Extracto
Antecedentes
El tratamiento actual de los pacientes con diagnóstico de cáncer de próstata (CaP) es muy eficaz; Sin embargo, la recurrencia del tumor con cáncer de próstata resistente a la castre (CRPC) y la posterior metástasis de plomo con un peor pronóstico de supervivencia, lo que sugiere que hay una gran necesidad de comprender el mecanismo novedoso de la recurrencia del tumor, lo que sería fundamental para el diseño de nuevas terapias. La recurrencia y la metástasis de CaP están estrechamente vinculados con la biología de las células madre del cáncer de próstata o células iniciadoras del cáncer que es una reminiscencia de la adquisición de epitelial a mesenquimal transición (EMT) fenotipo. La evidencia creciente sugiere que las células de tipo EMT comparten muchas características biológicas con células madre, como el cáncer.
Metodología /Principales conclusiones
En este estudio, se encontró que las células de CaP con EMT fenotipo muestran stem- como características de células que se caracterizan por una mayor expresión de Sox2, Nanog, Oct4, Lin28B y /o Notch 1, en consonancia con una mayor clonogénico y esfera (prostasphere) y capacidad tumorigenecity en ratones -Formar, que se asoció con una disminución de la expresión de miR-200 y /o let-7 familia. Reversión de la EMT por la re-expresión de miR-200 capacidad de formación de prostasphere inhibido de las células de tipo EMT y redujo la expresión de Notch1 y Lin28B. Baja regulación de Lin28B aumento de la expresión let-7, que era consistente con la capacidad de auto-renovación reprimida.
Conclusiones /Importancia
Estos resultados sugieren que el miR-200 juega un papel fundamental en la vinculación de la características de las células madre, como el cáncer de células con firmas EMT-como en el CP. eliminación selectiva de las células madre, como el cáncer mediante la inversión del fenotipo EMT mesenquimal-epitelial de transición (MET) fenotipo utilizando nuevos agentes serían útiles para la prevención de la recurrencia del tumor en especial mediante la eliminación de aquellas células que son la "causa raíz" de desarrollo tumoral y recurrencia
Visto:. Kong D, S Banerjee, Ahmad A, Li Y, Z Wang, Sethi S, et al. (2010) epitelial a mesenquimal transición es mecánicamente vinculados con firmas de células madre en células de cáncer de próstata. PLoS ONE 5 (8): e12445. doi: 10.1371 /journal.pone.0012445
Editor: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 28 Junio, 2010; Aceptado: 6 Agosto de 2010; Publicado: 27 Agosto 2010
Derechos de Autor © 2010 Kong et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por una subvención del Instituto Nacional del cáncer, de los Institutos nacionales de Salud (NIH) (5R01CA083695-08 a FHS) (http://projectreporter.nih.gov/reporter_searchresults.cfm). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Nuevas evidencias sugieren que la mayoría de los tumores sólidos, incluyendo cáncer de próstata (CaP) pueden surgir a partir de células madre del cáncer [1]. Las células madre cancerosas son células de un tumor que poseen la capacidad de auto-renovación y la capacidad iniciadoras del tumor, y se diferencian en los linajes de células cancerosas heterogéneos que comprenden en una masa tumoral. Estas células iniciadoras del tumor podrían proporcionar un depósito para las células que causan la recurrencia del tumor después de la terapia. Wang et al. han demostrado que el origen de las células de CaP es de las células madre epiteliales luminales diferenciadas [2]. Sin embargo, hay un mayor grado de heterogeneidad fenotípica de las células en CaP, especialmente dentro de los sitios metastásicos. Las metástasis a menudo incluyen células raras que son fenotípicamente indiferenciado [3], lo que sugiere que las células metástasis iniciadoras pueden no ser las únicas células que se derivan de células luminales receptores positivos de andrógenos. Aunque origen de células de CaP necesita ser completamente aclarada, una serie de pruebas crecientes sugieren que las células iniciadoras de tumores o células madre de cáncer desempeñan un papel crítico en la progresión y recurrencia de CaP castrar cáncer resistente a la próstata (CRPC) y su posterior metástasis.
