Extracto
Antecedentes
Las células madre del cáncer (CSC) afirma que la hipótesis sólo un pequeño subconjunto de células dentro de un tumor es capaz tanto de la iniciación del tumor y el mantenimiento. El epitelio-mesenquimal transición (EMT) es un programa de desarrollo embrionario que a menudo se activa durante la invasión del cáncer y la metástasis. El objetivo de este estudio es arrojar luz sobre la relación entre la EMT y células madre cancerosas mediante el uso de cáncer de pulmón LC31 línea celular primaria.
Materiales y Métodos
líneas celulares A549 y LC31 se trataron con 2 ng /ml TGF-1 durante 30 días, y 80 días, respectivamente. Para evaluar la EMT, los cambios morfológicos fueron evaluados mediante microscopía óptica, inmunofluorescencia y citometría para el seguimiento de los marcadores: citoqueratinas, E-cadherina, CD326 (marcadores epiteliales) y CD90 y vimentina (marcadores mesenquimales). Por otra parte, RT-PCR para Slug, se realizaron Twist and genes beta-catenina. En TGF-1 líneas celulares LC31 tratados y no tratados, se realizó las pruebas stemness tales como el crecimiento pneumospheres y el vástago de marcadores de expresión tales como Oct4, Nanog, Sox2, c-kit y CD133. Western Blot para CD133 y los ensayos de carcinogénesis realizados utilizando ratones NOD /SCID se realizaron los ratones.
Resultados
TGF-1 línea celular tratada LC31 perdió su morfología epitelial asumiendo una apariencia similar a fibroblastos. Se obtuvieron los mismos resultados para la línea celular A549 (como control). Inmunofluorescencia y citometría mostraron sobre regulación de vimentina y CD90 y la baja regulación de cytocheratin, e-cadherina y CD326 en TGF-1 líneas celulares LC31 y A549 tratadas. Slug, Twist and transcripciones de ARN m-β-catenina fueron reguladas en TGF-1 línea celular LC31 tratado de confirmar la EMT. Esta línea celular mostró también la sobre expresión de Oct4, Nanog, Sox2 y CD133, todos los genes de troncalidad. Además, en TGF-1 línea celular LC31 tratada, un aumento de la capacidad de formación de pneumosphere-y tumores conformación de capacidad en los ratones NOD /SCID eran detectables.
Conclusiones
La inducción de EMT por TGF -1 exposición, en primarios de pulmón resultados línea celular de cáncer en la adquisición de perfil mesenquimal y en la expresión de marcadores de células madre
Visto:. Pirozzi G, Tirino V, Camerlingo R, R Franco, la Rocca a, Liguori E, et al. (2011) epitelial a mesenquimal transición por TGF-1 inducción Aumenta Características troncalidad en la línea de células pequeñas no primaria de la célula del cáncer de pulmón. PLoS ONE 6 (6): e21548. doi: 10.1371 /journal.pone.0021548
Editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos de América
Recibido: 5 de Abril, 2011; Aceptado: 1 de junio de 2011; Publicado: 30 de junio 2011
Derechos de Autor © 2011 Pirozzi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Investigaciones actuales 2009/10 del Ministerio de Sanidad italiano de G. y G. Pirozzi Rocco. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Dos hipótesis se han postulado importante en la génesis, la formación, el crecimiento y la metástasis del cáncer epitelial: el papel de las células madre del cáncer (CSC) o células tumorales de Iniciación (TIC) y la participación de la llamada epitelial Transición -Mesenchymal (EMT).
cáncer de células madre se han definido como "una célula dentro de un tumor que poseen la capacidad de auto-renovación y para hacer que los linajes de células cancerosas heterogéneos que componen el tumor" [1 ]. Estas dos propiedades biológicas definitivos son los que hacen la CSCs el principal candidato para la iniciación de la recaída.
Los CCC hipótesis afirma que sólo un pequeño subconjunto de células dentro de un tumor es capaz tanto de la iniciación del tumor y el mantenimiento [2], [ ,,,0],3]. Estas células expresan marcadores stemness, son capaces de formar esferas flotantes en medio libre de suero, de una propiedad asociada con células madre, y también son capaces de diferenciarse en una heterogeneidad tumor fenotipo de células que constituye aberrante [4]. Experimentalmente, esta población se identifica por su capacidad para formar nuevos tumores a través de trasplantes de serie en inmunodeficientes diabético no obeso (NOD) /ratones inmunodeficientes graves combinados (SCID), el restablecimiento de la heterogeneidad tumoral [5].
