Extracto

La uroquinasa receptor del activador del plasminógeno (uPAR) se ha propuesto como un posible factor pronóstico de cáncer colorrectal (CRC) la supervivencia del paciente. Sin embargo, la expresión de uPAR CRC sigue siendo controvertido, especialmente en cuanto a tipos de células, donde se sobreexpresa uPAR (por ejemplo, el epitelio (uPAR
E) o células del estroma-asociado (uPAR
S)) y la relevancia de pronóstico relacionados. En este estudio, dos anticuerpos específicos de epítopo contra-uPAR monoclonales (MAb) podían discriminar la expresión de uPAR
E de uPAR
S y se utilizaron para examinar esta asociación con la supervivencia de las etapas B y cáncer rectal C (RC) pacientes. El uso de inmunohistoquímica, anticuerpos monoclonales#3937 y R4 se utilizaron para discriminar uPAR
E de uPAR
s, respectivamente, en las regiones central y frontales invasivos de la etapa B 170 y 179 especímenes estadio C de RC. Se utilizaron análisis de regresión de Kaplan-Meier y Cox para determinar la asociación con la supervivencia. uPAR expresión se produjo en ambos compartimentos epiteliales y del estroma con expresión diferencial observado en muchos casos, lo que indica uPAR
E y uPAR
S tienen diferentes funciones celulares. En las regiones central y frontales invasivos, uPAR
E se asoció negativamente con la supervivencia global etapa B (HR = 1,9; p = 0,014 y HR = 1,5; p = 0,031, respectivamente) que reproducen los resultados de estudios anteriores. uPAR
S en la parte delantera invasiva se asoció con una supervivencia más larga etapa C (HR = 0,6; p = 0,007), lo que refleja los estudios que demuestran que la acumulación de macrófagos peritumoral se asocia con una mayor supervivencia. Este estudio demuestra que diferentes epítopos de uPAR deben ser considerados como que se expresa en diferentes tipos de células durante la progresión tumoral y en diferentes etapas de RC. La comprensión de cómo uPAR
E y uPAR expresión
S afecta a la supervivencia se prevé que sea un marcador pronóstico clínico útil de las fases B y C RC

Visto:. Ahn SB, Chan C, Dent DE, Mohamedali A, Kwun SY, Clarke C, et al. (2015) epiteliales y células estromales uroquinasa plasminógeno activador del receptor de expresión diferencial se correlaciona con la supervivencia en el cáncer rectal etapas B y C Los pacientes. PLoS ONE 10 (2): e0117786. doi: 10.1371 /journal.pone.0117786

Editor Académico: Anthony W.I. Lo, Queen Mary Hospital, HONG KONG

Recibido: 15 Septiembre, 2014; Aceptado: 31 de diciembre de 2014; Publicado: 18 Febrero 2015

Derechos de Autor © 2015 Ahn et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel

financiación: Este estudio fue apoyado con subvenciones proyecto de investigación de la NHMRC (# 1010303), Cancer Council NSW (RG10-04 & amp; RG08-16), y una beca de la Universidad de Macquarie MQSN. ; y apoyado a través de la Escuela Australiana de Medicina Avanzada (ASAM), la Universidad de Macquarie, Concord repatriación del Hospital General de Diagnóstico de Patología, MQ Biofocus y Centros de Investigación Biomolecular Frontiers. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:. Este estudio recibió fondos del Consejo de Cáncer de Nueva Gales del Sur. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.

Introducción

Los datos recientes de la Organización Mundial de la Salud indica el cáncer colorrectal (CCR) es la tercera neoplasia más frecuente (~ 1,36 millones de casos en todo el mundo en el año 2012), con una mortalidad de más del 50% [1]. La principal causa de muerte relacionada con el cáncer es la metástasis. estadiaje clínico-patológicas del CCR demuestra una caída dramática en la supervivencia entre las etapas B y C, que corresponde a la ausencia en comparación con presencia de metástasis en los ganglios linfáticos [2]. A pesar de su importancia clínica, los mecanismos moleculares que sostienen la metástasis todavía no están completamente caracterizados y desarrollo de nuevas estrategias dirigidas a contrarrestar la metástasis siendo difícil de alcanzar.