Los estudios recientes han indicado que las células somáticas pueden ser reprogramadas en células madre embrionarias pluripotentes-como por la co-expresión de marcadores de células madre de pluripotencia como Oct4, Sox2, Nanog y Lin28 [4], [5], que plantea la posibilidad de que combina la expresión de factores asociados a células madre y oncogenes especiales también podría inducir un estado indiferenciado en células de cáncer. Curiosamente, las líneas celulares derivadas de espécimen CaP humanos mostraron fenotipo epitelial. Sin embargo, la inmortalización de estas células por hTERT mostró la expresión de marcadores de células madre pluripotencia, incluyendo Oct4, nonag, y Sox2 [6], que podría estar asociado con progresión de la enfermedad debido a la sobre expresión de Oct4, Sox2, Nanog y c-myc tiene que se encuentran en los tumores pobremente diferenciados sido [7]. Jeter et al. han demostrado que el knock-down de Nanog en células de CaP disminuido significativamente el crecimiento clonogénico a largo plazo y inhibe el crecimiento tumoral [8]. Oct4 También se ha demostrado que desempeñan papeles importantes en la progresión de CaP [9].
transición epitelial a mesenquimal (EMT) es un proceso vital para la morfogénesis durante el desarrollo embrionario, pero más recientemente también se ha implicado en la conversión de la etapa temprana tumores en tumores malignos invasivos [10]. La progresión de la mayoría de los carcinomas hacia la malignidad se asocia con la pérdida de diferenciación epitelial y por el cambio hacia fenotipo mesenquimal, que se acompaña por un aumento de la motilidad celular y la invasión. Estudios recientes han demostrado que la EMT desempeña un papel fundamental no sólo en la metástasis tumoral, sino también en la recurrencia tumoral que se cree que está estrechamente vinculada con la biología de las células madre, como el cáncer o células iniciadoras del cáncer [11] - [13]. Sin embargo, los mecanismos por los cuales las células EMT generan las células madre-como aún no se han dilucidado. Los microARN (miRNA) están emergiendo como reguladores maestros de la diferenciación celular y participan en la adquisición de EMT fenotipo durante la progresión tumoral [14]. Dos familias evolutivos conservadas, miR-200 y let-7 se ha demostrado que regulan los procesos de diferenciación durante el desarrollo. Curiosamente, los estudios recientes han demostrado también que la familia miR-200 no sólo podría regular los procesos de EMT por la orientación caja E ZEB1 proteínas y unión ZEB2 [15], pero también se asoció con firmas de células madre como mediante la regulación de la expresión de Bmi1 [ ,,,0],16], [17]. Let-7 de la familia de miRNAs se ha demostrado que actúa como un supresor de tumor a través de la orientación Ras, grupo de alta movilidad A2 (HMGA2) y c-myc, y la disminución de let-7 expresión se ha relacionado con un aumento de la tumorigenicidad y el mal pronóstico del paciente. Más importante aún, los miembros de la familia let-7 regulan la autorrenovación de las células del cáncer de mama [18], que se asocia con el fenotipo de células madre. Estudios recientes también han documentado que lin28B podría bloquear la acumulación de madura let-7 [19], que a su vez regula "troncalidad" mediante la inhibición de la auto-renovación, las características celulares de las células madre, como el cáncer asociados con la recurrencia del tumor. La recurrencia de CaP se cree que está fuertemente ligada con la biología de las células madre de cáncer de próstata o células iniciadoras del cáncer [11], [20], [21], mientras que cada vez más pruebas han demostrado que las células con EMT inducida por diferentes factores son ricos origen del cáncer de células madre similares a [12], [13], [22], [23].
Por lo tanto, es importante identificar los factores que podrían inducir la EMT y cómo las células EMT podría convertirse en un recurso para las células madre, como el cáncer, lo que subraya aún más la función mecánica de tales factores para el desarrollo de nuevas terapias dirigidas y para CRPC. Los estudios han demostrado que la señalización del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) contribuye a EMT [24], [25]. Recientemente, nosotros y otros han mostrado que PDGF-D podría regular la invasión de células de cáncer y la angiogénesis, que era compatible con la adquisición de EMT fenotipo [26] - [30]. Curiosamente, el aumento de expresión de PDGF-D también se ha encontrado en PCa humana [31], lo que sugiere que PDGF-D podría desempeñar un papel importante en la progresión de la PCa humana contribuido por las células madre, como el cáncer EMT-fenotípica o. En este estudio, se encontró que PDGF-D sobre-expresión de las células PC3 fenotipo EMT adquirida y características de células madre como compartidos que se caracterizan por aumento de la expresión de marcadores de células madre tales como Notch1, Sox2, Nanog, Oct4 y Lin28B, que era consistente con una mayor clonogénico, prostasphere de formación de capacidad, así como el aumento de la tumorigenicidad en ratones. Al mismo tiempo, nos encontramos ARCAP
células M con EMT fenotipo también compartió firmas de células madre similares que se caracterizan por aumento de la expresión del factor de transcripción Notch1 y mejorado clonogénico, capacidad de formación de prostasphere-compara con las células control (ARCAP
células E) con epitelial fenotipo. Estas células de tipo EMT también mostraron disminución de la expresión de miR-200 o let-7, y la inversión de EMT forzando la expresión de miR-200 capacidad clonogénico y formando prostasphere-inhibió significativamente, lo que era coherente con la inhibición de la expresión Notch1 y Lin28B. Por otra parte, knock-down de Lin28B aumentó notablemente let-7 de expresión, lo que sugiere que el miR-200 y let-7 podrían actuar como un objetivo para la prevención de la recurrencia del tumor y la metástasis en el CaP.