Hay son dos temas básicos que subyacen a la hipótesis de que los CAC se originan a partir de células madre de tejido normales. En primer lugar, las células madre cancerosas tienen propiedades de células madre normales, tales como la auto-renovación, la diferenciación, la resistencia a los medicamentos y la capacidad de migración. Entonces, la longevidad de las células madre hacen susceptibles a la acumulación de daños genéticos y epigenéticos a fin de que ellos buenos candidatos para la aparición de la transformación neoplásica [6], [7]. Las células madre cancerosas son las únicas células que son capaces de generar tumores similares a los modelos originales de los pacientes cuando se trasplantan en ratones inmunocomprometidos, tales como ratones NOD /SCID [8].
Las terapias existentes han mejorado la duración de la supervivencia después del diagnóstico de cáncer, pero fracasó por completo en términos de recuperación. fracasos tratamiento del cáncer pueden deberse a efectos ineficientes de la terapia actual sobre células madre cancerosas potencialmente inactivas, que siguen siendo vital y retienen la capacidad de regenerar el tumor [9]. En la mayoría de casos, las estrategias terapéuticas actuales se desarrollan para apuntar a la mayor parte de cáncer y es probable que no erradican CSC completamente. Los CCC son más resistentes a las terapias, debido a la ventaja de supervivencia con el aumento de las actividades anti-apoptóticos y resistencia a los medicamentos debido al aumento de los niveles de bombas de eflujo de drogas tales como BCRP (proteína de resistencia al cáncer de mama) y complejos de MDR (resistencia a múltiples fármacos) [10], [11].
Las células madre cancerosas se han identificado en una variedad de tumores sólidos incluyendo glioblastomas [12], de mama [13], y el cáncer de pulmón [14], [15]. Hay tres principales metodologías distintas para aislar células madre cancerosas de los tumores sólidos: i) el aislamiento de células madre cancerosas mediante citometría de flujo de acuerdo con CSC-específicos marcadores de superficie celular tales como CD44 o CD133; ii) la detección de lado fenotipo de la población por la exclusión Hoechst33342; iii) la formación de esferas bajo el cultivo de medio libre de suero definido con factores de crecimiento que mantiene la CSC indiferenciada.
El epitelio-mesenquimal transición (EMT) es un programa de desarrollo embrionario clave que a menudo se activa durante la invasión del cáncer y la metástasis [16], [17]. Es un proceso por el cual las células se someten a un interruptor morfológica del fenotipo epitelial polarizada al fenotipo fibroblastoide mesenquimales. Como resultado de la EMT, las células epiteliales pierden sus contactos célula-célula /célula-sustrato definidas y su polaridad estructural /funcional, y se convierten en forma de huso y morfológicamente similares a fibroblastos activados [18]. A nivel molecular, EMT se define por la pérdida de moléculas de adhesión célula-célula (por ejemplo, E-cadherina y ZO-1), la regulación por disminución de marcadores de diferenciación epiteliales incluyendo citoqueratinas y E-cadherina y la inducción transcripcional de marcadores mesenquimales tales como vimentina, fibronectina y N-cadherina con una localización nuclear de beta-catenina [19]. Nuclear beta-catenina induce un patrón de expresión génica que favorece la invasión tumoral, y la creciente evidencia indica múltiples interacciones recíprocas de E-cadherina y beta-catenina con EMT-inductores de represores transcripcionales para estabilizar un fenotipo invasivo mesenquimales de las células tumorales epiteliales [20], [21 ]. Otros genes implicados en la EMT son Caracol, torsión e SIP-1 /ZEB-2, todos los represores del gen CDH1 que codifica para la E-cadherina [16]. Varios rasgos distintivos han sido transmitida por EMT, incluyendo la motilidad celular, invasividad, la resistencia a la apoptosis, y algunas propiedades de células madre. Muchas rutas de señalización que han contribuido a la inducción de la EMT, incluyendo factor de crecimiento transformante