La activación proteolítica de plasminógeno cascada es uno de una serie de procesos biológicos fundamentales implicados en el cáncer la invasión de células y la metástasis. Estos incluyen la degradación de la matriz extracelular (ECM) que permite el desprendimiento de las células tumorales del sitio original y la penetración de la membrana basal, la activación del factor de crecimiento y de señalización intracelular [3]. Una proteína de membrana anclada glicosilfosfatidilinositol se llama receptor del activador del plasminógeno uroquinasa (uPAR) es central en esta cascada. uPAR es una proteína tri-dominio (es decir, D1, 2 y 3) que forma un receptor de dedos gruesos como un guante proporcionando un bolsillo central para la unión de su ligando cognado proteasa, activador del plasminógeno uroquinasa (uPA) [4]. Los estudios iniciales se centraron en la regulación de la proteolisis (es decir, el plasminógeno y la activación de MMP), aunque uPAR. Más recientemente, se ha demostrado que hasta un 42 proteínas (9 extracelular y 33 socios que interactúan laterales) supuestamente interactúan con uPAR [5]. La forma de uPAR implica una superficie externa contralateral grande que se sugiere para facilitar la interacción /s con muchas de estas proteínas auxiliares [4]. Este gran repertorio de interacciones sugiere que uPAR ha evolucionado un complejo mecanismo de regulación para controlar la proteólisis, la migración celular, la proliferación, la señalización celular y otros aspectos del comportamiento celular. De hecho, en la última década, numerosas pruebas han demostrado uPAR está implicada en la adhesión celular, la proliferación, la migración, la remodelación de tejidos y en la regulación de las vías de señalización (por ejemplo, MAP quinasa, las vías de Ras) [3]. Estas son características importantes no sólo de las vías de desarrollo en todas partes, sino también la metástasis del cáncer

uPAR expresión en diversos tipos de cáncer se ha estudiado ampliamente en los últimos dos decenios, como se refleja en & gt;. 800 uPAR publicaciones relacionadas con la oncología [6 ]. Sin embargo, la expresión de uPAR en el microambiente del cáncer sigue siendo controvertida, en particular en relación con el tipo de célula /s en el que uPAR está sobreexpresado (por ejemplo, uPAR expresión en el epitelio (uPAR
E) o células del estroma-asociado (uPAR
S)) [6,7]. Asociación entre uPAR y cáncer fue reconocido por primera vez en 1991 [8]. Desde entonces, numerosos estudios han evaluado los niveles de uPAR
E y uPAR
S en varios tipos de cáncer utilizando una amplia gama de anticuerpos [6,7]. Sin embargo, ha habido resultados contradictorios. Específicamente en CRC, Pyke
et al
., Encontraron que uPAR se expresa fuertemente en los macrófagos, neutrófilos y eosinófilos (utilizando inmunohistoquímica (IHC)) infiltrantes de tumor, pero sólo débilmente a moderadamente expresado en las células tumorales neoplásicas (utilizando monoclonal anticuerpos (MAbs) contra clones uPAR humanos R2 y R4) [9]. Más adelante, otro estudio informó de que la expresión de uPAR se produjo principalmente en los epitelios tumorales en lugar de estroma (utilizando el MAb anti-uPAR#3937) [10]. A pesar de esta aparente contradicción, ambos estudios estuvieron de acuerdo uPAR fue altamente expresado en el microambiente del tumor y se concentró en el frente invasivo del tumor. Otros estudios sobre uPAR
E y uPAR
S en el CCR [6,7,11-17] de acuerdo en que uPAR alta
E es independiente y negativamente relacionado con la supervivencia de los pacientes [11,12,15]. Seetoo
et al
. [12] sugiere que uPAR (expresado principalmente en los epitelios) es un predictor independiente de la metástasis del hígado y la supervivencia del paciente resección general posterior CRC. De acuerdo, un estudio más reciente mostró significativamente elevados en los tumores uPAR CRC infiltrarse en los márgenes del tumor que se asoció con una peor supervivencia [15]. Sin embargo, los datos sobre uPAR
S en el CCR son contradictorios en cuanto a la asociación de supervivencia. Se ha sugerido que los macrófagos, que son una fuente importante de uPAR en el estroma, juegan un papel en la prevención de metástasis hematógena [16]. Además, se observó una asociación inversa entre CRC metástasis hepáticas y uPAR expresión del estroma del tumor primario [18]. Aunque no es correlacionar directamente uPAR
S con la supervivencia del paciente, es bien conocido que los pacientes con CCR con metástasis hepática tienen una supervivencia significativamente más cortos que los que no. Por el contrario, un informe reciente sugiere que tanto uPAR
E y uPAR
S se asoció negativamente con la supervivencia general de los pacientes de CRC, así como con la supervivencia libre de enfermedad (DFS) [17]. Sin embargo, sólo uPAR
S se asoció independientemente con DFS en el análisis multivariable. En conjunto, se propone que estas observaciones conflictivas se deben a la utilización de anticuerpos monoclonales particulares con diferente uPAR epítopo de especificidad cuando uPAR está involucrado en las interacciones de proteínas específicas de las células. De hecho, la mayoría de uPAR
E o uPAR
S estudios se realizaron con un solo MAb y por tanto sólo detectará específica uPAR dominio /s. Estudios anteriores han demostrado que uPAR puede estar presente en ya sea de longitud completa, formas dominio soluble y /o escindidos y estos puede ser que expresa diferencialmente epítopos identificados por MAbs específicos [19]. Además, algunos epítopos pueden estar enmascarados cuando uPAR interacciona con proteínas auxiliares. Por lo tanto, para examinar con precisión la importancia pronóstica de uPAR en el cáncer, la detección de anticuerpos monoclonales diferentes epítopos clave expresados ​​en tipos de células particulares deben ser aplicados a idénticas muestras de tejidos patológicos.