Resultados
Clonigénicas capacidad se incrementó en PC3 PDGF-D y ARCAP
células M que tiene el fenotipo EMT
Los resultados del análisis de Western blot y la morfología celular, así como nuestros datos publicados han demostrado que la sobreexpresión de PDGF -D fenotipo EMT inducida en células PC3 [26], [28] (Fig. 1A), que era consistente con los niveles más elevados de PDGF-D en lisados celulares y medio acondicionado (CM) de células PC3 PDGF-D en comparación con PC3 Neo las células (Fig. S1A y S1B). ARCAP
M células que tienen la morfología mesenquimal mostró un incremento en la expresión de marcadores mesenquimales y la disminución de la expresión de marcadores epiteliales en comparación con ARCAP
E células con fenotipo epitelial (fig. 1B). Para determinar si las células con fenotipo EMT podrían tener características de las células madre similares, se realizó un ensayo clonogénico. Se encontró que la capacidad clonogénico fue significativamente mayor en las células PC3 PDGF-D en comparación con células PC3 neo (Fig. 1C, panel izquierdo). Higo. 1C, panel derecho, indicó, además, que las células PC3 PDGF-D mostraron un aumento de 11 veces en el número de colonias respecto a las células PC3 Neo. ARCAP
células M también mostró una capacidad clonogénico aumento que muestran un aumento de 3 veces en el número de colonias en comparación con ARCAP
células E (Fig. 1D). ensayo de agar blando, también conocido como ensayo de crecimiento independiente del anclaje, se llevó a cabo. células PC3 PDGF-D mostraron aumento dramático en el potencial clonogénico en comparación con células PC3 neo (Fig. 1E, panel izquierdo). Higo. 1E, panel derecho, mostró claramente los números de colonias generadas a partir de células por campo microscópico (40 X) Neo PC3 y PC3 PDGF-D. Estos resultados demostraron un aumento en la capacidad de las células EMT clonogénico
se muestran (A) Las fotografías de las células:. Células PC3 Neo muestran la forma redondeada de las células epiteliales y células PC3 PDGF-D exhibió un fenotipo de tipo fibroblástico (panel izquierdo , aumento original, 200 X). El análisis de transferencia Western mostró la expresión de represores de transcripción asociados con EMT, y mesenquimales, así como marcadores epiteliales en células PC3 y PC3 Neo PDGF-D (panel de la derecha, el paso 10 a 20). (B) La morfología de ARCAP
M y ARCAP
células E se muestran (panel izquierdo) Análisis de transferencia .Western indicados ZEB1 el aumento, la expresión de vimentina y Notch1 y la disminución de la expresión de E-cadherina en ARCAP
células M en comparación con ARCAP
E (panel derecho). (C) y (D) Fotografías de colonias de PC3 y PC3 Neo PDGF-D o ARCAP
M y ARCAP
E se muestra (panel izquierdo). Los números de colonias se contaron y los datos se presentan como número de colonias relativas de PC3 Neo o ARCAP
E diseñado como 1 (panel derecho). (E) Las colonias que crecen en agar blando se fotografiaron (panel izquierdo, bar, 200 micras). Los números de colonias se contaron bajo un microscopio de contraste de fase. Los datos se presentan como número de colonias por campo (panel derecho). **, P & lt; 0,01 en comparación con Neo o ARCAP
células E (N: células PC3 Neo, D: células PC3 PDGF-D, p10: paso 10, E-cad: E-cadherina)
capacidad de auto-renovación de células se incrementó en un EMT
a fin de determinar si las células con fenotipo EMT podrían mostrar características de las células madre similares, hemos probado la capacidad de formación de ámbito PC3 PDGF-(denominado como prostasphere) células D en comparación con PC3 Neo así como ARCAP
células M en comparación con ARCAP
células E cuando se crece en cultivos en suspensión, que es un
in vitro