beta (TGF-1), Wnt, erizo, Notch, y el factor nuclear kappa B (NF-kB) [22]. Kyoung-Ok Hong et al. [23] han demostrado que la activación del eje PI3K /Akt es uno de los mecanismos clave en el proceso de la EMT y parece que su inhibición por el tratamiento con análogos de éter fosfatidilinositol lípidos (PIA) podrá regular el proceso inverso epitelio mesenquimales transición inversa (Mert ) que conduce a la re-expresión de ambos e-cadherina y β-catenina, y la reducción de la expresión de vimentina, marcador mesenquimal, en líneas escamosas de carcinoma oral estabilizada. Durante el proceso de la metástasis tumoral, que a menudo está habilitado de técnicos sanitarios, las células cancerosas diseminadas parecen requerir capacidad de auto-renovación, similar a la exhibida por las células madre, con el fin de difundir metástasis macroscópicas [24]. Esto plantea la posibilidad de que el proceso de EMT, que permite la difusión de células de cáncer, también puede impartir una capacidad de auto-renovación a la difusión de las células cancerosas. De hecho, el proceso metastásico es de al menos superficialmente similar a los procesos que se producen durante la reparación y regeneración de tejidos y permiten a las células madre adultas para salir de los embalses de tejidos como la médula ósea, entrar y sobrevivir en la circulación, y se meten en sitios tisulares secundarias, en donde que proliferan, se diferencian, y participa en la reconstrucción del tejido [25]. En conjunto, estas diversas líneas de evidencia sugieren una posible relación entre las células madre cancerosas y las células mesenquimales de apariencia generados por los técnicos sanitarios y el proceso inverso denominado transición inversa epitelio mesenquimales (Mert). Mani et et al [26] fueron los primeros en demostrar tal correlación en las células epiteliales mamarias humanas inmortalizadas (HMLEs).
En este contexto, es importante identificar los factores que podrían inducir la EMT y cómo las células EMT podrían convertirse un recurso para las células madre, como el cáncer, la novela y el desarrollo de terapias dirigidas contra el cáncer de pulmón. Por lo tanto, el objetivo de este estudio es arrojar luz sobre la posible relación entre la EMT y células madre cancerosas mediante el uso de la línea celular primaria LC31 obtenidas de una muestra de tejido después de la cirugía en los pacientes afectados por la no microcítico de pulmón (NSCLC).
resultados
TGF-1 tratamiento induce cambios morfológicos en líneas celulares de cáncer
con el fin de investigar el efecto de TGF-1 en líneas celulares A549 y LC31, los tratamos con 2 ng /ml de TGF-1. Como ya se ha demostrado también por Ju Hee Kim [27], las células A549 tratadas con TGF-1 perdieron su morfología epitelial observable después de 48 horas de tratamiento; fueron dispersados y asumieron una apariencia similar a fibroblastos con la forma anhelada y el núcleo central.
LC31 células tratadas con TGF-1 perdieron su morfología epitelial y los rasgos adquiridos mesenquimales a partir de 21 días de tratamiento. Las células se hicieron anhelaban, semejantes a fibroblastos con núcleo central y comenzaron a crecer como paquetes. Esta morfología se mantuvo durante todo el tiempo del tratamiento (Figura 1A-D.)
A:. A549 sin tratar, OM 200 ×; B: A549 tratada, a los 2 días TGF-1 tratamiento, OM 400 ×; C: LC31 no se trata, OM 400 ×; D: LC31 tratados, a los 30 días TGF-1 tratamiento, OM 400 ×; E: curvas de crecimiento de A549 sin tratar y tratada; F:. Curvas de crecimiento de LC31 no tratado y tratado
TGF-1 tratamiento induce una inhibición del crecimiento en líneas celulares de cáncer
En todas las líneas celulares ensayadas, la inhibición del crecimiento TGF-1 inducida. En el A549, curvas de crecimiento análisis mostraron una fuerte inhibición del crecimiento durante el tiempo de cultivo con DT 28 h por el respeto A549 tratada a DT 18 h de la línea celular sin tratar correspondiente. En las células LC31, el DT fue de 72 h para las células tratadas, mientras que DT fue de 36 h para las células no tratadas (Fig. 1E-F).