En este estudio, teniendo en cuenta las cuestiones relativas a la expresión de uPAR en diferentes tipos de células, que mide específicamente uPAR
e y uPAR
S a través de una cohorte (n = 349) de no metastásico (etapa B) y el cáncer rectal especímenes nodal metastásico (etapa C) (RC). Dos comercialmente disponible específico de epítopo anti-uPAR MAbs#3937 (por uPAR
E) y R4 (por uPAR
S) se utilizaron para sondear secciones en serie de microarrays de tejidos RC (TMA). Dentro de cada muestra, se midieron uPAR
E y uPAR
S en la región central, la parte delantera del tumor invasivo y la mucosa no neoplásico adyacente. El objetivo fue evaluar las asociaciones entre las mediciones uPAR y las características patológicas del tumor y la supervivencia global de los pacientes.

Materiales y Métodos

cohorte y el tumor del paciente caracterización

Los datos fueron extraídos a partir de un registro prospectivo de las resecciones de cáncer colorrectal consecutivas que se inició en 1971 en el hospital Concord, un hospital terciario de referencia pública en Sydney, Australia y contiene, operativa, patología, terapia adyuvante clínica detallada y la información de seguimiento [20,21]. Todas las resecciones fueron realizadas por cirujanos colorrectales especializadas utilizando una técnica estandarizada [22]. Se seleccionaron resecciones por cáncer de recto entre 1988 y 2001, ambos inclusive para el análisis y todos los pacientes fallecidos no fueron seguidos durante un mínimo de cinco años. Solamente los adenocarcinomas fueron incluidos en el registro. Cuando múltiples tumores estaban presentes, sólo se incluyó la lesión más en estadio avanzado. Los pacientes fueron excluidos si tenían cáncer colorrectal previo, enfermedad inflamatoria del intestino o poliposis adenomatosa coli. El recto se define como la unión rectosigmoidea incluyendo pero excluyendo el canal anal. Más del 90% de las muestras se examinaron de acuerdo con un protocolo estándar [2] por un solo patólogo (R.C. Newland) que también examinó el resto. El tamaño del tumor se midió como la mayor dimensión de la superficie y se tomaron bloques de demostrar máxima penetración tumoral directa de la pared intestinal. se tomaron bloques adicionales para demostrar la relación entre el tumor y cualquier estructura adherente o tejido, así como líneas de resección y la superficie serosa libre. invasión venosa, evaluada por hematoxilina y eosina, se registró como la participación de las venas gruesas o de paredes delgadas, ya sea dentro o fuera de la pared del intestino. Cuando la duda existía en cuanto a si una estructura implicada era una vena, se registró un resultado negativo. Un ganglio linfático apical se definió como el nodo más proximal se encuentra dentro de 1 cm de la ligadura de los vasos en el vértice de un pedículo vascular. Los tumores se clasifican como histológicamente malignidad baja, media-, o de alto grado. Grado se evaluarán teniendo en cuenta el grado de diferenciación y de la anaplasia, la naturaleza de los márgenes tumorales (empujar o infiltrante) y la presencia y la importancia de la invasión vascular. En estadios avanzados de la proporción de los ganglios linfáticos afectados se calcula como un porcentaje del número total de nodos cosechados. Antes del 2002 se registraron más de 90% de las muestras o revisado por un solo patólogo (R. C. Newland). Todos los rasgos patológicos analizados se buscaron en cada espécimen y su presencia o ausencia registrarse explícitamente. No había datos que faltan en ninguna variable. Los tumores se clasifican de acuerdo al sistema de clasificación por etapas de Australia clínico-patológicas (ACP) para el CCR [2]. Las cuatro etapas principales de este sistema (A, B, C, D) son directamente equivalentes a las etapas principales (I, II, III, IV) del sistema pTNM [23] pero, sobre todo, de ACPS se diferencia en que todas las lesiones con tumoral macro o microscópica en cualquier margen de resección se codifican como etapa de registro D. el CRC en el hospital Concord se lleva a cabo con la aprobación del Comité de Ética de la zona occidental del sur de Sydney Salud (CH62 /6/2011-136) con el consentimiento por escrito de conformidad con los requisitos de la Ley de NSW Tejido humano 1983 y la Declaración NHMRC Nacional de Conducta Ética en la Investigación humana 2007. el estudio también fue aprobado por el Comité de Ética Humanos de la Universidad de Macquarie (# 5201100858).