medida de características de las células madre similares. Encontramos que las células PC3 PDGF-D mostraron un aumento significativamente la capacidad para formar prostaspheres relación con las células PC3 neo (Fig. 2A y 2B). Los prostaspheres de PC3 Neo eran de menos de 100 micras de diámetro después de 6 días, mientras que el 40% de los prostaspheres a partir de células PC3 PDGF-D se 100-200 micras, 20% de los prostaspheres a partir de células PC3 PDGF-D eran mayores que 200 micras (Fig. 2C). Para confirmar aún más si los prostaspheres son la progenie de células individuales en lugar de los agregados de múltiples células, se recogieron los prostaspheres (P1) y se sembraron las células a una célula por pocillo en placas de 96 pocillos de baja unión de ultra. Después de 12 días, se encontró que una a dos nuevos prostaspheres se generaron a partir de células PC3 sola PDGF-D, mientras que sólo el 20% de células individuales de PC3 Neo generan nuevos prostaspheres (P2, Fig. 2D). ARCAP
M células también mostraron una mayor capacidad de formación de prostasphere-(Fig. 2E y 2F), lo que sugiere que las células con fenotipo EMT han adquirido una mayor capacidad de auto-renovación. Basándose en estos resultados, más experimentos mecánicos se concentraron usando células PC3 PDGF-D en comparación con células PC3 Neo y se comparan con ARCAP
M y ARCAP
células E cuando se justifique.
(A) Prostaspheres de células PC3 y PC3 Neo PDGF-D se fotografiaron y se muestran (bar, 100 micras). (B) El número de prostaspheres se contaron bajo el microscopio. (C) Prostaspheres fueron fotografiados y el tamaño de prostaspheres de diámetro se midió mediante el programa de análisis de imágenes de software Scion Image. (D) El prostaspheres (P1) se recogieron y se re-sembraron con una densidad de una célula por pocillo en placas de 96 pocillos de baja unión de ultra. Después de 12 días de incubación, los números de prostaspheres (P2) se contaron bajo un microscopio de contraste de fase. (E) Los números de prostaspheres de ARCAP
E y ARCAP
M células fueron contados bajo el microscopio. (F) Prostaspheres de ARCAP
E y ARCAP
M células fueron fotografiados y se muestra (bar, 100 micras). **, P & lt; 0,01 en comparación con Neo o ARCAP
células E. (Neo: células PC3 Neo, PDGF-D: células PC3 PDGF-D) guía empresas
perfiles de expresión génica de marcadores de células madre en células con fenotipo EMT
para descubrir los genes que regulan y mantienen el fenotipo de células madre de las células PC3 PDGF-D que tienen las firmas de la EMT, se realizó microarrays para determinar perfiles de expresión génica de las células PC3 PDGF-D en comparación con PC3 Neo Células. Encontramos que las células PC3 PDGF-D mostraron cambios dramáticos en la expresión de genes asociados con EMT fenotipo (Tabla S1). Curiosamente, factores de transcripción Sox2, Nanog, Oct4 y Lin28B, conocido por ser suficiente para reprogramar ratón o las células somáticas humanas con las células madre indiferenciadas, pluripotentes, resultaron ser aumentado significativamente en las células PC3 PDGF-D en comparación con células PC3 Neo. Al mismo tiempo, abajo objetivos de estos factores de transcripción como ZIC2, ZIC3, Sall2 y Sall4 también fueron significativamente hasta reguladas (Tabla S2). A fin de confirmar los resultados de los análisis de microarrays de expresión génica, hemos llevado a cabo en tiempo real RT-PCR y Western blot de los genes seleccionados. Los resultados de tiempo real RT-PCR mostraron 2 a aumento de mil veces en los niveles de mRNA de estos factores de transcripción y sus objetivos de abajo en las células PC3 PDGF-D (Fig. 3A). El análisis de transferencia Western demostró también que las expresiones de proteínas de Sox2, Nanog, Stat3, Lin28B y Oct4 fueron significativamente mayores en las células PC3 PDGF-D en comparación con células PC3 Neo de paso 10 a paso 20 (Fig. 3B).