TGF-1 tratamiento promueve un cambio de fenotipo epitelial a mesenquimal
El efecto morfológico de TGF-1 en la A549 y líneas celulares LC31 sugiere que TGF-1 promovió un EMT. Los cambios morfológicos característicos de las células sometidas a EMT se acompaña de un cambio en la expresión de un epitelial a un repertorio mesenquimales. Para determinar si TGF-1 inducida cambio de este tipo, se utilizó citometría de inmunofluorescencia y RT-PCR para examinar la expresión y distribución de CD90, CD326, vimentina, E-cadherina y cytockeratins marcadores y β-catenina, Slug y los genes de la torcedura.
de acuerdo con el análisis de citometría, en líneas de células no tratadas, CD90 se expresa débilmente en el A549 (porcentaje medio del 10%) y LC31 (porcentaje medio del 4%). CD326 y citoqueratinas niveles de expresión fueron bajos tanto en el A549 (porcentaje medio del 10% y 1,1% respectivamente) y LC31 (porcentaje medio 1% y 18,6%, respectivamente). Vimentina fue débilmente positiva en el A549 (porcentaje medio del 22%) y LC31 (porcentaje medio del 17%). Después del tratamiento TGF-1, CD90 (porcentaje medio del 93%) y vimentina (porcentaje medio del 91%) se incrementaron los niveles, mientras que CD326 y citoqueratinas disminuyeron en A549 y LC31 (Figura 2A, B).
A:. Citométricos El análisis de CD90, CD326, vimentina y citoqueratina en tratar (línea roja) y TGF-1 tratados [verde línea] en la línea celular A549 después de 20 días de tratamiento; B: Análisis de citometría de CD90, CD326, vimentina y citoqueratina en tratar [línea roja] y TGF-1 tratadas (línea verde) en la línea celular LC31 después de 30 días de tratamiento. controles de isotipo están en negro.
En el ensayo de inmunofluorescencia, en las líneas de células no tratadas, se expresó la vimentina tanto en A549 y LC31 pero estaba contenido en vescicles perinuclear. Citoqueratinas y E-cadherina se expresaron débilmente en ambas líneas celulares. Después de TGF-1 tratamiento, la vimentina era fuerte y uniformemente distribuida en todas las células A549 y LC31, mientras que las citoqueratinas y E-cadherina permanecieron expresan y se localizan en áreas perinuclear de las células débilmente hasta que debe suprimirse después de 30 días para el A549 y 40 días para los LC31 (figura 3 a-L.)
La inmunofluorescencia para vimentina (a), citoqueratina (B) y e-cadherina (C) en la línea celular A549 no tratada.; vimentina (D), citoqueratina (E) y E-cadherina (F) en el tratado en la línea celular A549 después de 20 días de tratamiento TGF-1; vimentina (G), citoqueratina (H) y E-cadherina (I) en la línea celular LC31 sin tratar; vimentina (J), citoqueratina (K) y E-cadherina (L) en el tratado en la línea celular LC31 después de 30 días de tratamiento TGF-1. Todas las imágenes de inmunofluorescencia tienen OM 200 ×; M: RT-PCR análisis y evaluación de la densitometría Slug, Twist and β-catenina en no tratados y tratados TGF-1 en la línea celular LC31 después de 0, 20, 50 y 80 días de tratamiento. *, P & lt; 0,001, **, p. & Lt; 0,0001 en comparación con la línea celular parental (0 día de tratamiento) guía empresas
Los datos de RT-PCR mostraron que no hubo cambio masivo de la expresión génica de un patrón característico de las células epiteliales a la de las células mesenquimales en la línea celular LC31 con un aumento considerable en la expresión de EMT-inducen factores de transcripción, en concreto beta-catenina (~1,5 veces), Twist (~1,5 veces), y Slug (~2,7 veces) lo que indica su fenotipo EMT. Sobre regulación de estos genes mencionados anteriormente fue dependiente del tiempo TGF-1 a excepción de beta-catenina para los que hubo un aumento en 20 y 80 días de tratamiento respecto a la línea de células sin tratar y una disminución débil a 50 días respetar 20 y 80 días de tratamiento, pero siempre un mayor respeto a la línea de células sin tratar (Fig. 3 M).