construcción TMA

embebido en parafina fijados con formalina TMA se construyeron usando un Advanced Tissue Arrayer ATA-100 (Chemicon, Temecula, CA, EE.UU.). De los bloques de parafina de tejido de cáncer de recto originales, se tomaron muestras (1,5 mm) de las áreas morfológicamente representativas seleccionadas de la región central del tumor (evitando superficies luminales), el frente invasivo del tumor y la mucosa histológicamente normal (1-2 cm desde el margen del tumor ) y dispuestos en bloques de parafina receptores recién hechos.

IHC

TMA secciones se prepararon y se procesan de forma simultánea con los mismos lotes de anticuerpos y reactivos, y la tinción se realizó en un solo laboratorio de patología clínica en una sola ejecución de todas las muestras. Dos específico de epítopo murino anti-humano uPAR anticuerpos monoclonales,#3937 (American Diagnostica Inc. (ADI), Greenwich, CT, EE.UU.) y R4 (Dako, Glostrup, Dinamarca), se utilizaron para la IHC. La tinción se realizó con un sistema de detección de IHC a base de polímero en un Bond-Max Autostainer (Leica Biosystems, Melbourne, Australia) como se describe [24] con algunas modificaciones. Para#3937 Mab tinción, sin recuperación de antígenos se realizó y se aplicó 3.33μg /ml de#3937 de TMA secciones. Para la tinción de MAb R4, se utilizó proteinasa K (Leica Microsystems) para la recuperación de antígeno, la concentración de R4 siendo 10μg /ml. Control negativo diapositivas fueron incubadas con isotipo IgG1 (R & amp; D Systems, Minneapolis, EE.UU.) utilizando los mismos métodos de recuperación de antígeno y concentraciones tal como se utiliza tanto para los anticuerpos primarios

Evaluación IHC

intensidades de tinción para. tanto anticuerpos monoclonales fueron evaluados de forma independiente por dos asesores (SBA, CC), que fueron cegados al estado clínico-patológicas de los pacientes. La puntuación se realizó por separado para la región central, frente tumor invasivo y mucosa no neoplásico adyacente: 0 = ninguno, 1 = débil, 2 = moderado y 3 = fuerte tinción. La tasa de concordancia entre los dos evaluadores de todo el grupo de muestras fue superior al 95% y cualquier desacuerdo /s se resolvieron por re-examen conjunto de los datos, la discusión y nueva revisión de las puntuaciones. Si la intensidad de la tinción fue heterogénea en ningún núcleo de tejido sencillo, se registró la intensidad de la tinción predominante.

variable de resultado y de pacientes
de seguimiento
Se midió el tiempo de supervivencia global a partir de la fecha de la resección quirúrgica hasta la fecha de muerte, con tiempos censurados de pacientes perdidos durante el seguimiento o que se mantuvo con vida al finalizar el estudio. Los pacientes fueron seguidos anualmente hasta la muerte o hasta el 31 de diciembre de 2011. El protocolo de seguimiento se ha descrito en otra parte [22].