(A) La expresión de los genes en los niveles de mRNA de Oct4, Nanog, genes de la familia Sox y Lin28B en células PC3 y PC3 Neo PDGF-D se determinaron mediante el uso de tiempo real RT-PCR. (B) Los resultados de Western blot mostraron que la expresión de Oct4 Sox2, Nanog, Stat3 y Lin28B se incrementaron significativamente en células PC3 PDGF-D. (C) en tiempo real RT-PCR se utilizó para cuantificar la expresión de mRNA de EED, EZH2 y Suz12a. relativa niveles de mRNA se normalizaron a GAPDH. (D) Los resultados de transferencia Western mostraron que la expresión de EZH2 fue significativamente mayor en las células PC3 PDGF-D. (E) Los niveles de mRNA de factores de señalización Notch en PC3 Neo y células PC3 PDGF-D se determinaron mediante el uso de tiempo real RT-PCR. (F) Los resultados de transferencia Western mostraron que las expresiones de Notch y ligandos Notch se incrementaron significativamente en las células PC3 PDGF-D. GAPDH se utilizó para el control de la carga de proteínas. (N: células PC3 Neo, E: células PC3 PDGF-D, p10: paso 10).
Se sabe que las proteínas del grupo Polycomb de estar involucrados en la regulación de la represión de genes a través de modificaciones de la cromatina, que es esencial para el mantenimiento de las células madre embrionarias y adultas [32], [33]. Polycomb represivas complejo 2 (PRC2) contiene subunidades y funciones SUZ12, EZH2, EED y PACC en las células madre embrionarias y adultas para reprimir los genes de desarrollo que se activan preferentemente durante la diferenciación. Por otra parte, otros estudios han demostrado que PRC2 genes diana son co-ocupado por reguladores de células madre, tales como Oct4, Sox2 y Nanog [34]. Durante el análisis de los datos de nuestros datos de microarrays, se encontró que los niveles de EZH2 y el ARNm Suz12a se incrementaron en células PC3 PDGF-D en comparación con las células PC3 Neo (Tabla S2), los cuales fueron confirmados por el tiempo real de RT-PCR (Fig. 3C). Además, los niveles de proteína de EZH2 fue significativamente hasta reguladas en las células PC3 PDGF-D respecto a las células PC3 neo (Fig. 3D) y estos resultados sugieren claramente que las características de tipo EMT de células PC3 PDGF-D son consistentes con la firmas de células madre o células madre como el cáncer.
señalización Notch se ha demostrado que desempeñan un papel importante en la capacidad de pluripotencia y auto-renovación de las dos células madre embrionarias y adultas [35], [36]. Los resultados de nuestros datos de microarrays mostraron que los niveles de mRNA de Notch, ligandos Notch, delta-como, Jagged así como Notch objetivos de abajo como Hes y Hey fueron significativamente mayores en las células PC3 PDGF-D en comparación con células PC3 Neo (Tabla S2) . en tiempo real RT-PCR mostró aumento de 2 a 350 veces en los niveles de mRNA de Notch de señalización genes (Fig. 3E), que se confirmó adicionalmente mediante análisis de transferencia Western como se muestra en la Fig. 3F. Del mismo modo, también encontramos una mayor significativamente nivel de expresión de Notch1 en ARCAP
células M en comparación con ARCAP
células E (Fig. 1B, panel derecho).