perfiles de expresión génica de marcadores stemness en la línea celular de EMT-LC31
para investigar los genes de la regulación y el mantenimiento del fenotipo de células madre LC31 de las células que tienen las firmas de EMT (línea celular EMT-LC31 denominado), se realizó RT-PCR para Oct4, Sox2 y Nanog. Curiosamente, los factores de transcripción Oct4, Nanog, Sox2, conocido por ser suficiente para reprogramar ratón o las células somáticas humanas a las células madre indiferenciadas, pluripotentes, se encontraron para ser aumentado de manera significativa en la línea celular EMT-LC31 con un aumento de 3,5 veces, 3 , 0 veces y 1,4 veces para Oct4, Nanog Sox-2, respectivamente, mayor que la línea celular de sus padres indicando su fenotipo stemness (Fig. 4A)
a:. RT-PCR y la evaluación de la densitometría Oct4 , Sox2 y Nanog genes en líneas celulares de LC31 y LC31-EMT después de 0, 20, 50 y 80 días de tratamiento; B: RT-PCR y evaluación densitometría para CD133 y c-kit de genes en líneas celulares de LC31 y LC31-EMT después de 0, 20, 50 y 80 días de tratamiento; C: western blot para CD133 LC31 y líneas de células EMT-LC31 después de 0, 20, 50 y 80 días de tratamiento. *, P & lt; 0,001, **, p & lt; 0,0001 en comparación con la línea celular LC31 (0 días de tratamiento). α-tubulina se utilizó como control de carga.
marcadores CD133 y c-kit se incrementaron en la línea celular de EMT-LC31
A fin de determinar si las células con fenotipo EMT podrían mostrar madre de cáncer como características de las células, se evalúa la expresión de CD133, marcador principal en la identificación de las células madre del cáncer en NSCLC [14], [15] y c-kit [28], marcador madre mesenquimales.
Citometría análisis mostraron que en LC31 línea celular parental, el porcentaje de CD133 era 3% de la población total de células. Después del tratamiento TGF-1, los resultados mostraron que no hubo diferencias en los niveles de expresión CD133 entre células EMT parentales y fueron detectables (datos no mostrados). Este resultado es diferente respecto a los obtenidos por RT-PCR y Western blot para CD133. Tanto RT-PCR y Western Blot mostró un aumento de CD133 (~2,3 veces para RT-PCR) después de diferentes tiempos de tratamiento TGF-1. En cuanto gen c-kit, este último resultó hasta regulado en las células EMT-LC31 con un aumento de ~2,3 veces mayor que la línea celular parental (Fig. 4B, C).
se aumentó la capacidad de formación de Pneumospheres en EMT-LC31 línea celular
Liu et al. [29] y otros [30] han demostrado que la capacidad para formar mammospheres
in vitro
depende de la presencia de auto-renovación. Pusimos a prueba la capacidad de formación de las células pneumophere-EMT-LC31 en comparación con la línea celular de sus padres.
Es significativo que después se le indujo un EMT en células LC31 al exponerlos a TGF-β1, se encontró que las células EMT-LC31 mostraron significativamente aumento de la capacidad de formar pneumopheres en comparación con la línea celular de sus padres que forma al menos & gt; 40 veces más pneumospheres que las células parentales. La relación de tamaño pneumospheres y su crecimiento fue significativamente mayor que los de las células no tratadas. Por otra parte, los pneumospheres EMT fueron más de 50 m de diámetro después de 5 días, mientras que los padres eran pneumospheres 20 (5A Fig., B) micras. Además, todos los pneumospheres EMT fueron positivos para CD133 (Fig. 5C). Con base en este ensayo funcional, llegamos a la conclusión de que las células generadas por un EMT adquirieron otro atributo de las células madre del cáncer de pulmón
A:. Pneumospheres LC31; pneumospheres EMT-LC31; C:. La expresión de CD133 en pneumospheres EMT-LC31
analiza la eficiencia colonia
Uno de los métodos de análisis del potencial tumorigénico es el ensayo de agar blando que mide el crecimiento independiente de anclaje, el cual es un indicador de la transformación celular. Como se describe en la Tabla 1, la evaluación de la cinética de crecimiento reveló mayor eficacia colonia de línea celular EMT-LC31 en comparación con la línea celular de sus padres con 18 y 3 veces mayor de 1.000 y 10.000, respectivamente, de las células EMT cabezas de serie respecto a la línea celular parental (Fig. 6A-C)
A:. fotografías de colonias a partir de la línea celular LC31 y [B] línea celular EMT-LC31; C:. El número de colonias fue contado y los datos se presentaron como UFC (%) respecto al número de células sembradas
EMT-LC31 genera tumores mayores que corresponde línea celular parental
en nuestros estudios anteriores [15], que mostró que los tumores de células cultivadas como LC31 pneumopsheres crecieron mucho más rápido en comparación con la de células correspondientes cultivadas en condiciones de cultivo adherente. Con el fin de probar si TGF-1 tratamiento tuvo éxito en la alteración de la frecuencia de iniciación de tumor de las células transformadas, inyectamos células EMT-LC31 y línea celular correspondiente en huéspedes inmunodeficientes. Como se informó en la Tabla S1, se encontró que el volumen del tumor inducida por células EMT-LC31 fue significativamente mayor que la de las células parentales (Fig. S1). Estos resultados sugieren que las células con EMT firma promovidos tumorigenicidad
in vivo
.