Análisis estadístico

prueba exacta Chi-cuadrado prueba de χ² o de Fisher se utilizaron para examinar la significación estadística de las diferencias en las proporciones. El Test de Wilcoxon firmado prueba se utilizó para comparar las filas distribuciones de frecuencia de uPAR
E y uPAR
S entre el frontal y la región central del tumor invasivo. Las comparaciones de tiempo de supervivencia global entre los estratos de expresión y covariables uPAR se hicieron con el método de Kaplan-Meier y log-rank test y también de regresión de Cox y la prueba de Wald. covariables continuas y multi-categoría se dichotomised en los puntos de corte convencionales o de otro tipo adecuadas. A medida que la fase clínico-patológica es el predictor conocida más fuerte de pronóstico, las asociaciones con la supervivencia global fueron examinados para las etapas B y C por separado, así como para las etapas combinadas, con el fin de identificar cualquier diferencia en los efectos de uPAR
E y uPAR
S entre las etapas. El nivel de significación estadística de dos colas fue p = 0.05 con intervalos de confianza al 95%. Los análisis se realizaron con SPSS versión 20 (IBM Australia Limited)

Resultados

Entre enero de 1988 y diciembre de 2001 había 782 resecciones de cáncer de recto.; 206 para la etapa B y 251 para el tumor en estadio C. muestras de resección de 77 (31 de la etapa B y 46 de la etapa c) no dió suficiente o adecuado material de archivo para la construcción TMA. La fase restante 175 B y 205 especímenes etapa C producido resultados IHC informativa que variaba según el estadio, sitio y para uPAR
E, uPAR
S y uPAR
PT (peritumoral uPAR) expresión. Después de excluir a aquellos que no tienen IHC informativa, quedaban 170 pacientes con estadio B y 179 en estadio C de tumores para los cuales se dispone de datos sobre al menos uno de central o frontal uPAR
E, uPAR
S o uPAR
PT. Las características clínicas y patología de estos pacientes se muestran en la Tabla 1. Para las etapas B y C por separado y para las evaluaciones de uPAR por separado se compararon los pacientes que tuvieron un resultado TMA /IHC con los que carecen de un resultado en lo que se refiere a las variables en la Tabla 1 y se encontró sólo tres diferencias estadísticamente significativas (datos no mostrados), de la que llegó a la conclusión de que los pacientes con un resultado TMA /IHC los cuales se analizaron para este estudio no difirió significativamente de los pacientes excluidos que no tenían ningún resultado TMA /IHC. En las tablas siguientes el número de pacientes analizados varían según el número de los que tuvo que ser excluido debido a que faltan los resultados de IHC.

Detección y comparación de uPAR
E y uPAR
S de RC

el objetivo principal del presente estudio fue correlacionar uPAR
e y uPAR
S con la supervivencia de los pacientes en las etapas B y C RC. Para lograr esto, se determinó inicialmente la ubicación y los niveles de expresión de uPAR
E y uPAR
S RC en los tejidos utilizando dos epítopo específico anti-uPAR anticuerpos monoclonales#3937 y R4. Estos anticuerpos monoclonales fueron escogidos desde#3937 y#3936 (ambos de ADI) fueron los más comunes anticuerpos monoclonales disponibles comercialmente utilizados para uPAR
Detección E, y R4 & amp; R2 (de Dako y /o colaboradores en el Laboratorio Finsen) fueron más comúnmente utilizado para diferenciar uPAR
S [6,7,9,10]. MAb#3936 también se puso a prueba para detectar uPAR
E en nuestro estudio: sin embargo, no fuimos capaces de optimizar un método de recuperación de antígeno fiable para la detección coherente de uPAR
Utilización de este MAb. Específicamente MAb#3936 dio tinción de fondo alto o ninguna tinción dependiendo de los métodos de recuperación de antígeno utilizadas y, más importante, un control de isotipo (IgG2a) también tiñe débilmente la RC TMA (datos no mostrados). MAbs de control de isotipo para#3937 y R4 (es decir, IgG1) también fueron probados con métodos de recuperación de antígenos relevantes y no se observó unión no específica (datos no mostrados). R2 no se utilizó en este estudio.