miR-200b y MIR-200c expresión ligada firmas de células madre del cáncer con EMT fenotipo
en nuestros estudios anteriores, hemos encontrado significativa baja regulación de miR-200 en células PC3 familia de PDGF-D con EMT fenotipo [28], que fue consistente con nuestros datos de microarrays miARN (Tabla S3). Para revelar si las expresiones de miR-200 de la familia están asociados con las firmas de células madre, las células PC3 PDGF-D se transfectaron con miR-200a, miR-200b y MIR-200c. Encontramos que la transfección de miR-200b y MIR-200c inversión inducida de la EMT de fenotipo MET (Fig. 4A). Más importante aún, re-expresión de miR-200b y miR-200c inhibió significativamente la capacidad de formación de prostasphere-de las células PC3 PDGF-D (Fig. 4B). Por otra parte, el tamaño de prostaspheres también se redujo en las células PDGF-D PC3 transfectadas con miR-200b y miR-200c en comparación con la transfección con el control de los genes miARN (Fig. S2A y S2B). Sin embargo, la transfección de células PC3 PDGF-D con miR-200a no tuvo efecto sobre la capacidad de formación prostasphere, pero aumentó el tamaño de prostaspheres comparación con el control (Fig. 4B, la Fig. S2A y la Fig. S2B). Estos resultados sugieren que el miR-200b y MIR-200c pero no miR-200a inhibieron la auto-renovación de las células PC3 PDGF-D mediante el control de la expresión de genes diana de miR-200b y MIR-200c. Por lo tanto, se evaluó la expresión de los supuestos objetivos de miR-200b y MIR-200c como Notch 1, Bmi1 y lin28B en las células de PDGF-D PC3 transfectadas con la familia miR-200 debido a miR-200b y MIR-200c tienen tres o uno putativa sitios en el 3'UTR de Lin28B, Bmi1 mRNA (Fig. S3) y el ARNm Notch1 de unión. La transfección miR-200b y miR-200c reducido drásticamente la expresión de Notch1 y lin28B, pero no tuvo efecto sobre la expresión de Bmi1 (Fig. 4C). Se encontró que la expresión de ZEB1 que las reguladas por la expresión forzada de miR-200b y MIR-200c (Fig. 4C), que era consistente con la reversión de la EMT fenotipo (Figura 4A). También se encontró que la expresión de miR-200c fue reprimida en ARCAP
células M en comparación con ARCAP
células E (Fig. 4D). Por otra parte, re-expresión de miR-200c en ARCAP
células M por transfección con precursores de pre-miR-200C reduce notablemente la capacidad de formación de prostasphere-en comparación con la transfección con genes miARN de control (Fig. 4E). Estos resultados fueron consistentes con la baja regulación de la expresión de Notch1 y reversión de la EMT fenotipo que se caracteriza por un aumento de la expresión de E-cadherina y disminución de la expresión de ZEB1 así como cambiar la morfología celular en ARCAP
M células transfectadas con pre-miR-200c precursores (Fig. 4F y la Fig. 4G).
células PC3 PDGF-D se transfectaron con pre-miR-200. 3 días después de la transfección, las células se dividieron y se transfectaron repetidamente con pre-miR-200, cada 3-4 días durante 14 días. se muestran (A) Las fotografías de las células: la transfección de células PC3 PDGF-D con pre-miR-200 durante 14 días, el miR-200b y MIR-200c invierten células EMT a la morfología celular MET. se recogieron (B) Las células para la generación de prostaspheres después de la transfección de 14 días con pre-miR-200. MiR-200b y MIR-200c redujeron el número de prostaspheres. (C) Transferencia Western que muestra que Notch1, Lin28B y expresiones ZEB1 se redujeron regulado en las células de PDGF-D PC3 transfectadas con miR-200b y MIR-200c. (D) El nivel de miR-200c disminuyó significativamente en ARCAP
M usando el tiempo real de RT-PCR. (E) La transfección de pre-miR-200c después de 6 días redujo la capacidad de formación de prostasphere en ARCAP
células M (Bar: 100 micras). (F) Western blot mostró que la re-expresión de miR-200c mediante transfección de pre-miR-200c aumentó la expresión de E-cadherina y reprime la expresión de ZEB1 y Notch1 en ARCAP
células M, que en consonancia con el cambio de mesenquimales a la morfología de las células epiteliales (G). *, P & lt; 0,05 en comparación con el control; **, P & lt; 0,01 en comparación con el control. (Con: control, 200a: pre-miR-200a, 200b: pre-miR-200b, 200c: pre-miR-200c, E-cad: E-cadherina) guía empresas
El descenso de regulación. de Notch1 por el miR-200 fue parcialmente responsable de la inhibición de la capacidad y la formación de colonogenic prostasphere de células PC3 PDGF-D