Discusión
transición epitelial a mesenquimal (EMT) es un proceso fisiológico fundamental por las células epiteliales pierden su polaridad y se someten a una transición a un fenotipo mesenquimal. Los sellos de EMT incluyen la pérdida de adhesión célula-célula, la reorganización del citoesqueleto de actina y la adquisición de mayores características migratorias [31], [32].
EMT es un evento crucial en la progresión tumoral y varios estudios Estado que la EMT se activa en muchos tipos de cáncer [33] - [35]. A pesar de los progresos recientes, se necesitan más estudios para aclarar el papel de la EMT en la invasión y la metástasis de tumores. Durante el proceso de la metástasis tumoral, las células cancerosas, que hacen metástasis, adquirir habilidades de auto-renovación, similar a la exhibida por las células madre con el fin de difundir las metástasis [24]
.
En conjunto, estas evidencias sugieren una posible vínculo entre las células madre cancerosas y las células mesenquimales de apariencia generados por los técnicos sanitarios
.
en este contexto, el objetivo de este estudio es demostrar que la adquisición de EMT se asocia con un aumento de las firmas stemness en una línea celular primaria obtenida en nuestro laboratorio. cáncer de pulmón A549 es una línea celular bien caracterizada que se ha utilizado como un sistema modelo para estudiar los mecanismos de la carcinogénesis, la apoptosis y la progresión del cáncer en el cáncer de pulmón [36], [37]. Debido a que la EMT tiene un papel clave en la progresión tumoral, se optó por la línea celular A549 como sistema modelo de la EMT. Nos centramos nuestra atención en la línea celular LC31 obtenido en nuestro laboratorio e investigamos el efecto de TGF-1 en la EMT y el mecanismo de troncalidad en esta línea. De acuerdo con los informes anteriores [38], [39], hemos demostrado que TGF-1 induce la EMT en células A549 por la adquisición de la morfología mesenquimal, aumento de la expresión de marcadores mesenquimales como la vimentina y CD90 y la disminución de la expresión de marcadores epiteliales, tales como citoqueratinas y CD326. Una vez definido que nuestro modelo de estudio EMT es utilizable, hemos probado el efecto de TGF-1 en la línea celular LC31. Se han tratado línea celular LC31 con TGF-1 2 ng /ml durante 80 días. Sólo después de aproximadamente 20 días, observamos cambios morfológicos que son consistentes con la adquisición de EMT fenotipo que se caracteriza por la pérdida de la expresión de marcadores epiteliales, tales como citoqueratinas, e-cadherina y CD326 y la ganancia o aumento de la expresión de marcadores mesenquimales como la vimentina la sustitución de citoqueratinas. Después de 20 días de tratamiento, las células se hicieron LC31 alargadas, núcleo central con fibroblastos como la forma y el aumento de la reorganización de fibras de estrés.
EMT tarda 48 horas en el A549, ya que tiene más fuerte expresión de marcadores mesenquimales LC31 necesitan 20 días para someterse a EMT .
por lo tanto, la línea celular LC31 muestra varias características típicas de la EMT: reducción en la adhesión célula-célula, aplanamiento y la dispersión, la expresión de marcadores mesenquimales. Slug, Twist and β-catenina, principales factores de transcripción implicados en la EMT, están regulados en las células tratadas y estos factores incrementan con el aumento de TGF-1 tiempo de tratamiento, lo que confirma su fenotipo EMT.
Estos resultados abren la manera de verificar si LC31 línea celular de cáncer de pulmón primario, sensibles al tratamiento con TGF-1, podría aumentar las características de células madre. Curiosamente, las células EMT-LC31 también muestran fenotipo de células madre similares que se caracteriza por una mayor capacidad de formación de pneumosphere-en comparación con la línea celular parental LC31 con EMT pneumospheres mayor que pneumopheres parentales. Por otra parte pneumospheres EMT fueron positivos para CD133 marcador de reforzar la firma stemness. Lo más importante, es bien sabido que la co-expresión de Sox-2, Nanog y Oct4 en las células somáticas humanas o de ratón puede reprogramar estas células en células madre embrionarias pluripotentes-como [40], [41]. En nuestro estudio, encontramos que las expresiones de Sox-2, Nanog y Oct4 fueron dramáticamente hasta reguladas en la línea celular de EMT-LC31 en comparación con la línea celular de sus padres. Tomados en conjunto estos datos, la línea celular LC31 con EMT firma mostró un incremento de las características de células madre similares asociados con la sobreexpresión de Sox-2, Nanog y Oct4.