IHC demostraron que MAb#3937 manchada principalmente los epitelios RC y se tiñeron algunas células del estroma asociadas débilmente. A la inversa, R4 se limita principalmente a células del estroma asociadas con RC muy débil tinción epitelial (Fig. 1). Es importante destacar que, en muchos casos los patrones de tinción diferencial de#3937 y no se observaron R4 utilizando secciones seriadas de la misma TMA, lo que indica que fueron expresados ​​diferencialmente uPAR
E y uPAR
S. Por ejemplo, en algunos casos, uPAR se sobreexpresa tanto en el epitelio y el estroma (Fig 1a & amp;. 1b), y en otros casos uPAR se expresó débilmente en el epitelio pero expresa fuertemente en el estroma (Fig 1c & amp;. 1d). También se observó lo contrario (es decir, alta uPAR
E con débil uPAR
S; Fig. 1e & amp; 1f). Para comparar la distribución entre uPAR
E y uPAR
S, se evaluaron los niveles de expresión basado en intensidad de la tinción (figura 2a y 2b. Amp;) tanto para el frente central e invasiva del tumor. En el tumor central, el 33% (89/268) núcleos de tejido tenía aproximadamente la misma expresión de uPAR
E y uPAR
S, el 48% (128/268) tenían una mayor expresión de uPAR
E y 19% (51/268) tenían una mayor expresión de uPAR
S. proporciones comparables se observaron en la parte delantera del tumor invasivo en el que el 31% (106/338) tenían similares uPAR
E y uPAR
expresión S, el 41% (137/338) tuvieron mayor uPAR
E y 28% ( 95/338) tenían mayor uPAR
S

Imágenes en filas (es decir, (a) & amp;. (b) o (c) & amp; (d) o (e) & amp; (f) ) son los mismos núcleos de tejido de secciones seriadas de los microarrays de tejidos. (A) & amp; (B) representan una fuerte expresión de ambos uPAR
E y uPAR
S. (C) & amp; (D) ejemplifican expresión parcial de uPAR
E y fuerte uPAR
S, respectivamente. A la inversa, (e) & amp; (F) muestran una fuerte uPAR
E y parcial uPAR
S, respectivamente

acentuación peritumoral de uPAR (es decir, uPAR
PT;. UPAR expresión en las células del estroma y asociados concentrada alrededor del epitelio tumor) representado en (c), se tiñeron con R4.

uPAR en los tejidos RC fue altamente expresado en la parte delantera tumor invasivo en comparación con la región central de los dos lugares epiteliales y del estroma, en consonancia con otros tipos de cáncer [6,7]. Un Test de Wilcoxon firmado filas pruebas mostraron que la intensidad de tinción de ambos uPAR
E y uPAR
S fue significativamente mayor en el frente invasivo en comparación con la ubicación central del tumor (uPAR
E, n = 255, p & lt; 0,001; uPAR
S, n = 257, p. & lt; 0,001)

seguimiento de los pacientes

En el cierre del estudio (diciembre de 2011), de los 363 pacientes que tenían una informativa resultado TMA /IHC en uPAR
e o uPAR
S, 243 habían fallecido, 111 habían sido seguidos por entre 103 y 246 meses (mediana de 171 meses) y 9 se había perdido durante el seguimiento después de una mediana de 56 meses. De los pacientes fallecidos, 117 murieron de CRC, 117 de otras causas y 9 por causas desconocidas.