el miR-200b y MIR-200c tiene una sitios de unión en el 3'UTR de Notch1 (Fig. 5A). Para determinar si Notch1 es el objetivo directo de miR-200b y MIR-200c, se analizó la actividad de la 3 'UTR de Notch1 en PC3 Neo y células PC3 PDGF-D transfectadas con Notch 1 3'UTR del plásmido de luciferasa, así como PC3 PDGF -D células co-transfectadas con Notch 1 3'UTR del plásmido de luciferasa y miR-200b o miR-200c. Se encontró que la actividad de Notch 1 3'UTR de luciferasa fue significativamente mayor en las células PC3 PDGF-D en comparación con las células PC3 Neo debido a los niveles más bajos de miR-200b y MIR-200c en células PC3 PDGF-D. Por otra parte, re-expresión de miR-200b o miR-200c redujo drásticamente la actividad de Notch 1 3'UTR de luciferasa en células PC3 PDGF-D, mientras que re-expresión de miR-200a con una base secuencia de semillas diferentes de miR-200b y miR-200c no tuvo efectos sobre la actividad de la 3'UTR de Notch1 de luciferasa (Fig. 5B). Estos resultados sugieren que el miR-200b y miR-200c regulan la expresión Notch1 mediante la unión a 3'UTR de ARNm Notch1. Para determinar si Notch1 desempeñó un papel importante en el mantenimiento de las células madre, se trataron las células PC3 PDGF-D con DAPT, un inhibidor de la γ-secretasa que inhibe la activación de Notch. de longitud completa Notch1 es por lo general muy baja debido a su escisión por muchas enzimas en estas células; Sin embargo, se encontró que la expresión de Notch1 de longitud completa era un poco más en las células tratadas γ-secretasa. También se encontró que DAPT reduce significativamente la capacidad clonogénico de las células PC3 PDGF-D (Fig. 5C, panel superior), que era consistente con los datos de transferencia de Western que muestran que el tratamiento DAPT inhibida forma activa de Notch1 (Fig. 5C, panel inferior). Por otra parte, la transfección de siRNA Notch1 reprimido drásticamente la capacidad de formación de prostasphere de células PC3 PDGF-D (Fig. 5D y 5E), que era consistente con la baja regulación de la expresión de la proteína Notch 1 (Fig. 5F). Estos resultados sugieren que el miR-200 mediada baja regulación de Notch 1 fue parcialmente responsable de la capacidad de auto-renovación y crecimiento de las células colonogenic EMT-como que tienen características de células madre.
(A) Conservado, predijo sitios de unión para el secuencias de semillas de miR-200b y MIR-200c en el 3'UTR del ARNm Notch1. (B) miR-200b y MIR-200c inhibieron la actividad de la luciferasa Notch1 3'UTR. **, P & lt; 0,01 en comparación con células de control Neo; #, P & lt; 0,01 en comparación con células de control PDGF-D. (C) DAPT tratamiento, un inhibidor de la γ-secretasa, reduce la capacidad clonogénico en células PC3 PDGF-D (panel superior) .Western Blot que muestra que el tratamiento reduce DAPT forma activa de Notch1 en forma dependiente de la dosis (panel inferior). (D) y (E) que muestra que la transfección de Notch1 siRNA después de 9 días reprimidos la capacidad de formación de prostasphere-en células de PDGF-D PC3 (Bar: 100 micras), que es consistente con la regulación a la baja de la expresión de Notch1 (F). **, P & lt; 0,01 en comparación con el control. (Neo: células PC3 Neo, PDGF-D: células PC3 PDGF-D, contra: de control, 200a: pre-miR-200a, 200b: pre-miR-200b, 200c: pre-miR-200c)
lin28B inhibieron la producción de let-7, la regulación de la auto-renovación mediante el control de la expresión de Sox2, Oct4 y Nanog
Nuestros resultados presentados anteriormente mostraron que el miR-200b y MIR-200c inhibieron la expresión lin28B (Fig. 4C), que se sabe que se unen a primaria pre-let-7 ARN let-7 y e inhibe la acumulación de maduro let-7 miARN [19]. Los resultados de nuestros datos de microarrays miARN mostraron que todos los miembros de la familia let-7 se redujeron significativamente en células PC3 PDGF-D (Tabla S3). Estos resultados fueron confirmados por el tiempo real el ensayo de RT-PCR (Fig. 6A). Knock-down de Lin28B de siRNA se incrementó fuertemente madurar expresiones let-7 (figura 6B.); lo que sugiere lin28B madura regulada let-7 en células PC3 expresión de PDGF-D. Es bien sabido que la familia let-7 juega un papel crítico en la regulación de auto-renovación de las células madre embrionarias y células madre similares a cáncer de mama [18], [37]. Para determinar si let-7 podrían controlar la autorrenovación de las células PC3 PDGF-D, se realizó el ensayo de formación de esferas. Re-expresión de los seleccionados let-7 de la familia como let-7a, let-7b, let-7d o combinación de let-7a, let-7b y let-7d capacidad de formación prostasphere-marcadamente inhibida (Fig. 6C y 6D) y reducido simultáneamente el tamaño de prostaspheres (Fig. 6C, S4A y S4B). Desde Lin28B inhibe la acumulación de maduro let-7 mediante la unión a pre-let-7 ARN y bloqueando de este modo el procesamiento de pre-let-7 ARN, PC3 células PDGF-D con alto nivel de Lin28B fueron co-transfectadas con pre-let- 7 y Lin28B siRNA. Encontramos que los números de prostasphere a partir de células co-transfectadas con pre-let-7 y Lin28B siRNA eran menos que la de la transfección con pre-let-7 solo (Fig 6D.); Sin embargo, a excepción de let-7d, no hubo diferencia en el tamaño entre prostasphere pre-let-7 solo y co-transfección con pre-let-7 y Lin28B siRNA (Fig. 6C, S4A y S4B). Estos resultados fueron consistentes con los datos de análisis de transferencia de Western que muestra que la re-expresión de la expresión de Sox2 y Nanog inhibió significativamente let-7 en células PC3 PDGF-D por transfección de pre-let-7a, pre-let-7b o co- transfección de pre-let-7a, pre-let-7b o pre-let-7d con Lin28B siRNA. La transfección de pre-let-7d solo fue capaz de inhibir la expresión de Oct4 y Lin28B pero tuvo efectos marginales sobre Sox2 y Nanog expresión (Fig. 6E).
