ADN derivado del tumor, los niveles de metilación se calcularon para el
BCL2
muestras positivas a utilizando valores normalizados (PMR). Sólo hubo una pequeña diferencia en los niveles de metilación entre los filtros 8 y 10 micras, con niveles ligeramente más altos en el filtro 8 micras (Tabla S2). El análisis cuantitativo de
BCL2
metilación por pirosecuenciación confirmado los resultados del análisis MethyLight (Figura 2). En particular, todas las muestras de filtro (tanto 8 micras y 10 micras) mostraron mayor
niveles BCL2
de metilación que las muestras de sedimento correspondientes, lo que indica una mayor fracción de las células tumorales.
Promedio de los niveles de metilación de la
promotor BCL2
isla CpG en muestras de orina de siete pacientes con cáncer de vejiga, tal como se determina por pirosecuenciación. Los sedimentos y dos muestras de filtro (8 y 10 micras de tamaño de poro, respectivamente) se prepararon a partir de cada muestra de orina. La muestra de sedimento de paciente 2 no se encuentra debido a la extracción de ADN fallado.
Filtración orina aumenta la fracción de ADN tumoral en muestras clínicas
Tener una prueba obtenida del principio de que los filtros de membrana puede capturar y enriquecer las células tumorales de vejiga en muestras de orina, se realizó un estudio clínico de 220 pacientes con tumor de vejiga consecutivos. Características demográficas y clínico-patológicas de estos pacientes se enumeran en la Tabla S3. No había un número igual de pacientes con tumores primarios y recurrentes en esta cohorte. muestras de orina de la mañana fueron recogidos y procesados de acuerdo con el diseño de muestra dividida se ilustra en la Figura 1A, utilizando un filtro de 8 micras. ADN fue aislado de todos los sedimentos de orina y muestras de filtro y se trató con bisulfito de sodio. La concentración de ADN tratado con bisulfito en cada muestra se determinó utilizando un ensayo MethyLight para
ALUC4
. Treinta y una muestras pareadas fueron descartados debido a bajo rendimiento de ADN (Tabla S3).
Proyección de los 189 pares de muestras para
BCL2
metilación mediante análisis MethyLight identificó 121 casos positivos para este marcador (ejemplos se muestra en la Figura 3A). En 60 de estos casos, las dos muestras de filtro y sedimento contenían cantidades suficientes de ADN para el análisis cuantitativo confiable por pirosecuenciación (Figura 3B). En 18 de los 60 casos, el
BCL2
nivel medio metilación estaba por debajo de la señal de fondo para la pirosecuenciación en ambas muestras de sedimentos y filtro. De los 42 casos restantes, 29 (69%) mostraron niveles de metilación más altos en la muestra del filtro en comparación con la muestra de sedimento, cinco casos (12%) mostraron niveles iguales de metilación (& lt; 2 puntos porcentuales de diferencia), y ocho casos (19% ) mostraron niveles de metilación más altos en los sedimentos que en los filtros correspondientes (Figura 3C). El nivel de metilación promedio fue de 28% en comparación con muestras de filtros 21% en los sedimentos (
p Hotel & lt; 0,001, prueba t pareada). El aumento en los niveles de metilación de sedimentos para filtrar varió de 3 a 35 puntos porcentuales, con un valor medio de 10 puntos porcentuales. El análisis cuantitativo de los 121 casos positivos para
BCL2
metilación utilizando valores normalizados (PMR) a partir del análisis MethyLight mostró un nivel medio de metilación del 10,0% en las muestras de sedimento y el 14,4% de las muestras de filtro, con el nivel medio pasando de 1,6% a 4,0% (Figura 4;
p Hotel & lt; 0,001, prueba de t pareada)
(a) Ejemplos de análisis MethyLight de
BCL2
promotor. la isla CpG metilación. En el paciente A, la amplificación se ve en la muestra de filtro, pero no en la muestra de sedimento. En el paciente B, la amplificación se observó tanto en las muestras; Sin embargo, con un valor más alto Ct para la muestra de sedimento. (B) Los ejemplos de
isla CpG promotor BCL2
análisis de metilación por pirosecuenciación en muestras pareadas. Nivel medio de metilación se calcula para los siete sitios CpG individuales ensayadas (indicado por el sombreado gris oscuro). El nivel medio de la metilación en la muestra de sedimento de B paciente estaba por debajo de la señal de fondo para la pirosecuenciación, en contraste con el ensayo de MethyLight (A), que muestra la diferencia en la sensibilidad analítica entre los dos ensayos. (C) los niveles de metilación promedio para muestras apareadas según lo determinado por pirosecuenciación. Se muestran los resultados para los casos en los que al menos uno de los pares de muestras mostraron señales por encima del fondo para la pirosecuenciación (N = 42).