uPAR
E y supervivencia en tumores en etapa B

Región Central. Para las etapas B y C combinadas, más fuerte uPAR
E tinción se asoció con una peor supervivencia (p = 0,004). Sin embargo, cuando se estratificó por etapa, esta asociación persistió fuertemente para la etapa B (p = 0,002), pero desapareció durante la etapa C (p = 0,589). Esto indica que la importancia pronóstica de uPAR
E se limita a los pacientes en estadio B. Por lo tanto, sólo la asociación entre uPAR
E y la supervivencia de los pacientes en etapa B se analizó adicionalmente. Como se observó ninguna diferencia significativa en la supervivencia entre los débiles y moderadas categorías de tinción, estos se combinan para formar una sola categoría "intermedia". La supervivencia fue significativamente peor en el grupo intermedio que en el grupo negativo (p = 0,035), pero no significativamente diferente entre los grupos intermedios y fuertes (p = 0,206). Por lo tanto, este último se combinaron en un único grupo uPAR positivo
E. El análisis de Kaplan Meier mostró que los pacientes del uPAR
E positiva del grupo presentan una supervivencia global significativamente más pobre que aquellos en el grupo de uPAR negativo
E (figura 3a;. p = 0,006). El análisis multivariado demostró que uPAR
E en el tumor central era un indicador de mal pronóstico independiente de la supervivencia global en pacientes en estadio B RC después de ajustar por otras variables de pronóstico (HR 1,9 [IC del 95% 1.1 a 3.1] Wald-p 0,014) ( la Tabla 2)

en los pacientes de fase B, (a):. supervivencia global se redujo significativamente con uPAR
e positivo en la región central del tumor (n = 125) y (b): con un fuerte uPAR
E frente invasivo de tumores (n = 168). En los pacientes en etapa C, (c): fuerte uPAR
S frente invasivo del tumor (n = 179) se asoció significativamente con la supervivencia global más larga. (D): Positivo uPAR
PT frente invasivo del tumor (n = 179) también se asoció significativamente con la supervivencia global más larga

delante invasiva.. Para las etapas B y C combinadas, no hubo una asociación significativa entre uPAR
E y la supervivencia global (p = 0,179). Los pacientes con tumores en estadio C tenían ninguna asociación (p = 0,848), pero el
p-valor
acercó a la significación en la fase B (p = 0,087). En caso de que el último resultado era una función del número de muestras pequeñas en algunas categorías, los datos fueron examinados mediante la combinación de tinción negativa, débil y moderada, como su asociación con la supervivencia global no fue significativamente diferente (p = 0,294). análisis de Kaplan Meier de uPAR
expresión E en el grupo combinado mostró que los pacientes con una fuerte expresión de uPAR
E tenía una supervivencia significativamente más pobre (p = 0,017) (Fig. 3b). Esto persistió después de un análisis multivariable de ajustar por otras variables de pronóstico (HR [IC 95% 1,1-2,3] 1.5 Wald-p 0,031) (tabla 2).

uPAR
S en el frente invasivo y la supervivencia en la etapa tumores C

Evaluación de la expresión de uPAR en las células del estroma asociadas RC emplean dos enfoques diferentes. En primer lugar, la intensidad global de la tinción del estroma se puntuó como 0, 1, 2 y 3 (Fig. 2b), de la misma manera como uPAR
E. En segundo lugar, la presencia de acentuación peritumoral (uPAR
PT; expresión en el estroma sino que se concentran alrededor de las células tumorales uPAR) se comparó con su ausencia (figura 2c.)

Región Central.. La supervivencia global no fue significativamente relacionados con uPAR
S, ya sea para las etapas B y C combinadas (p = 0,492), la fase B sola (p = 0,071) o de la etapa C sola (p = 0,436). La presencia o ausencia de uPAR
PT en el centro del tumor no mostraron asociación significativa con la supervivencia del paciente.

delante invasiva. uPAR
S no se asoció significativamente con la supervivencia global para las etapas combinadas B y C (p = 0,226) o de la etapa B sola (p = 0,641). Sin embargo, dentro de la etapa C, hubo una tendencia general hacia el aumento de la supervivencia como uPAR
S expresión progresó de negativo a fuerte (p = 0,015). No hubo significación supervivencia entre negativo y moderada, mientras que no hubo una diferencia significativa entre moderada y fuerte (p = 0,031). Por lo tanto negativas a la tinción moderada se combinaron en una sola categoría y se comparó con una fuerte expresión. Fuerte uPAR
S expresión se asoció significativamente con la supervivencia global (figura 3c;. P = 0,009). Después del ajuste para otras variables de pronóstico esta diferencia persistió (HR [95% CI 0,4 a 0,9] 0,6 Wald-p = 0,007) (Tabla 3). Por otra parte el grupo C paciente escenario con uPAR
PT presente en el frente invasivo de tejidos tumorales también mostró un mayor tiempo de supervivencia en comparación con los pacientes sin uPAR
PT (figura 3d;. P = 0,017) en los análisis multivariables (HR 0,7 [95% CI 0,5-0,9] Wald-p 0,016) (Tabla 3).