Estudios recientes han demostrado que el c-kit y su ligando se expresan en cáncer de pulmón. estudios inmunohistológicos sobre la expresión de c-kit mostraron que la proteína se expresa de forma aberrante sólo en las células de cáncer de pulmón y no en los neumocitos o normales células epiteliales bronquiales [42]. Además, Levina et al. [43], [44] han demostrado que el tratamiento de células tumorales de pulmón con doxorrubicina, cisplatino o etopósido resultó en la selección de células supervivientes de drogas que expresan CD133, CD117, SSEA-3, TRA1-81, Oct-4 y nuclear beta-catenina con baja expresión de los marcadores de diferenciación citoqueratinas 8/18. En nuestro estudio, hemos demostrado que el TGF-1 induce también un aumento de la expresión de ARNm de c-kit, otro marcador stemness, lo que refuerza la hipótesis de que la línea celular LC31 con EMT firma mostró un incremento del fenotipo tallo. Otro resultado interesante es la regulación de CD133 en la línea celular de EMT-LC31, principal marcador para la identificación de células madre cancerosas en el cáncer de pulmón según lo informado por Eramo et al. [14] y Tirino et al. [15]. En nuestro estudio, se observó un incremento de CD133 tanto en RT-PCR y Western blot, pero no en citometría e inmunofluorescencia en células adherentes. Hay muchas obras en las que las dudas acerca de las limitaciones en el uso de anticuerpos se discuten [45]. Los anticuerpos utilizados más comúnmente reconocen AC133 y AC141 epítopos altamente glicosiladas [46]. Por lo tanto, su uso conlleva el riesgo de formas glicosiladas no subestimados del antígeno. Por otra parte, varios de empalme CD133 ARNm se han identificado, lo que a su vez dan lugar a productos de proteína no reconocibles por anticuerpos comunes; Finalmente, las limitaciones intrínsecas de inmunofluorescencia y citometría de metodologías, lo que implica sensibilidad anticuerpo, daño epítopo debido a la fijación de rutina /procedimientos de inclusión, la recuperación de antígeno, etapas enzimáticas de preparación de células se deben tener en cuenta [47]. En este contexto, también podemos plantear la hipótesis de que TGF-1 tratamiento da lugar a un cambio conformacional de los epítopos CD133 y su anticuerpo no es capaz de reconocer la molécula en los procedimientos de citometría de e inmunofluorescencia. En los pneumospheres, lo más probable, la estructura tridimensional permite la exposición de los epítopos reconocidos por los anticuerpos comunes. Además, no están sujetos a pasos enzimáticos que podrían dañar la estructura celular.
Aunque esta consideración, RT-PCR y Western blot confirman la misma la característica stemness de la línea celular EMT-LC31 después del tratamiento de TGF-1 con sobre regulación tanto CD133 proteína de m-ARN y CD133.
por último, para evaluar TGF-1 efecto sobre el potencial tumorigénico, se realizó la vez suave ensayo de agar y tumorigenicidad
in vivo
. TGF-1, en línea con las células madre de cáncer concepto, induce un aumento de la formación de colonias en experimentos de agar blando y el volumen de los tumores fue significativamente mayor que el de la línea celular LC31 sin tratar de confirmar que el fenotipo EMT no sólo promueve fenotipo stemness sino también la tumorigenicidad . En conclusión, las células con fenotipo EMT promovidos tumorigenicidad.
Por lo tanto, la alta probabilidad de que la EMT genera células con muchas de las propiedades de las células madre auto-renovación es verificada por una mayor expresión de Nanog, Oct4 y Sox2, determinantes factores de auto-renovación y CD133 y c-Kit, principales marcadores stemness de células madre cancerosas en el cáncer de pulmón.
en conclusión, nos informan de que la inducción de la EMT por el tratamiento TGF-1 en un pulmón primario resultados línea celular de cáncer en la adquisición de perfil mesenquimal y en la regulación de la expresión de marcadores de células madre.