Se muestra la mediana de los valores normalizados (por ciento referencia metilado, PMR) a partir del análisis MethyLight de siete marcadores de metilación. Para cada marcador, los niveles de metilación variaron de & lt; 1% a 100% (no mostrados). *, P & lt; 0,05; **, P. & Lt; 0,01
Para analizar las muestras negativas para
BCL2
metilación, que amplió el análisis basado en MethyLight por seis islas CpG promotoras adicionales reportados anteriormente a estar frecuentemente en hypermethylated cáncer de vejiga, incluyendo
CCNA1
,
Eomes
,
Hoxa9
,
POU4F2
,
SALL3
y
VIM2
[16], [18], [23]. Hemos validado estos marcadores junto con
BCL2
en un panel de 51 tumores de vejiga que representan diversas etapas tumorales (tumores Ta 22 de bajo grado, tumores Ta 2 de alto grado, 8 tumores T1, 17≥T2 tumores, y 2 Tis ). Cada uno de estos marcadores fue positivo en & gt; 45% de los tumores en este panel, y 48 de los tumores (94%) fueron positivas para al menos un marcador. especificidad tumoral de los marcadores se confirmó por análisis de tejido normal de la vejiga
El análisis cuantitativo de los siete marcadores de metilación del ADN mostró un aumento en los niveles de metilación en muestras de filtro en comparación con los sedimentos (Figura 4;.
p
& lt; 0.000001, emparejado t-test). Esta diferencia también fue estadísticamente significativa para algunos marcadores individuales, incluyendo
BCL2
,
Hoxa9
y
VIM2 gratis (Figura 4).
Filtración orina aumenta la la sensibilidad para la detección de cáncer de vejiga
finalmente se consideró si el aumento de las fracciones de ADN derivado del tumor logrado por filtración de orina podrían afectar la sensibilidad para la detección de cáncer de vejiga. Para determinar los niveles de metilación de fondo para cada uno de los siete marcadores, se analizó el ADN de muestras de filtro y de orina de sedimentos de 11 controles sanos, así como el ADN de linfocitos de sangre periférica. la amplificación de ciclo tarde se observó ocasionalmente para cuatro de los marcadores (
Hoxa9
,
POU4F2
,
SALL3
y
VIM2
), algunos de los cuales eran mantenido a análisis repetidos. Sobre la base de estos datos, se ha definido un valor de corte para cada uno de estos marcadores por encima del cual se considera una muestra positiva.
BCL2, CCNA1
y
Eomes
no mostró metilación de fondo.
Con la positividad se define como la hipermetilación de al menos uno de los siete marcadores, la sensibilidad a través de todas las fases del tumor era 80% (152/189) en los sedimentos de orina, mientras que fue 87% (164/189) en las muestras de filtro. Este patrón fue evidente también para los marcadores individuales, que todo indicado una mayor sensibilidad en las muestras de filtro (Figura 5). El marcador que muestra la mayor sensibilidad fue
VIM2
, que fue positiva en el 56% de las muestras de sedimentos y el 67% de las muestras de filtro. Los otros seis marcadores tenían sensibilidad de 35-53% en los sedimentos y 43-62% en los filtros. La sensibilidad de los tumores de etapas superiores (≥T1) fue generalmente alta (& gt; 90%) en los sedimentos y era sólo ligeramente, aunque consistente, aumentado después de la filtración. Notablemente, sin embargo, un efecto dramático se observó para tumores Ta de bajo grado, en los que la sensibilidad aumentó de 75% (74/98) en los sedimentos a 84% (82/98) en los filtros (Tabla 1). Entre los 95 tumores primarios, se detectaron 80 (84%) en el sedimento y 84 (88%) fueron detectados en el filtro. Entre los 94 tumores recurrentes, 73 (78%) se detectaron en el sedimento y 80 (85%) se detectaron en el filtro.
Se muestran los porcentajes de muestras positivas para los siete marcadores de ADN de metilación. La última columna ( "All") muestra el porcentaje de muestras positivas para uno o más marcadores.
Discusión
ensayos no invasivos que pueden detectar con precisión y fiabilidad de la vejiga cáncer tendrá un impacto sustancial en los pacientes y el sistema de cuidado de la salud mediante la reducción de la necesidad de cistoscopia frecuente, costoso e incómodo. Se ha hecho un progreso significativo en la identificación de biomarcadores basados en la orina que puede superar a la citología de orina, y algunos de estos marcadores se han convertido en pruebas comerciales. Sin embargo, sigue habiendo problemas para alcanzar la sensibilidad de cistoscopia [37] - [39]. El objetivo de este estudio fue para aumentar la sensibilidad para la detección basada en el ADN de cáncer de vejiga en muestras de orina a través de un simple procedimiento de filtración, para enriquecer en células tumorales. En una gran cohorte consecutiva de pacientes de tumores de vejiga, hemos probado un filtro de policarbonato pista grabada comercial con un tamaño de poro de 8 micras y lo comparó con el análisis del sedimento urinario estándar. El análisis cuantitativo a través de un panel de siete marcadores de metilación del ADN mostró un aumento significativamente los niveles de DNA de tumores en las muestras de orina se filtró en comparación con los sedimentos correspondientes, lo que sugiere que el filtro captura las células tumorales de vejiga preferentemente sobre otras células presentes en la orina. Lo más importante, el procedimiento de filtración identificó un mayor número de muestras de pacientes tumorales de vejiga como positivo, lo que resulta en una sensibilidad de diagnóstico general de 87% en muestras de filtro en comparación con una sensibilidad de 80% en los sedimentos correspondientes.