uPAR en los tejidos de las mucosas no neoplásicas adyacentes

en los epitelios uPAR expresión en la no adyacentes tejidos mucosos -neoplastic (n = 312), 36 casos demostrado una fuerte expresión de uPAR (19 en la fase B y 17 en la etapa C), 58 casos tenían una expresión moderada (28 en la fase B y 30 en la etapa C), 81 casos tuvieron la debilidad de expresión (41 en la fase B y 40 en la etapa C) y 137 casos fueron negativos (68 en la etapa B y 69 en la etapa C). En la etapa B, no hubo asociación entre la intensidad de la tinción y la supervivencia (p = 0,700), mientras que en la etapa C, no hubo diferencias en la supervivencia entre negativa, débil e intermedio. La única asociación significativa fue la supervivencia más larga para un fuerte que para los negativos (p = 0,018), pero, como esto se basó en sólo 17 casos con una fuerte tinción, al parecer anómala y puede ser un error de tipo 1 derivado de este pequeño número. uPAR expresión en el estroma era casi ausente, con la expresión negativa en 320 casos (156 en la fase B y 164 en la etapa C) y sólo una expresión moderada en 9 casos (6 en la fase B y 3 en la etapa c), la insuficiencia de las muestras de expresión uPAR estaban disponibles para un análisis estadístico completo.

Discusión

a pesar de la importancia pronóstica de uPAR en el cáncer se ha estudiado ampliamente, discrepancias significativas han hecho que gran parte del trabajo concluyentes. Dos cuestiones importantes siguen sin resolverse: en primer lugar, la discrepancia con respecto a los tipos de células, donde se sobreexpresa uPAR (es decir, uPAR
E o uPAR
S), y en segundo lugar, la importancia pronóstica de uPAR en diferentes tipos de células y diferentes etapas de la progresión del tumor. En este estudio hemos abordado la primera paradoja por lo que demuestra que la expresión de uPAR en diferentes tipos de células puede detectarse utilizando dos epítopo específico anti-humano uPAR MAbs#3937 y R4. Estos anticuerpos delineados entre uPAR
E y la expresión de uPAR
S en los tejidos de RC, que muestra la expresión de antígeno podrían ser detectados diferencialmente en diferentes tipos de células y localizaciones tumorales en los mismos tejidos RC. Tras el examen de uPAR
E y uPAR
S de 349 fase B o tejidos C RC, hemos sido capaces de descifrar la segunda controversia, revelando que la elevación de uPAR
E, tanto en la región central y frontal tumor invasivo adversamente correlacionada con la supervivencia global etapa B, mientras elevada uPAR
S en el frente invasivo favorablemente correlaciona con la supervivencia global estadio C.

el reconocimiento de epítopos diferentes uPAR por diferentes anticuerpos es un factor importante a tener en cuenta, no sólo para la detección de diferentes tipos de células, sino también para la determinación del potencial relevancia pronóstica clínico de uPAR. Existen múltiples anticuerpos anti-uPAR policlonales (Pabs) y MAbs que se han desarrollado y estudiado ampliamente en aplicaciones clínicas [6]. De éstos, los MAb#3937 (como#3936) y R4 (como R2) se utilizan con mayor frecuencia para uPAR
E y uPAR
S, respectivamente, y la detección de pie en el centro de los resultados dispares obtenidos por diferentes laboratorios. Varios factores pueden explicar la especificidad de estos anticuerpos diferentes, el principal es la unión a diferentes epítopos "disponibles" que refleja potencialmente diversas funciones de uPAR en cada tipo de célula. Como uPAR tiene 42 socios que interactúan conocidos [5], también es posible que los epítopos de anticuerpos pueden ser enmascarados por otros socios que interactúan uPAR en diferentes tipos de células. La naturaleza multifuncional de uPAR es una función de su interactoma [3,5], y por lo tanto uPAR detectado por diferentes MAbs específicos de epítopo pueden tener diferentes socios que interactúan, que puede reflejar funciones divergentes en tipos de células discretas. Este concepto está apoyado por el hecho de que la población de uPAR soluble (suPAR) en tipos de células específicas ha mostrado patrones de tinción diametralmente alterados que reflejan diferencias funcionales como resultado de variaciones estructurales [25].