(A) los niveles de let-7 en la familia células PC3 y PC3 Neo PDGF-D se determinaron mediante el uso de tiempo real RT-PCR. (B) en tiempo real RT-PCR se utilizó para cuantificar la expresión de let-7 en células de PDGF-D PC3 transfectadas con siRNA Lin28B durante 3 días. (C) Las microfotografías que muestran prostaspheres generadas a partir de células PC3 PDGF-D transfectadas con pre-let-7 o la combinación de pre-let-7 y Lin28B siRNA de 14 días después de la transfección (barra: 100 micras). (D) Las células se recogieron por prostasphere-ensayo de formación después de 14 días de la transfección. Let-7a, 7b let-, let-7d y la combinación de let-7a, 7b let-, let-7d, así como co-transfección con let-7 y Lin28B siRNA redujo el número de prostaspheres. (E) Los resultados de transferencia Western mostraron que la expresión de Lin28B, Sox2, Nanog, y Oct4 en células de PDGF-D PC3 transfectadas con pre-let-7 o co-transfectadas con pre-let-7 y Lin28B siRNA después de 9-día transfección. *, P & lt; 0,05 en comparación con el control; **, P & lt; 0,01 en comparación con el control. (Con: control, una: pre-let-7a, abd: combinación de pre-let-7a, pre-let-7a, pre-let-7d, col: combinación de pre-let-7a y Lin28B siRNA, Lin28B- SI: Lin28B siRNA, Neo: células PC3 Neo, PDGF-D:. células PC3 PDGF-D) guía empresas
Sox2, Nanog, Oct4 y Lin28B se requerían para la auto-renovación de las células PC3 PDGF-D
Hemos demostrado que la familia let-7 regulada auto-renovación y inhibido Sox2, Nanog, Oct4 y expresión en células PC3 Lin28B PDGF-D con EMT fenotipo. Con el fin de evaluar la relación mecanicista de estas moléculas (Sox2, Nanog, Oct4 y Lin28B) con la capacidad de auto-renovación de las células PC3 PDGF-D, derribaron la expresión de Sox2, Nanog, Oct4 y Lin28B de siRNA transfección usando Sox2 , Nanog, Oct4 y Lin28B siRNA. Se encontró que el knock-down de Sox2, Nanog, Oct4 y Lin28B reprimida de manera significativa la capacidad de formación prostasphere-(Fig. 7A). Además, las células de PDGF-D PC3 transfectadas con Sox2, Nanog, Oct4 y Lin28B siRNA mostraron un aumento significativo de los números de prostaspheres de tamaño más pequeño (30 a 50 micras) en comparación con la concomitante transfectadas con ARNsi de control con una disminución de los números de prostaspheres con & gt; 50 micras de diámetro (Fig. 7B). Estos resultados fueron consistentes con los resultados de expresión de proteínas como se muestra en la Fig. 7C, lo que sugiere que Sox2, Nanog, Oct4 y Lin28B se requieren para la auto-renovación de las células PC3 PDGF-D.
(A) suspensiones de células individuales de PC3 PDGF-D transfectadas con Sox2, Nanog, Oct4 y Lin28B siRNA y se incubaron durante 24 h se sembraron en pocillos de adherentes ultra bajas de placa de 6 pocillos a 2000 células /pocillo. Después de 3 días, el número de prostaspheres se contaron bajo el microscopio. (DO).