Low -Grado, tumores de vejiga en estadio bajo representan el mayor reto en los enfoques basados en la detección de orina, incluyendo la citología y la pesca estándar, ya que estos tumores tienden a arrojar un menor número de células en la orina [40], [41]. Esta limitación también fue evidente en nuestro enfoque basado en el ADN, donde la sensibilidad en los sedimentos de orina estaba cerca o por encima de 90% para el estadio ≥T1 tumores, mientras que era sólo el 75% de los tumores de bajo grado Ta. Curiosamente, la filtración de las muestras de orina aumentó la sensibilidad de los tumores Ta de grado bajo a 84%, lo que sugiere que este procedimiento puede aliviar algunas de las dificultades en la detección de estos tumores. Del total de 189 pacientes investigados, 16 casos fueron negativos para todos los marcadores de metilación en las dos muestras de filtros y sedimentos, y 13 de ellas tenían tumores de alto o bajo grado Ta. Nosotros [20] y otros [42] han demostrado previamente que un subconjunto de tumores superficiales de vejiga muestra tasas de acontecimientos hipermetilación. Curiosamente, estos tumores en cambio muestran tasas relativamente altas de la activación de
FGFR3
mutaciones [20] y, por lo tanto, la combinación de marcadores de metilación y
FGFR3
mutaciones pueden aumentar la sensibilidad para la detección de tumores superficiales en un entorno de diagnóstico [20], [43]. Hemos restringido nuestro análisis a un tipo de marcador (hipermetilación del ADN) para proporcionar una medida cuantitativa coherente y comparable para la evaluación de los dos procedimientos para la preparación de las células de diagnóstico (de filtración y sedimentación), que era el objetivo principal de nuestro estudio. Además, se descartó un número relativamente grande de muestras (14%) debido a rendimiento de ADN bajo, lo que podría comprometer el análisis cuantitativo. Sin embargo, estas muestras podrían muy bien haber sido probados cualitativa de marcadores de metilación del ADN en un entorno de diagnóstico.
A medida que hasta el 70% de los pacientes con cáncer de vejiga no invasivo experimentarán una recaída, los análisis de orina no invasivos son altamente deseables para la vigilancia de la recurrencia. La mitad de los pacientes de nuestra cohorte presenta con un tumor recurrente, y en este grupo, como para los pacientes con tumores primarios, la filtración de orina proporciona una mayor sensibilidad que la sedimentación (85% vs. 78%). Estos datos sugieren que la filtración de orina también puede mejorar el diagnóstico de la recurrencia del cáncer de vejiga, que puede ser particularmente útil como tumores recurrentes a menudo son más pequeños y arrojan menos células de tumores primarios. Sin embargo, este procedimiento no puede aliviar otras limitaciones de la vigilancia recurrencia basada en la metilación del ADN, incluyendo la alta tasa de positivos entre los casos cistoscopia-negativas, que pueden ser causados por cambios epigenéticos en el urotelio de apariencia normal (defecto del campo epigenética) [44], [ ,,,0],45].
Un parámetro crítico obvio para el enriquecimiento basado en el tamaño de las células tumorales en muestras biológicas es el tamaño de poro del filtro. Idealmente, los poros deben ser lo suficientemente grande como para excluir las células normales y lo suficientemente pequeño para retener las células tumorales, teniendo en cuenta la deformabilidad de las células bajo presión. Estudios previos encaminados a enriquecer CTC raras en la sangre por filtración encontraron que un filtro de tamaño de poro 8 micras muestras de 99,9% de los leucocitos agota al tiempo que conserva 85-100% de las células de carcinoma de [25], [46]. Con un tamaño mayor de poros (12 a 14 micras), menos los leucocitos sino también un número considerablemente menor de carcinoma de células (hasta 18%) fueron retenidos en el filtro [46]. El uso de un filtro de policarbonato de pista grabada comercial con un tamaño de poro de 8 micras, que es similar a los filtros utilizados en estos estudios previos, hemos sido capaces de enriquecer la fracción de células tumorales en muestras de orina.