Este estudio pone de relieve la posibilidad de abordar un enfoque farmacológico novedoso frente a las células EMT-fenotipo o células madre, como el cáncer de prevención de la progresión tumoral y la formación de metástasis.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
los protocolos experimentales se han evaluado y aprobado por la comisión ética sobre el uso de animales de Biogema. El proyecto experimental tiene el ID de autorización 10.08 y haber sido comunicado por de mayo de 26
ª de 2008 al Ministro de Sanidad italiano, siguiendo las leyes nacionales relativas a la protección del bienestar de los animales. El paciente, inscritos en este estudio, había firmado el consentimiento informado, aprobado por nuestro Comité Ético Interno (Instituto Nacional del Cáncer, Nápoles).
Cell Culture
línea celular A549 se adquirió de ATCC Banco de Células y se cultivó en RPMI1640 (Lonza, Milan, Italia) en 10% de suero bovino fetal (FBS) a 37 ° C, 5% de CO
2. línea celular LC31 se ha obtenido en nuestro laboratorio por un paciente afectado por cáncer de pulmón adenocarcinoma escamosas con el consentimiento informado por escrito, aprobado por nuestro Comité Ético Interno (Instituto Nacional del Cáncer, Nápoles) y se cultivó en IMDM (Lonza) en FBS al 10% [14] . Para los experimentos, las células fueron cultivadas a 90% de confluencia.
TGF-1 de tratamiento y curvas de crecimiento
Con el fin de inducir el proceso de EMT, A549 y células LC31 líneas fueron tratados con 2 ng /ml TGF -1 (Abcam, Milán, Italia) durante 30 y 80 días, respectivamente. TGF-1 se ha añadido dos veces a la semana en el medio. Para probar la inhibición del crecimiento posible debido al tratamiento TGF-1, 10.000 células se sembraron en placas de 24well para cada línea celular y TGF-1 en las células tratadas y no tratadas fueron separadas cada 24 horas durante 10 días. El número de células para cada condición experimental se contó y se representa en un gráfico lineal. Se determinó el tiempo de duplicación (DT) a partir de las curvas de crecimiento mediante el uso de la fórmula: en la que T y T
0 eran los tiempos en los que se contaron las células, y N y N
0 fueron el número de células en los tiempos t y t
0, respectivamente.
Pneumospheres ensayo
con el fin de evaluar el efecto de TGF-1 sobre el crecimiento y la formación de pneumospheres, la línea celular de LC31 se sembró a una densidad de 60.000 células por pocillo en placas de seis pocillos ultra-bajas de fijación (Corning Inc., Corning, Nueva York, EE.UU.) en medio de células BEBM, complementados con BEGM [SingleQuots preenvasados que contienen ácido retinoico, extracto de pituitaria bovina, insulina, hidrocortisona, transferrina, triiodotyronine, epinefrina, factor de crecimiento epidérmico humano, gentamicina y anfotericina B (todos de Lonza Group Ltd., Basilea, Suiza), además de EGF humano (10 ng /ml; Sigma, Milán, Italia) y bFGF humano (10 ng /ml; Sigma, Milán , Italia). Las células se incubaron en una atmósfera humidificada a 37 ° C con 5% de CO
2. alícuotas frescas de TGF-1, se añadieron EGF y bFGF dos veces a la semana. Después de 48-72 horas de cultivo, las esferas fueron visibles en invertida microscopio de contraste de fase.
Citometría de Flujo
Con el fin de evaluar el efecto de TGF-1 en ambas fenotipo stemness y diferenciación de las células A549 y LC31 líneas de células, 200.000 células fueron teñidas con los siguientes anticuerpos (2 mg /ml): ratón anti-humano CD90 FITC (Becton & amp; Dickinson, Buccinasco, Milán, Italia), marcador mesenquimal, ratón anti-humano CD133 PE ( Miltenyi Biotec, Calderara di Reno, Bolonia, Italia), de ratón anti-humano CD326 PerCP (EpCAM, Becton & amp; Dickinson), marcador epitelial, vimentina anti-humano de ratón (DAKO, Milán, Italia) y el ratón anti-citoqueratina (clon CK3 -6H5, Miltenyi Biotec). Los anticuerpos se incubaron durante 30 minutos a 4 ° C en la oscuridad. Después de la incubación, las muestras se lavaron con PBS y se analizaron por FACSAriaII (Becton Dickinson).